KR20220025628A - 구강 미생물군을 이용한 불면증 치료 효과 예측 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구강 미생물군을 이용하여 불면증 환자에 대한 불면증 치료제의 효능을 예측하기 위한 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측용 조성물 및 예측 방법에 관한 것으로, 불면증 치료제의 불면증 치료 효과를 예측하기 위하여 팔루디박터(Paludibacter)속 균주, 셀레노모나스(Selenomonas)속 균주, 펩토코커스(Peptococcus)속 균주, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)속 균주 및 게멜라(Gemella)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 검출함으로써 불면증 치료 약물을 투약 또는 복용하기 전에 그 약물의 반응을 비침습적으로 예측하여 불면증 치료 효과 수준을 예상할 수 있을 뿐만 아니라 불필요한 약물의 오남용을 줄일 수 있다.

Description

구강 미생물군을 이용한 불면증 치료 효과 예측 방법{Method for Predicting the effect of insomnia treatment using oral microbiota}

본 발명은 구강 미생물군을 이용하여 불면증 환자에 대한 불면증 치료제의 효능을 예측하기 위한 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측용 조성물 및 예측 방법에 관한 것이다.

불면증(Insomnia)은 잠들기가 어려운 입면 장애와 잠은 들지만 자는 도중 자주 깨거나 너무 일찍 잠에서 깨어나는 수면유지 장애를 의미하며, 충분한 잠을 자지 못해 수면 부족 상태가 되어 낮 동안 졸음, 피로감, 의욕 상실 등을 초래해 일상생활에 지장을 주고, 삶의 질을 떨어뜨린다. 불면증은 교감신경계(sympathetic nervous system, SNS)나 시상하부-뇌하수체-부신 활동(hypothalamic-pituitary-adrenal activity) 측면에서 심혈관 질환과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 부교감신경계와 함께 SNS는 자율신경계(autonomic nervous system, ANS)를 구성하는데, 이는 심혈관 질환의 생리학 및 병리학에서 결정적인 역할을 한다. 따라서, ANS 활동 조절은 자율신경 불균형에서 비롯되는 심장 기능장애의 치료와 관리에 있어 중요한 기준 중 하나이다. 전통한의학(Traditional Korean Medicine)에서는 심음허(心陰虛, heart-yin deficiency)가 대표적인 불면증 유형 중 하나이다. 심음허형 불면증은 불안, 해일열(tidal fever), 식은땀(night sweat), 얼굴 홍조, 사상맥(thready pulse), 빈맥(rapid pulse)을 특징으로 하는 병적 질환으로, 혀가 붉고 설태(tongue coating)가 적으며 입이 건조한 증상도 있다. 따라서, 현대 생리학과 전통한의학에서는 불면증과 심장 기능이 밀접한 관계가 있는 것으로 보고 있다.

현재까지 심장 기능과 구강 건강 간의 관계를 이해하기 위한 많은 연구가 수행되었다. G Aarabi, et al. (Biomolecules. 2018) 및 PB Lockhart, et al. (Circulation. 2008)의 연구에 따르면, 구강염이나 발치에 의한 균혈증(bacteremia)은 감염성 심내막염을 일으킬 뿐만 아니라 자율신경을 자극하여 심방세동을 일으킬 수 있는 것으로 보고되었다. 또한, J Chhibber-Goel, et al. (NPJ biofilms and microbiomes. 2016))의 연구에서는 5종의 구강 공생균 (Campylobacter rectus, P. gingivalis, Porphyromonas endodontalis, P. intermedia, Prevotella nigrescens)이 비심장질환에 비해 관상동맥질환에 특화된 것으로 나타나, 구강 미생물군(oral microbiota)과 심장 질환, 특히 관상동맥질환의 연관성을 확인한 바가 있었다.

그러나, 불면증과 구강 미생물군 간의 연관성에 관하여는 현재까지 연구된 바가 없다.

G Aarabi, et al. Biomolecules. Potential Impact of Oral Inflammations on Cardiac Functions and Atrial Fibrillation. 2018 Sep; 8(3): 66. PB Lockhart, et al. Circulation. Bacteremia associated with toothbrushing and dental extraction. 2008 Jun 17;117(24):3118-25. J Chhibber-Goel, et al. NPJ biofilms and microbiomes. Linkages between oral commensal bacteria and atherosclerotic plaques in coronary artery disease patients. 2016 Dec 19;2:7.

