KR101815692B1 - 구강 세균의 군집을 이용한 대사성 질환 진단용 바이오 마커 - Google Patents

구강 세균의 군집을 이용한 대사성 질환 진단용 바이오 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사성 질환의 위험성을 예측하거나 진단할 수 있는 마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 검체 시료로부터 네이세리아 속 균주, 그란눌리아카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주를 검출함으로써, 대사성 질환의 위험성의 예측 또는 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

Description

구강 세균의 군집을 이용한 대사성 질환 진단용 바이오 마커{The human oral microbiota in diagnosis of metabolic syndrome}
본 발명은 구강 미생물 (oral microbiome)을 활용하여 대사성 질환의 위험도 예측 또는 진단을 위한 바이오마커 및 이를 이용한 대사성 질환의 위험도 를 비침습적으로 예측 또는 진단하는 용도에 관한 것이다.
비만이란 불필요한 과다지방이 축적된 상태를 의미하며, 심혈관계 질환, 당뇨, 관절염, 고지혈증을 아우르는 폭넓은 합병증을 가지고 있다. 이들은 서구식 식단변화와 운동부족으로 인한 환경적 요인과 유전적 요인이 복합적인 원인으로 작용하여 발병하게 되는데 특히 이러한 질병의 위험인자를 동시다발적으로 가지고 있는 경우를 대사증후군이라 한다. 대사증후군 환자를 정의하는 기준은 복부비만, 고중성지방혈증, 낮은 HDL 콜레스테롤혈증, 고혈압, 혈당 장애로써 이 중 3가지 이상의 증상를 가지고 있을 때 대사증후군 환자라 정의된다. 대사증후군의 모든 요소는 인슐린 저항성과 관련이 있으며 따라서 인슐린 저항성이 비만과 더불어 대사성증후군의 가장 설득력 있는 원인으로 지목되고 있다.
대사증후군을 정의하기 위해 사용되는 기준은 기관마다 수치와 내용을 달리하므로 사용된 기준에 따라 유병률과 위험도가 바뀌게 된다. 예를 들어, 세계보건기구 (WHO)와 유럽인슐린저항성연구회(EGIR)는 인슐린 저항성에 주로 초점을 맞춘 기준을 정의를 하고 있으나, 국가 콜레스테롤 교육프로그램 (NCEP ATP III)의 경우 복부비만에 기준을 맞춰 실용적이지만 인슐린 저항성을 잘 반영하지 못한다. 기준치의 근거가 모호한 진단 기준은 대사증후군 환자를 정의하는 시점부터 문제가 되지만 대사증후군 특이적 치료방법을 구축하는데도 어려움을 야기시킨다. 따라서 기존의 불완전한 진단 기준을 발전시키고 모든 기준을 아우르는 새로운 진단 방법의 필요성이 제기되고 있다.
차세대 염기서열 분석방법을 이용하는 미생물 분석을 통해 비배양성을 포함한 모든 미생물총의 분석으로 미생물의 종을 알아낼 수 있다. 이는 모든 박테리아에 공통적으로 존재하는 보존영역인 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA)과 초가변영역 (hypervariable region)을 이용하여 미생물의 종을 알아내는 방법으로써 미생물 유전체의 다양성과 질환과의 연관성을 규명하는 연구가 시행되고 있다. 이러한 미생물 분석은 기존의 박테리아와 질병과의 연관성을 배양가능성이라는 제한점에서 해방시켜 전체적인 관점에서 재조명시켰다는데 큰 발전을 가져왔으며 특히 장내 미생물과 비만의 역학관계를 입증시키기도 하였다.
본 발명은 네이세리아(Neisseria)속 균주, 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 이용하여 비침습적 방법으로 대사성 질환의 위험도를 예측하거나 진단하기 위한 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 또는 이를 포함하는 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 대사성 질환의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피시험자의 시료로부터 네이세리아(Neisseria)속 균주, 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 검출하는 방법 또는 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 대사성 질환 치료제 후보물질을 처리한 후 네이세리아(Neisseria)속 균주, 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물 군집의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 대사성 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
이에 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, 건강한 한국인 쌍둥이를 대상으로 하여 미생물과 대사성 질환의 임상 의학적 지표들의 관련성을 규명하였으며, 이를 토대로 대사성 질환의 발생 및 위험도 등을 조기에 진단하는 기술을 개발하였다.