본 발명은 팔루디박터(Paludibacter)속 균주, 셀레노모나스(Selenomonas)속 균주, 펩토코커스(Peptococcus)속 균주, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)속 균주 및 게멜라(Gemella)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 이용한 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 구강 미생물을 이용한 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 불면증과 구강 미생물군 간의 연관성을 연구하기 위해 한의학적으로 진단된 심음허형 불면증 환자와 비심음허형 불면증 환자를 대상으로 불면증 치료 약물의 투여 전후 구강 미생물군 변화를 분석한 결과, 불면증 환자의 구강 미생물 중 팔루디박터속, 셀레노모나스속, 펩토코커스속, 펩토스트렙토코커스속 및 게멜라속 균주량의 변화를 확인함으로써 불면증 환자가 불면증 치료제를 투약 또는 복용하기 전에 그 효능을 예측할 수 있는 기술을 개발하였다.

본 발명의 일 양상은 팔루디박터속 균주, 셀레노모나스속 균주, 펩토코커스속 균주, 펩토스트렙토코커스속 균주 및 게멜라속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측용 조성물을 제공한다.

상기 팔루디박터(Paludibacter)속 균주는 혐기성 그람 음성균으로 비운동성이며, P. jiangxiensis, P. propionicigenes가 여기에 속한다. 이러한 균주는 구강 건강과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

상기 셀레노모나스(Selenomonas)속 균주는 초승달 모양의 세균으로 세포의 오목한 부위의 중앙에 편모 다발을 가지고 있는 혐기성 그람 음성균이다. 이러한 균주는 동물의 장관, 인간의 잇몸, 반추동물의 반추위에서 서식하는 것으로 알려져 있다.

상기 펩토코커스(Peptococcus)속 균주는 구형의 그람 양성균으로, 주로 구강, 호흡기, 대장 등의 점막에서 상재한다.

상기 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)속 균주는 혐기성 그람 양성균으로 구형이며 짧은 사슬을 형성할 수 있으며, 주로 인간의 구강, 피부, 장관, 질, 요도에 서식한다. 특히 장내 서식하는 펩토스트렙토코커스 균주는 장내 상피에 유익한 효과를 보이며, 인도레아크릴산(indoleacrylic acid)을 생산하여 염증을 완화시키는 것으로 보고된 바 있다.

상기 게멜라(Gemella)속 균주는 그람 양성균으로, 인간 및 다른 동물의 구강 점막이나 소화관에서 발견된다.

이러한 팔루디박터속 균주, 셀레노모나스속 균주, 펩토코커스속 균주, 펩토스트렙토코커스속 균주 및 게멜라속 균주는 구강에서 채취된 생물학적 시료를 통해 확인 가능한 구강 내 미생물로, 이전에 심장질환 또는 수면장애와의 상관관계가 연구되거나 연관성이 밝혀진 바가 없었다.

상기 구강 미생물을 검출할 수 있는 제제는 시료 내에 존재하는 팔루디박터속 균주, 셀레노모나스속 균주, 펩토코커스속 균주, 펩토스트렙토코커스속 균주 및 게멜라속 균주의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들면, 상기 균주에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 물질일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 제제가 항체일 경우에는 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 평판내 면역 확산법(ouchterlony), 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(complement fixation assay), FACS(fluorescence activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 제제가 미생물에 특이적인 프라이머일 수 있다.

상기 프라이머(primer)는 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7~50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로는 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 프라이머는 팔루디박터속 균주, 셀레노모나스속 균주, 펩토코커스속 균주, 펩토스트렙토코커스속 균주 및/또는 게멜라속 균주의 16S sRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

상기 16s rRNA는 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분 상당히 보존되어 있는 한편 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.

상기 불면증 치료제는 수면장애 증상을 개선하거나 치료하는 약물을 의미하며, 예를 들면, 식물, 해조류 등과 같은 천연 소재로부터 추출된 추출물, 또는 이로부터 추출된 천연 화합물이거나, 또는 합성 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 한약재 추출물 또는 이로부터 추출된 화합물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 불면증 치료 효과의 예측은 불면증을 갖는 개체, 즉 불면증 환자가 불면증 치료제를 투약 또는 복용할 경우, 그 치료제에 의해 불면증이 개선 또는 치료될 수 있는지를 판별 또는 판단하는 것을 의미한다.

이러한 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측용 조성물은 팔루디박터속 균주, 셀레노모나스속 균주, 펩토코커스속 균주, 펩토스트렙토코커스속 균주 및 게멜라속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함함으로써 비침습적으로 불면증 치료제의 치료 효과를 예측하여 약물의 오남용을 예방하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

바람직하게는, 팔루디박터속 균주, 셀레노모나스속 균주, 펩토코커스속 균주, 펩토스트렙토코커스속 균주 및 게멜라속 균주 모두를 검출할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 양상은 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측에 필요한 정보를 제공하기 위해, 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측 방법을 제공한다. 구체적으로는, a) 불면증을 갖는 개체의 구강에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; b) 상기 시료에서 팔루디박터속 균주, 셀레노모나스속 균주, 펩토코커스속 균주, 펩토스트렙토코커스속 균주 및 게멜라속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 측정하는 단계; 및 c) 상기 측정된 미생물 검출량을 이용하여 불면증 치료제의 치료 효과를 예측하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 a) 단계는 불면증을 갖는 개체로부터 구강 시료를 채취하는 과정이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 불면증을 갖는 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 예를 들면, 인간, 마우스, 랫드, 개, 돼지 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 불면증 환자 또는 불면증이 예상되는 사람의 구강에서 채취된 것으로, 구강 내 점막세포, 혈액, 혈장, 타액, 설태, 치석 및 이를 포함하는 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 검체 채취용 멸균 면봉(swab)을 사용하여 불면증을 갖는 환자의 혓바닥 위를 긁어서 생물학적 시료로서 설태를 채취하였다.

상기 b) 단계는 채취된 구강 시료에서 불면증 치료제의 치료 효과를 예측할 수 있는 특정 미생물의 발현량 또는 발현 수준을 측정하는 과정이다.

상기 미생물의 발현량 또는 발현 수준을 측정하기 위해서는 전술한 '불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측용 조성물'을 적용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 당업계에 알려진 일반적인 기술 또는 방법을 제한 없이 사용하여 구강 시료로부터 추출된 미생물의 게놈 DNA를 사용하여 구강 미생물을 측정할 수 있다.

상기 측정 방법은 게놈 DNA를 증폭시키는 방법으로서 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), SYBR 실시간 PCR, 역전사-중합효소 연쇄반응, 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 벡토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 c) 단계는 측정된 5개 속(genus)의 미생물 검출량을 이용하여 불면증 치료제에 대한 치료 효과 여부를 판단할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계는 미생물 검출량을 하기 수학식 1에 적용하여 계산된 값이 1.8525 이상일 경우, 불면증 치료제에 대해 치료 효과가 존재하는 것으로 예측하는 것일 수 있다.

반면, 상기 수학식 1에서 계산된 값이 1.8525 미만일 경우에는 불면증 치료제에 대해 치료 효과가 존재하지 않거나 유의미한 효과가 나타나지 않을 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에 따른 예측 방법은 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 통해 예측 방법의 정확도(acccuracy)를 나타낼 수 있다. 상기 민감도는 실제 불면증 치료제에 대해 치료 효과가 존재하는 개체를 양성으로 판정하는 비율을 의미하며, 상기 특이도는 실제 불면증 치료제에 대해 치료 효과가 존재하지 않는 개체를 음성으로 판정하는 비율을 의미한다, 예측 방법에서 민감도와 특이도가 모두 높을 경우, 예측의 정확도가 높아지게 된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 구강 시료에서 확보된 미생물군에 대한 Fisher's discriminant analysis에 기초하여, Paludibacter, Selenomonas, Peptococcus, Peptostreptococcus 및 Gemella를 이용하여 불면증 치료 약물인 천왕보심단 투여에 대한 치료 효과 또는 반응을 예측할 수 있는 예측 방정식 (수학식 1)을 도출할 수 있었다. 이때, 방정식의 민감도(sensitivity)가 72.00% 이며, 특이도(specificity)가 90.48% 인 것으로, 높은 정확도로 불면증 치료제에 대해 치료 효과를 예측할 수 있다.