본 발명의 일 예는 네이세리아(Neisseria) 속 균주, 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대사성 질환 위험도의 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 대사성 질환을 겪는 환자의 구강 내 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주의 군집이 특이적으로 증가하고, 펩토코커스의 군집이 특이적으로 감소함을 규명하고, 이에 기초하여, 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물을 대사성 질환의 위험도 예측 또는 진단하기 위한 바이오 마커로 제공함을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 인간의 유전적, 생리적 요인이 구강 미생물 군집에 미치는 영향을 배제하고 구강 미생물 군집과 대사성 질환과의 관계를 알아보기 위해 쌍둥이를 대상으로 연구를 진행하였고, 그 결과 대사성 질환 환자군에서 네이세리아 속 균주 및 그란눌리카텔라 속 균주의 군집이 특이적으로 높게 검출되고, 펩토코커스 속 균주의 군집이 특이적으로 낮게 검출되는 것을 확인하였다(실시예 5 및 6).
네이세리아(Neisseria)속 균주는 점막에 존재하는 그람 음성 (Gram-negative) 균으로 예를 들어, 네이세리아 메닝지티디스 (N. meningitides)와 네이세리아 고노리아 (N. ronorrhoeae)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
그란눌리카텔라 (Granulicatella) 속 균주는 초기에 nutritionally variant streptococcus (NVS)로 분류되었으며, 주로 호흡기, 위 장내, 생식기에 서식하며 임상적 연관성으로는 심내막염을 일으키는 것으로 보고되고 있다. 본 발의 그란눌리카텔라 속 균주는 예를 들어, 그란눌리카텔라 아디아센스 (G. adiacens)를 포함할 수 있으며, 그란눌리카텔라 아디아센스는 다른 구강균보다 강한 감염력을 가지는데 해당 균의 강한 부착력이 하나의 요인으로 알려져 있다.
펩토코커스 (Peptococcus)속 균주는 그람 양성 (Gram-positive)의 구형 (coccoid)균으로 주로 구강, 대장, 호흡기 등의 점막에서 상재하는 것을 특징으로 한다.
상기 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주는 구강 내 미생물이며, 이에 따라 본 발명의 조성물은 구강 내에서 채취된 시료에 적용되는 것을 특징으로 한 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단용 마커, 또는 진단 마커"란 대사성 질환에 걸린 상태와 걸리지 않은 상태를 구분하는 기준이 되는 물질로, 정상 시료에 비하여 대사성 질환을 가진 시료에서 증가 또는 감소를 보이는 각종 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 진단 마커는, 대사성 질환을 가진 환자의 시료에서 특이적으로 높거나 낮은 수준의 발현을 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주 미생물 또는 군집을 말한다.
종래 대사성 질환의 위험성을 예측하거나 진단하는 방법은 기관마다 수치와 내용을 달리할 뿐 아니라 인슐린 저항성 또는 복부 비만 등 특정 증상을 지표로하여 위험성 예측 또는 진단이 이루어져, 대사성 질환의 전체 특성을 반영하지 못하는 등 진단 기준이 불완전하다는 문제점이 있었으나, 본원발명은 특정 증상에 한정되지 않고도 예측 또는 진단할 수 있다는 장점이 있다.
바람직하게는, 상기 검출할 수 있는 제제는 시료 내에서 대사성 질환의 진단 마커인 네이세리아, 그란눌리아카텔라 및/또는 펩토코커스의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, 네이세리아, 그란눌리아카텔라 및/또는 펩토코커스에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.
본 발명에서 미생물 검출 제제는, 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay),방사면역확산법(radioimmunodiffusion),오우크 테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머이고, "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는 본 발명에서 사용되는 프라이머는 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다. 바람직하게는 상기 프라이머는 하기 표 1의 프라이머일 수 있다.
박테리아 구분 서열 서열번호
펩토코커스 정방향 5'-GGTGCCGCAGTAAACACAATAAGT-3' 1
역방향 5'-AAGGCCCGGGAACGTATTCA-3' 2
그란눌리카텔라 정방향 5'-CAAGCTTCTGCTGATGGATGGA-3' 3
역방향 5'-CTCAGGTCGGCTATGCATCAC-3' 4
네이세리아 정방향 5'-CTGGCGCGGTATGGTCGGTT-3' 5
역방향 5'-GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAG-3' 6
상기 16s rRNA 는, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분상당히 보존되어 있는 한편 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.
상기 대사성 질환은 비만, 고혈압, 당뇨, 인슐린 내성 증후군, 고지혈증, 암, 심혈관질환, 염증성 장질환, 아토피, 알러지 질환 또는 대사 증후군일 수 있다. 바람직하게는 상기 대사성 질환은 고혈압일 수 있다.
상기 위험도 예측이란 피시험자가 대사성 질환을 발병할 가능성이 있는지를 판별하는 것을 말하고, 대사성 질환의 발병 위험성이 높은 피시험자자를 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상, 진단은 대사성 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예로서, 본 발명의 상기 미생물 검출 제제를 포함하는 조성물은, 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단용 키트 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 해당 미생물들을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및/또는 항체의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
상기 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관한 사항은 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단용 키트에 적용될 수 있다.
구체적인 일례로, 본 발명에서 해당 미생물에 특이적인 프라이머를 포함하는 키트는, PCR 및 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함하는 키트 일 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 구강 내에서 채취된 시료에 적용되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 상기 키트는 비침습적 방법으로 대사성 질환의 위험도 예측 또는 진단을 할 수 있으다
상기 키트는 피시험자의 구강 내 시료 채취를 위한 흡수성 패드, 면봉, 스포이드, 스푼, 스왑 및 이쑤시개로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 구강 시료 채취용 포집 기구를 추가로 포함할 수 있으나, 구강 내 시료를 포집할 수 있는 것이라면 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 키트는 대사성 질환의 위험도 예측 또는 진단을 위하여 피시험자의 시료를 구강 내에서 채취하라는 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명은 대사성 질환의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피시험자의 시료로부터 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관한 사항은 상기 미생물 검출 방법에 적용될 수 있다.
바람직하게는 상기 방법은 (a) 피시험자의 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 게놈 DNA에 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응물을 증폭시키는 단계를 포함하는 방법을 포함하여 구현될 수 있다.
상기 단계 (a) 에서, "피시험자의 시료"란, 대사성 질환 환자 또는 대사성 질환이 예상되는 사람의 몸에서 채취 된 것으로, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 예를 들어 피시험자의 구강, 바람직하게는 구강 내 상피세포, 구강 내 혈액, 구강 내 타액, 구강 내 치석, 구강 내 혈장, 및 이를 포함하는 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1이상에서 채취된 조직 시료일 수 있다.
종래 대사성 질환 진단에 사용되는 방법은 침습적인 혈액 채취와 공복조건의 혈당 측정으로 인한 부가적인 스트레스를 야기하는 문제점이 있었으나 본 발명은 비침습성 방법, 특히 구강 내 시료 채취 방법에 의해 채취된 시료를 사용할 수 있어 피시험자의 스트레스를 줄일 수 있다.
상기 단계 (b) 에서 피시험자의 시료로부터 게놈 DNA의 추출은 당업계에 알려진 일반적인 기술을 적용하여 수행할 수 있으며, 상기 단계 (c)에서 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주에 특이적인 프라이머는 상기 설명한 바와 같다.
상기 단계 (d)에서 반응물을 증폭시키는 방법은 당업계에 알려진 일반적인 증폭 기술들, 예를 들어 중합효소 연쇄반응, SYBR 실시간 PCR, 역전사-중합효소 연쇄반응, 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 벡토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
상기 단계 (c)에서, 반응물의 증폭 산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 피시험자 시료의 증폭 산물이 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하여 유의적으로 증가되거나 감소되었다고 판단될 경우, 해당 피시험자는 대사성 질환의 위험성이 예측되거나 대사성 질환이 있는 것으로 판단할 수 있다.
바람직하게는, 피시험자 시료의 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 미생물에 대한 증폭산물이 정상 대조군 시료보다 높은 경우, 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다.