본 발명은 불면증 치료제의 불면증 치료 효과를 예측하기 위하여 팔루디박터(Paludibacter)속 균주, 셀레노모나스(Selenomonas)속 균주, 펩토코커스(Peptococcus)속 균주, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)속 균주 및 게멜라(Gemella)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 검출함으로써 불면증 치료 약물을 투약 또는 복용하기 전에 그 약물의 반응을 비침습적으로 예측하여 불면증 치료 효과 수준을 예상할 수 있을 뿐만 아니라 불필요한 약물의 오남용을 줄일 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실험 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 수면 질에 대한 CBD 의 효과를 확인한 결과이다; CBD 투여 후 6주간의 (A) ISI, (B) PSQI 및 이의 델타(delta) (6주차-0주차), (C) 수면 효율, (D) TBT 및 이의 델타 (E) TST 및 이의 델타, (F) TWT, (G) TWF, (H) WMT을 나타낸다.
도 3은 설태의 백분율에 대한 천왕보심단의 효과를 확인한 결과이다; CBD 투여 후 6주간 WTCI(Winkel Tongue Coating Index)를 기반으로 설태의 백분율 변화를 확인하였다. (A)는 WTCI를 보여주는 그림이며, (B)~(G)는 WTCI에 의해 나누어진 각 부위 A~F의 설태 백분율(PTC, %)을 나타낸다. 각 값은 평균±표준편차를 의미한다 (* P<0.05).
도 4는 NHYD 그룹과 HYD 그룹 간의 구강 미생물군 차이를 나타낸 결과이다; (A)는 NHYD 그룹과 HYD 간의 통계적 및 생물학적으로 일관된 차이에 대한 분류학적 표현이다. 차이는 가장 풍부한 강(class)의 색으로 나타냈다 (적색: HYD, 녹색: NHYD, 황색: 유의미하지 않음). 각 원의 지름은 분류군(taxon)의 풍부함에 비례한다. (B)는 차등적 풍부함에 대한 LDA 점수의 히스토그램을 나타낸다. 분지도는 LEfSe로 계산되었고 효과 크기에 따라 표시되었다.
도 5는 CBD 투여 전후 간의 구강 미생물군의 다양성을 나타낸 결과이다; 미생물 종의 알파 다양성을 (A) Chao1 index 및 (B) OTUs로 나타냈고, 베타 다양성을 (C) 가중된(weighted) 및 (D) 미가중된 Unifrac distance로 나타냈다.
도 6은 구강 미생물군의 상대적 풍부함에 대한 CBD의 효과를 확인한 결과이다; (A) 및 (B)는 구강 미생물군의 전체 구성 변화를 나타냈고, (C) 및 (D)는 개별적인 구강 미생물군의 상대적 풍부함을 나타냈다. (A) 강(class) 수준에서의 상대적 풍부함. (B) 속(genus) 수준에서의 상대적 풍부함. (C) Clostridia의 상대적 풍부함. (D) Veillonella의 상대적 풍부함.
도 7은 임상 파라미터와 구강 미생물군 간의 상관관계를 나타낸 결과이다; (A)는 임상 파라미터와 문(phylum) 수준에서 풍부한 미생물 상위 8개의 상관관계를 분석한 것이고, (B)는 임상 파라미터와 속(genus) 수준에서 풍부한 미생물 상위 34개의 상관관계를 분석한 것이다. 상관계수(correlation coefficient)는 Spearman's correlation analysis으로 얻었다. * p<0.05. SE: sleep efficiency, TBT: total bed time, TST: total sleep time, TWT: total wake time, TWF: total wake frequency, WMT: mean wake time, SBP: systolic blood pressure, DBP: diastolic blood pressure, PR: pulse rate.
도 8은 피험자들의 구강 미생물군 유형을 확인한 결과이다; (A)는 피험자들의 구강 미생물군 집단을 오로타입으로 분류한 것이다. (B)는 각 오로타입에서 속(genus) 수준으로 상대적 풍부함을 나타낸 것이다. (C)는 3종의 주요 미생물 분류군에 대한 상대적 풍부함을 나타낸 것이다. 값은 평균±표준편차로 나타냈다 (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001).
도 9는 오로타입별 수면 질에 대한 CBD의 효과를 확인한 결과이다; CBD 투여 후 6주간의 (A) ISI, (B) PSQI 및 이의 델타(delta) (6주차-0주차), (C) 수면 효율, (D) TBT 및 이의 델타 (E) TST 및 이의 델타, (F) TWT, (G) TWF, (H) WMT을 나타낸다. 값은 평균±표준편차로 나타냈다 (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