상기 게놈 DNA 증폭 단계가 SYBR 실시간 검출에 의해 이루어지는 경우, 상기 그란눌리카텔라 속 균주의 증폭 산물의 절대 정량값 1458, 1675 및 2350 복제수/ng로 이루어진 군에서 선택된 하한 값 및 2358, 3570 및 4963 복제수/ng로 이루어진 군에서 선택된 상한 값으로 이루어진 범위인 경우 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다. 또한, 상기 게놈 DNA 증폭 단계가 SYBR 실시간 검출에 의한 네이세리아 속 균주의 증폭 산물의 절대 정량값이 265 내지 692복제수/ng인 경우 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다.
또한 피시험자 시료의 펩토코커스 속 균주에 대한 증폭산물의 양이 정상 대조군 시료보다 낮은 경우, 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다.
상기 펩토코커스 속 균주의 증폭 산물의 절대 정량값이 23 내지 44복제수/ng 보다 낮은 경우, 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다.
바람직하게는 피시험자 시료의 펩토코커스 속 균주 및 그란눌리카텔라 속 균주의 증폭 산물의 비율이 정상 대조군 시료보다 낮은 경우 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다. 예를 들어 게놈 DNA 증폭 단계는 SYBR 실시간 검출에 의한 펩토코커스 속 균주 및 그란눌리카텔라 속 균주 각각의 증폭 산물의 비율이 0.01, 0.03, 0.05 및 0.22로 이루어진 군에서 선택된 하한 값 및 0.23, 0.6, 0.62, 1.4 및 1.5로 이루어진 군에섯 선택된 상한값으로 이루어진 범위인 경우 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다. 또한대용량 염기서열 분석에 의해 게놈 DNA 시퀀싱이 이루어지는 경우, 상기 펩토코커스 속 균주 및 그란눌리카텔라 속 균주의 게놈 빈도량 비가 0.0001 내지 0.05인 경우 대사성 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사성 질환이 있는 것으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 대사성 질환 환자에서 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주 군집이 특이적으로 증가하거나 감소한다는 것을 처음 규명하였으므로, 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주 군집의 변화와 질병 상태의 관련성을 이용하여, 대사성 질환 치료를 위한 신약 개발에도 활용될 수 있다.
바람직한 일구현예로, 본 발명은 대사성 질환 예방 또는 치료제 후보물질을 처리한 후 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 미생물 군집의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 대사성 질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서는 대사성 질환 예방 또는 치료 후보물질의 존재 및 부재 하에서 시료 내 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주의 변화를 비교하는 방법으로, 대사성 질환 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는데 적용될 수 있다. 다시 말해, 대사성 질환 예방 또는 치료 후보물질의 존재 및 부재 하에서 시료 내 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주의 군집 형성 정도를 각각 측정하여 양자를 비교한 후, 후보물질이 존재 할 때 군집 형성이 더 감소하는 경우 해당 후보물질을 대사성 질환 예방 또는 치료제로 개발할 수 있다.
상기 후보물질이란 대사성 질환 예방 또는 치료제가 될 수 있는 각종 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 등), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 대사성 질환의 위험성 예측 또는 진단을 위하여 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및/또는 펩토코커스 속 균주를 신규 바이오마커로서 제공하며, 이를 이용하여 종래 사용되는 방법 대비 예방 또는 진단의 정확성을 높일 수 있을 뿐 아니라 비침습적으로 시료를 채취할 수 있고 시료 채취 전 공복 조건을 요구하지 않아 유용하다. 또한 이를 이용하여 대사성 질환 예방 또는 치료용 신약 개발 및 제어의 타겟으로 활용할 수 있다.
도 1은 대사증후군 여부에 따른 구강 균총 다양성을 분석한 결과이다.
도 2는 대사증후군 여부에 따른 구강 균총의 군집구조를 분석한 결과이다.
도 3은 박테리아의 16S rRNA를 기반으로 기능을 예측하는 분석 소프트웨어인 PICRUSt를 이용하여 대사증후군 여부에 따른 구강 균총의 기능 차이를 본 결과이다.
도 4는 네트워크 분석을 통한 구강 균총의 군집 특징을 분석한 결과이다.
도 5는 단변량 분석 도구인 LEfSE 소프트웨어를 이용하여 대사증후군 그룹과 정상 대조군에서 증가하는 구강 세균을 나타낸 결과이다.