1. 실험 방법

1-1. 실험 일정

일산 동국대병원에서 2018년 5월부터 2019년 2월까지 무작위적이고, 예상된 개방적인 단일 센터 임상 실험을 수행하였다 (등록번호: KCT0003668). 피험자는 6주간 저녁식사 1시간 후 천왕보심단(CBD, Cheonwangbosim-Dan) (소환제 20개/3.75 g/pouch)를 투약하였고, 3주마다 피험자의 활력징후(vital signs), 인체측정학적 파라미터(anthropometric parameter), 수면 질(sleep quality) 및 심장과 자율신경 기능을 측정하였다. 또한, 실험 초기 (실험 0주차)와 종료 (실험 6주차)할 때 임상 검사(clinical laboratory) 정보, 혀 특징 및 구강 미생물 집단(oral microbial communities)을 분석하였다. 후속실험으로 피험자와 표준화된 전화 인터뷰를 실시하여 투약 종료 후 4주차 (실험 10주차)에 PSQI(Pittsburgh Sleep Quality Index) 및 ISI(Insomnia Severity Index) 평가를 수행하였다. 임상 실험은 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)의 가이드라인을 준수하였으며, 검사 프로토콜(study protocol)은 일산 동국대병원의 기관심사위원회의 승인을 받았다 (승인번호: DUIOH 2018-02-001-003). 서명된 사전동의서는 등록 전 모든 피험자들로부터 받았다.

1-2. 약물

CBD 소환제(small pillet)는 짙은 갈색으로 정우뉴팜㈜ (대한민국)에서 제조되었다. 소환제가 담긴 각 파우치의 조성은 하기 표 1과 같다. 모든 피실험자들은 6주 동안 저녁식사 후 1시간 지나서 CBD 파우치 1개를 경구 투약하였으며, 투약 준수율(drug compliance)이 80% 미만인 피험자는 검사 프로토콜 분석에서 제외되었다.

한약재명	함량 (mg)
지황(Rehmanniae Radix)	500
황령(Coptidis Rhizoma)	250
당귀(Angelicae Gigantis Radix)	125
천문동(Asparagi Radix)	125
오미자(Schisandrae Fructus)	125
백자인(Biotae Semen)	125
산조인(Ziziphi Spinosae Semen)	125
맥문동(Liriopis Tuber)	125
인삼(Ginseng Radix)	62.5
적복령(Hoelen)	62.5
길경(Platycodi Radix)	62.5
원지(Polygalae Radix)	62.5
현삼(Scrophulariae Radix)	62.5
단삼(Salviae Miltiorrhizae Radix)	62.5

1-3. 피험자

초기 불면증 진단을 받은 19~65세 한국인 성인 남녀를 대상으로 지난 3개월 동안 일주일에 한 번 이상 불면증을 경험한 사람을 피험자로 선정하였다. 선정 당시, 피험자들의 PSQI와 ISI 점수는 각각 6점과 8점 이상이었다. 또한, BDI(Beck Depression Index)가 24점 이상인 우울증에 의한 수면장애가 발생한 경우, 최근 2주 이내에 급성 불면증을 경험한 경우, 과거나 현재에 심장질환 (심장부전, 협심증, 심근경색, 허혈성 심정지), 유도성 불면증 (뇌졸중, 뇌염과 같은 유기 뇌 장애, 갑상선 기능 저하, 저혈당증, 간 또는 신장 장애, 만성 호흡기 질환 등) 및 정신장애 (조현병, 양극성 정동장애, 중증 우울증 등)를 경험한 경우, 수면 (통증 등)에 영향을 줄 수 있는 질환이 있는 경우, 야간근무자와 같이 불면증을 유발할 수 있는 환경에 있는 경우, 불면증 관련 약물을 투약하면서 프로바이오틱스와 항생제를 복용한 경우, 치아 보형물이 있는 경우, 임산부, 수유 여성는 피험자에서 제외되었다. 실험 기간 동안 피험자들은 신체활동측정시스템(actigraph, 액티그래프)을 착용하고 오후 2시 이후에는 카페인을 피하며, 오후 6시 이후에는 알코올 음료를 1잔만 마실 수 있도록 하였다. 피험자들은 전체 실험 기간 동안 일상적인 식습관과 신체 활동을 지속하도록 요구되었다.