도 6은 쌍둥이 관계와 성별, 나이를 보정한 다변량 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여 대사증후군과 특정 구강 세균의 연관성을 나타낸 것이다.
도 7은 절대정량 분석 방법인 SYBR real-time PCR을 이용하여 네이세리아, 그란눌리카텔라 아디아센스 (Granulicatella adiacens), 펩토코커스를 정량한 결과이다.
도 8은 대사증후군을 정의할 수 있는 각각의 임상지표에 따른 그란눌리카텔라 박테리아의 절대량 변화 결과이다.
도 9는 구강 세균의 절대 정량 분석 결과로 나온 펩토코커스와 그란눌리카텔라 비율을 측정한 결과이다.
도 10은 구강 마이크로비옴 분석 결과로 나온 펩토코커스와 그란눌리카텔라 상대정량값의 비율을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 연구대상 및 시료 수집
본 연구는 한국의 쌍둥이 연구(Healthy Twin Study)에 참여한 일란성 쌍둥이를 대상으로 수행되었다. 쌍둥이의 일란성 여부는 AmpFlSTR Indentifier Kit (15개의 상염색체 short tandem repeat 마커와 1개의 성-결정 마커)와 90% 이상의 정확도를 보이는 설문지 조사를 통하여 확인하였으며, 본 쌍둥이 코호트에 대한 자세한 방법론은 이전의 논문에 기술되어 있다 (Sung, J., et al., Twin Research and Human Genetics, 2006. 9(6): p. 844-848.).
대사증후군 기준에 해당하는 환자와 건강한 대상자를 선정하여 구강 내 첫번째 어금니의 치석을 채취하였다. 멸균된 이쑤시개로 채취 된 치석 시료는 0.9%의 NaCl이 포함된 염분용액에 담겨 -80 에 냉동보관 하였다. 상기 대사증후군 환자 선정을 위해 적용한 기준은 다음과 같다.
<대사증후군 환자 선정 기준>
1) 허리둘레: 남성 90cm이상, 여성 85cm이상;
2) 혈중 중성지방 함량: 150mg이상;
3) 혈중 HDL콜레스테롤 함량: 남성 40mg/dL이하, 여성 50mg/dL이하;
4) 혈압: 130/85mmHg이상; 및
5) 공복혈당 100 mg/dL 이상.
실시예 2. 구강 미생물의 DNA 추출
실시예 1의 냉동 보관된 시료를 실험실로 옮겨 bead-beating extraction 방법으로 genomic DNA를 추출하였다. 치석이 묻어있는 이쑤시개는 zirconia-silica bead와 섞여 균질화 된 후, isopropanol 침전법으로 추출되었다.
실시예 3. 차세대서열분석을 이용한 구강박테리아 16S rRNA 유전자 시퀀싱
실시예 2에서 추출된 DNA는 박테리아의 V4 영역을 타겟으로 하는 515F/806R 프라이머(마크로젠, 출처논문: Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms)를 이용하여 PCR 증폭하였다. 상기 프라이머는 하기 표 2의 서열번호 4로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 5로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하며, 이를 사용하여 PCR 증폭을 하였다.
구분 서열번호 서열
정방향 4 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'
역박향 5 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'
상기 정방향 프라이머 서열은 왼쪽부터 오른쪽으로 어댑터 서열 (5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3'), 패드 서열 (5'-TATGGTAATT - 3'), 링커 서열 (5'-GT- 3'), 및 보존된 박테리아 프라이머 515F (5'- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')로 이루어진 것이며, 상기 역방향 프라이머 서열은 왼쪽부터 오른쪽으로 Illumina MiSeq 호환의 어댑터 서열 (5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3'), 12-바코드 서열, 패드 서열 (5'- AGTCAGTCAG - 3'), 링커 서열 (5'- CC - 3'), 및 보존된 박테리아 프라이머 806R (5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3')로 이루어진 것이다. PCR mixture는 총 50ul로 10 × 반응버퍼, 2.5mM의 dNTP, 12.5pmole의 프라이머, 2.5U의 G-Taq polymerase (Cosmo, Seoul, Korea)로 구성되었으며 PCR 반응은 94에서 3분간 변성, 94에서 45초, 50에서 60초 및 72에서 90초 35 회 반복, 72에서 10분간의 최종 연장 단계로 이루어졌다. 상기 증폭 산물을 Illumina사의 MiSeq 기기를 이용하여 시퀀싱 하였다.