1-4. 패턴 판별 진단

PIT-Insomnia(Pattern Identification Tool-Insomnia)은 한의학 신경정신과 전문의 17명이 불면증 패턴을 판별하기 위해 개발한 것이다. PIT-불면증 분석은 공개된 한·중문학 문서에서 발췌한 47개 문항으로 구성된 자기보고서에 대한 피실험자들의 반응을 근거로 하였다. 문항들은 자율신경계, 수면 패턴, 인지·정서기능, 소화계, 비뇨생식계 등과 관련된 다양한 증상과 연관되었다. 응답 결과에 따라, 피험자들을 심음허형 불면증(heart yin deficiency, HYD)와 비심음허형 불면증(Non-HYD, NHYD) 그룹으로 분류하였다. 특히, 38명의 불면증 환자를 대상으로 PIT-Insomnia 분석의 신뢰성과 유효성을 평가하고 PIT-Insomnia 분석과 심리 검사의 상관관계를 검증하기 위해 초기에 임상 연구가 실시되었다. 이 연구의 결과는 PIT-Insomnia에 대한 신뢰성의 중간 합의(moderate agreement)가 있음을 나타냈으며, 불면증의 중증도(severity)를 나타내는 지표인 PSQI와 어느 정도 공인타당도(concurrent validity)를 보였다. 또한, PTI-Insomnia는 K-BDI, STAI-K 및 KSCL-95과 같은 특정 심리 검사와 어느 정도 상관관계가 있었다.

1-5. 수면 패턴 분석

피험자의 수면 패턴은 두 가지 유형의 설문지에 대한 피험자의 응답과 액티그래프에서 얻은 데이터를 기반으로 분석되었다. 각 피험자의 수면 질과 불면증 중증도는 PSQI와 ISI 설문지를 사용하여 평가되었다. PSQI는 지난 한 달간의 수면 질 및 패턴을 평가하는 19개의 문항으로 구성된다. 수면 관련 요소 7개를 합하면 0 ~ 21점의 전체 점수(global score)를 얻을 수 있다. 총점이 5점 이상이면 수면 질이 떨어짐을 나타낸다. ISI는 지난 한 달간의 불면증 중증도를 평가하는 7가지 문항으로 구성된다. 각 문항마다 자제 등급에 대한 5점 리커트 척도(Likert scale)를 사용하며, 총점은 0~28점이다. 총점 8점이 넘으면 불면증이며, 특히 22점 이상이 되면 중증 불면증으로 간주된다. 또한 피험자는 매일 수면 일지를 작성하였으며, 그 정보는 액티그래프 데이터를 분석하는데 사용되었다.

액티그래피(actigraphy)는 손목에 착용하는 소형 동작기록기(Mini Motionlogger) (Amborator Monitoring Inc., 미국)를 사용하여 수행되었다. 피험자들은 CBD 투여 전 1주 그리고 실험의 마지막 1주 동안 주로 사용하지 않는 손목(non-dominant wrist)에 액티그래프를 착용하였다. 피실험자들은 잠들기 전과 잠에서 깬 후에 액티그래프의 측면에 있는 이벤트 버튼을 누르도록 지시되었다. 피실험자들은 샤워나 목욕과 같은 개인적인 이유를 제외하고 계속해서 액티그래프를 착용하였다.

1-6. 심장 기능 및 자율신경 기능 분석

0주, 3주, 6주차에, 피험자의 심장 기능과 자율신경 기능을 검사하기 위해 SA-6000 자율신경 기능 시험 및 혈액 순환 평가 측정기 (Medicore Co. Ltd., 한국)를 사용하여 5분간 휴식한 후 심박수 변동성(heart rate variability, HRV)과 맥박수를 3분간 측정하였다. 상기 측정기는 심장 박동에 따라 말초혈액량의 변화에 의해 전파되는 동맥파를 측정하는 광선측정기(photoplethysmometer)이다. 이 신호들은 피실험자들이 손가락에 착용한 광센서의 도움으로 포착되었다. 측정된 맥파(pulse wave)로부터 순간 심박수를 변경한 후 HRV를 분석하였다. 이러한 데이터를 사용하여 자율신경계 기능, 표준 단위에서의 저주파 전력(low frequency power in normalized units, LFn), 표준 단위에서의 고주파 전력(high frequency power in normalized units, HFn)을 평가하였다.