실시예 4. 16S rRNA를 이용한 구강 박테리아 균총 분석
시퀀싱을 통해 생성된 대용량 염기서열 데이터는 QIIME pipeline사용하여 구강 박테리아 균총의 다양성과 구조를 분석하였다 (Caporaso, J.G., et al., QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods., 2010. 7(5): p. 335-336.)
한국인 쌍둥이 코호트 대상자 228명의 구강시료를 채취하여 박테리아의 16S rRNA를 대상으로 구강 미생물 균총 분석을 실시하였다. 분석 결과 대사증후군 집단의 구강 균총 다양성이 정상그룹에 비해 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(도 1). 대사증후군과 정상 대조군의 균총 구조 분석 결과, phylum 레벨에서 3개의 phyla가 70% 이상의 군집을 구성하는 것으로 나타났다. 퍼미큐츠 (Firmicutes)가 약 34%, 프로테오박테리아 (Proteobacteria)가 약 32%, 액티오박테리아 (Actinobacteria)가 약 17%를 이루었으며 대사증후군 그룹에서 퍼미큐츠가 38% 증가하였고, 프로테오박테리아가 30%감소하였음을 확인하였다 (도 2).
실시예 5. 구강 균총의 네트워크 분석
구강균총의 대사증후군 그룹과 정상 그룹에 따른 발생패턴을 파악하기 위해 Sparse Correlations for Compositional data (SparCC) 소프트웨어를 이용해 네트워크 분석을 실시하였다. 구강박테리아 균총의 네트워크 분석을 통해 대사증후군 환자군과 정상군에 상대적으로 많이 존재하는 박테리아들의 유사 군집을 형성하는 것으로 규명되었다 (도 3).
실시예 6. 16s rRNA 기반 미생물 기능 분석
대사증후군에 따른 구강균총의 기능적 차이를 분석하기 위해 PICRUSt 소프트웨어를 이용하였다. PICRUSt를 이용하여 박테리아의 16S rRNA를 기반으로 하여 미생물 기능을 유추하였다. (Langille, M.G., et al., Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nat. Biotechnol., 2013. 31(9): p. 814-21.) 박테리아의 16s rRNA 기반 미생물 기능을 분석한 결과 대사증후군 환자군에서 지방 대사에 속하는 스테로이드 합성 대사 경로가 유의하게 증가된 것을 확인 할 수 있었다(p 값 = 7.18E-05, q 값 (위양성이 보정된 p값) = 0.015) (도면 4).
실시예 7. 대사증후군 진단을 위한 구강 박테리아 바이오마커 분석
대사증후군 진단을 위한 구강 박테리아 바이오마커를 규명하기 위해 LEfSe를 이용하여 단변량 분석을 실시하였다. LEfSe는 Kruskal-Willis 분석을 통해 미생물 바이오마커를 규명한 후 Wilcoxon rank-sum 사후 분석을 통해 초기분석 결과를 검증하는 분석도구이다. 바이오마커 검증 후 LEfSe 소프트웨어의 Linear Discriminant Analysis (LDA) 분석을 통해 바이오마커의 영향력을 파악하였다(Segata, N., et al., Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biol., 2011. 12(6): p. R60.). 단변량 분석을 통한 구강 박테리아 바이오마커 분석 결과 네이세리아 속 균주(LDA 점수: 4.05), 그란눌리카텔라 속 균주(LDA 점수: 3.49)가 환자군에서, 펩토코커스 속 균주가 (LDA 점수: 3.1) 정상군에서 영향력이 더 큰 것을 확인하였다 (도 5).