1-7. 혀 특징 분석

아침에 잠에서 깬 피험자들은 적어도 4시간 동안 음식 섭취나 양치질을 하지 않은 금식 상태로 병원을 방문하였다. 후설면(tongue dorsum) 이미지는 화이트 밸런스 설정이 수동으로 조정된 디지털 카메라를 사용하여 사진을 찍어 CTS-1000 전산 혀 이미지 분석 시스템(computerized tongue image analysis system) (대승메디컬스, Co., 한국)으로 분석되었다. 설태 부위(tongue coating area)는 적색 채도(red saturation)의 차이를 기준으로 전체 혀 부위에서 분리되었으며, 혀 본체(tongue body)와 설태 부위의 평균 색 값을 분석하였다. 그 후 전체 혀 부위는 WTCI(Winkel tongue coating index)에 따라 6개의 하위영역으로 나뉘었다. 각 하위영역과 설태 영역의 픽셀 수를 각각 계산하고, 각 하위영역에서 혀 본체 부위 대비 설태의 비율을 계산하였다. 자세한 색 보정(correction) 및 분할 과정은 이전 연구 (J Kim, et al. Evid. Based Complementary Altern. Med. 2013; SR Kim, et al. Evid. Based Complementary Altern. Med. 2017)에서와 같이 수행하였으며, 구강 미생물 분석을 위한 설태 샘플은 혀의 뿌리부터 끝까지 멸균된 주걱을 문질러 후설면의 표면에서 채취하였다.

1-8. 구강 마이크로바이옴 분석

검체 채취용 멸균 면봉(swab)을 사용하여 피험자의 혓바닥 위를 긁어서 생물학적 시료로서 설태를 채취하였다. 신선한 설태 샘플은 식염수와 완전히 섞어서 원심분리하였다. 그 상등액을 채취하여 마이크로바이옴(microbiome) 연구를 위해 -80℃에 즉시 보관하였다. 메타게놈 DNA(metagenomic DNA)는 제조사의 지시에 따라 DNA Miniprep kit (QIAGEN, 독일)를 이용하여 분리되었다. 16S rRNA 유전자의 V1-V2 부위는 Thermal Cycler PCR system (BioRad, 미국)을 사용하여 증폭되었고, 이후 앰플리콘(amplicon)은 LaboPass PCR purification kit (COSMO GENTECH, 한국)로 정제되었다. 각 샘플은 복합 앰플리콘 시퀀싱 데이터(multiplex amplicon sequencing data)를 분석하기 전에 개별 판독값(read)을 확인하고 분류할 수 있도록 바코드 프라이머(barcoded primer)로 증폭되었다. 서로 다른 샘플에 대한 각 앰플리콘의 동일몰 농도(equimolar concentration)를 동일한 비율로 풀링하였다(pooled). 시퀀싱 라이브러리는 Ion Xpress Plus fragment library kit (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 사용하여 풀링된 앰플리콘 샘플로 구성되었다. 각 구축된 라이브러리의 품질과 수량은 High Sensitivity DNA kit (Agilent, 미국)를 이용한 BioAnalyzer 2100 microfluidics-based device (Agilent, 미국)를 통해 확인되었다. 시퀀싱 반응은 Ion Torrent Personal Genome Machine system (Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 수행되었다.