실시예 8. 구강 균총과 대사증후군의 상관관계 분석
혼란변수를 제어할 수 있는 MaAsLin 소프트웨어를 이용해 다변량 분석을 통한 대사증후군을 특정할 수 있는 구강박테리아를 규명하였다. 대사증후군 여부를 독립변수로, 구강 균총을 종속변수로 지정 후 대상자의 나이, 성별를 제어하여 다변량 분석을 실시하였다. 대상자의 나이와 성별을 보정요인으로 넣고 실시한 다변량 분석결과, 네이세리아 속 균주(r 계수 = 0.04, q 값 (위양성이 보정된 p값) = 0.11), 그란눌리카텔라 속 균주(r 계수 = 0.019, q 값 (위양성이 보정된 p값) = 0.19)가 대사증후군과 유의한 상관관계가 있는 것으로 분석되었다 (도 6).
실시예 9. 절대 정량 분석에 따른 대사성 질환 탐지
실시예 7 및 실시예 8에서 대사증후군에서 유의한 연관성이 있는 것으로 분석된 3종의 구강박테리아 총의 검출로 대사성 질환 탐지의 가능성을 확인하기 위해 정량적 PCR의 방법 중 하나인 SYBR real-time PCR을 사용하여 각각의 대상자가 실제로 보유하는 네이세리아 속 균주, 그란눌리카텔라 속 균주 및 펩토코커스 속 균주의 절대 양을 측정하였다.
절대정량을 위한 standard curve를 제작하기 위해 펩토코커스와 네이세리아, 그란눌리카텔라의 기준균주 (type strain)을 배양하여 DNA를 추출 후 PCR로 증폭하여 나온 산물을 10배 연속희석법으로 희석하여 사용하였다. 제작된 standard curve와 함께 실시예 2에서 추출된 박테리아의 DNA를 대상으로 Real-time PCR이 진행되었다. Real-time PCR mixture는 총 25ul로 SYBR master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 50pmole의 프라이머로 구성되었으며 PCR 반응은 95에서 15분간 변성, 95에서 30초, 60에서 1분 및 72에서 30초간 40 회 반복으로 이루어졌다.
절대 정량 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었으며, 그란눌리카테라 속 균주가 대사증후군 그룹에서 평균 2514 copy number/ng (DNA), 정상 대조군에서 평균 2358 copy number/ng (DNA)로 증폭되어 대사증후군 환자군에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며 대사증후군을 진단하는 임상 기준 중 혈압이 높은 그룹에서 4963 copy number /ng (DNA), 혈압이 낮은 그룹에서 1675 copy number /ng (DNA)로 증폭되어 특히 혈압과 유의한 연관성이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 상기와 같이 구강 박테리아 균주 검출용 프라이머 및 PCR을 이용하여 박테리아 균주를 탐지하여 대사성 질환 위험도 예측 또는 진단에 사용할 수 있음을 확인하였다.
Real-time PCR분석으로 산정된 박테리아의 genome copy 수를 이용하여 정상군과 대사증후군 그룹의 펩토코커스와 그란눌리카텔라의 비율을 계산하였다. 펩토코서스의 genome copy 수를 그란눌리카텔라의 genome copy수로 나누어 비율이 산정되었다. 또한, 대용량 염기서열 분석으로 산정된 구강 균의 상대빈도량을 기반으로 동일한 분석이 이루어졌다.
정상군과 대사증후군의 펩토코커스 속 균주와 그란눌리카텔라 속 균주의 비율을 산정한 결과를 도 9에 나타내었으며, 그 비율이 정상군 0.62, 환자군에서 0.22로 정상군에서 유의하게 높은 것을 확인하였다. 동일한 분석방법을 구강균총 분석결과로 산정된 균총의 빈도량에 적용하였을 때 역시 정상군에서 펩토코커스 속 균주와 그란눌리카텔라 속 균주의 비율이 1.4, 환자군에서 비율이 0.05로 정상군에서 유의하게 높은 것으로 확인되었다 (도 10).
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> The human oral microbiota in diagnosis of metabolic syndrome <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> forward primer for peptococcus 16S rRNA amplification <400> 1 ggtgccgcag taaacacaat aagt 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer for peptococcus 16S rRNA amplification <400> 2 aaggcccggg aacgtattca 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> forward primer for Granulicatella 16S rRNA amplification <400> 3 caagcttctg ctgatggatg ga 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> reverse primer for Granulicatella 16S rRNA amplification <400> 4 ctcaggtcgg ctatgcatca c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for Neiserria 16S rRNA amplification <400> 5 ctggcgcggt atggtcggtt 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> reverse primer for Neisseria 16S rRNA amplification <400> 6 gccgacgttg gaagtggtaa ag 22

Claims (14)

  1. 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 내 미생물; 또는
    그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 내 미생물과 구강 내 네이세리아(Neisseria)속 균주를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 구강 미생물을 이용한 대사증후군 위험도 예측 또는 진단용 조성물로서,
    상기 대사증후군은 아래 1) 내지 5)의 선정기준 중 3가지 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    1) 허리둘레: 남성 90cm이상, 여성 85cm이상;
    2) 혈중 중성지방 함량: 150mg/dL이상;
    3) 혈중 HDL콜레스테롤 함량: 남성 40mg/dL이하, 여성 50mg/dL이하;
    4) 혈압: 130/85mmHg이상; 및
    5) 공복혈당 100 mg/dL 이상.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 구강 내에서 채취된 시료에 적용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체인, 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 구강 미생물을 이용한 대사증후군의 위험도 예측 또는 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 구강 내에서 채취된 시료에 적용되는 것을 특징으로 하는, 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 피시험자의 구강 내 시료의 채취를 위한 구강 시료 채취용 포집 기구를 포함하며, 상기 포집 기구는 흡수성 패드, 면봉, 스포이드, 스푼, 스왑 및 이쑤시개로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 구강 시료 채취용 포집 기구를 추가로 포함하는 것인, 키트.
  8. 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 내 미생물; 또는
    그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 내 미생물과 구강 내 네이세리아(Neisseria)속 균주를 검출하는 단계를 포함하는, 대사 증후군의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 대사증후군은 아래 1) 내지 5)의 선정기준 중 3가지 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    1) 허리둘레: 남성 90cm이상, 여성 85cm이상;
    2) 혈중 중성지방 함량: 150mg/dL이상;
    3) 혈중 HDL콜레스테롤 함량: 남성 40mg/dL이하, 여성 50mg/dL이하;
    4) 혈압: 130/85mmHg이상; 및
    5) 공복혈당 100 mg/dL 이상.
  9. 제8항에 있어서,
    피시험자의 구강 시료에서 얻어진 미생물의 게놈 DNA에, 상기 구강 내 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계;
    상기 반응물을 증폭시키는 단계를 포함하는, 대사증후군의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 구강 시료는 피 시험자의 구강 내 상피세포, 구강 내 혈액, 구강 내 타액, 구강 내 치석, 구강 내 혈장, 및 이를 포함하는 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1이상인 것인, 대사성 증후군의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 시료의 게놈 DNA 증폭산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하여 대사증후군을 예측 또는 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 대사증후군의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시료의 게놈 DNA 증폭산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하여 상기 시료의 그란눌리카텔라 속 균주의 미생물에 대한 증폭산물이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 대사 증후군의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사 증후군이 있는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 대사 증후군의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 시료의 게놈 DNA 증폭산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하여 상기 시료의 펩토코커스 속 균주에 대한 증폭산물의 양이 정상 대조군 시료보다 낮은 경우 대사 증후군의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 대사 증후군이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 대사 증후군의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 대사증후군 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질 처리 전 및 처리 후 구강 내 시료에서 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 내 미생물, 또는 그란눌리카텔라(Granulicatella)속 균주 및 펩토코커스(Peptococcus)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 내 미생물과 구강 내 네이세리아(Neisseria)속 균주의 변화를 검출하는 단계; 및
    상기 후보물질 처리 후 상기 그란눌리카텔라 속 균주의 미생물 검출량이 감소하거나, 상기 펩토코커스 속 균주의 검출량이 증가한 경우 상기 후보 물질을 대사증후군 예방 또는 치료제인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 대사증후군 예방 또는 치료제 스크리닝 방법으로서,
    상기 대사증후군은 아래 1) 내지 5)의 선정기준을 만족하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    1) 허리둘레: 남성 90cm이상, 여성 85cm이상;
    2) 혈중 중성지방 함량: 150mg이상;
    3) 혈중 HDL콜레스테롤 함량: 남성 40mg/dL이하, 여성 50mg/dL이하;
    4) 혈압: 130/85mmHg이상; 및
    5) 공복혈당 100 mg/dL 이상.
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