OTUs(operational taxonomic units, 97% identity, Greengenes 데이터베이스: http://greengenes.lbl.gov), 분류 할당(taxonomic assignment) 및 계통발생 재구성(phylogenetic reconstruction)은 QIIME(Queritical Insights in Microbal Ecomics) 소프트웨어 패키지 (버전 1.9.1, 콜로라도 대학교, 미국)를 사용하여 수행되었다. 실험군 간에 현저히 큰 차이를 보이는 분류군(taxa)은 웹 기반 프로그램 (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy)의 도움을 받아 LefSe(linear discriminant analysis effect size) (Hutlab, 미국) 도구를 사용하여 확인되었고 Graphpad Prism 5 (GraphPad, 미국)를 사용하여 시각화되었다. 분석하는 동안, 강(class) 중에서 factorial Kruskal-Wallis test 의 알파 값은 0.05로 설정되었고, 차별적 특징에 대한 대수 LDA(logarithmic linear discriminant analysis) 점수의 임계값은 2.0으로 설정되었다. 알파 다양성(alpha diversities)은 Shannon's and Simpson's indices로 측정되었고, 베타 댜양성은 Bray-Curtis/Unweighted UniFrac/Weighted UniFrac distance를 통해 결정되었다. 최종적으로, NMDS/PcoA(Non-metric Multidimensional Scalin/ Principal Coordinate Analysis) 플롯의 데이터를 이용하여 QIIME를 구축하였다. 추가로, MetaHIT (https://enterotype.embl.de/enterotypes.html)에 의해 제공된 R 코드를 사용하여 속(genus) 수준에서 구강 미생물군 타입(oral microbiota type 또는 orotype)을 분석하였다. 샘플은 partitioning around medoids clustering algorithm을 사용하여 클러스터링하였으며, Calinski-Harabasz index를 사용하여 최적의 클러스터(cluster) 수를 검증하였다. 샘플 분포(distribution)는 JSD(Jensen-Shannon distance) 거리 측정을 사용하여 상대적인 속(genus) 분포를 기반으로 계산하였고, PCoA 플롯(plot)으로 시각화하였다. Insomnia_orotype_input.csv 파일은 오로타입 분석을 위해 미가공 데이터(raw data)로 사용되었다.

1-9. 임상 검사 분석

정기적인 혈액 검사는 기준(baseline)이 되는 0주차와 6주차 CBD 투여 종료 시에 수행되었다. 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 헤모글로빈(Hb), 헤마토크리트(Hct), 혈소판(PLT), 호중구(NEU) 및 림프구(LYM)의 수치는 Sysmex XN 9000 혈액 분석기 (Sysmex, Inc. 일본)를 사용하여 측정되었다.

1-10. 통계적 분석

일반적으로, 연속 데이터(continuous data)는 independent two-sample t-test 또는 Wilcoxon rank sum test를 통해 평균과 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 범주형 데이터(Categorical data)는 Chi-square test 또는 Fisher's exact test에 의해 결정된 빈도와 백분율(%)을 의미한다. 대부분의 경우, 통계적 분석은 two-tailed test 방법에 근거하였다. 1차 종료점(endpoint)으로서 TST(total sleep time)에 대한 CBD 유효성의 통계적 평가는 데이터의 정규성(normality)에 따라 paired t-test 또는 Wilcoxon's signed-rank test를 사용하여 분석되었다. PSQI, ISI와 같은 수면 설문지, 심장 기능, 자율신경 기능, 혀 특징 및 구강 미생물 개체군을 포함하는 2차 종료점에 대한 통계적 시험은 1차 종료점 분석과 동일한 방식으로 수행되었다. 2차 종료점 간의 범주형 변수(categorical variables)는 Chi-square test 또는 Fisher`s exact test를 사용하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 위에서 언급한 1차 및 2차 종료점은 고정 인자로 그룹의 공분산 분석(analysis of covariance)과 공변량(covariate)으로서 기준선 측정을 사용하여 통계적으로 평가되었다. 또한, Pearson's correlation test 또는 Spearman's correlation test 는 심장 기능, 구강 미생물군 및 혀 특징 간의 통계적으로 유의미한 상관관계를 조사하는데 적용되었다. Fisher's discriminant analysis은 CBD 반응성의 예측 방정식을 개발하는데 사용되었다. ISI 점수가 기준치보다 30% 이상 감소한 것은 CBD에 반응하는 것으로 간주되었다. 속(genus) 수준의 여러 구강 미생물군은 독립 변수로 간주되었다. 통계적 분석은 SPSS 버전 20.0 통계 소프트웨어 패키지 (SPSS Inc., 미국)를 사용하여 수행되었다. P<0.05은 통계적으로 유의미하다고 간주되었다.

2. 결과

2-1. 피험자들의 기준 특성

초기에 피험자 61명에 대해 본 실험의 참여 여부를 심사하였다. 이 중에서 5명 (포함 기준 미이행 1명 및 개인사유 4명)은 제외되었다. 이에 따라, 총 56명의 대상자가 본 시험에 등록되었다. 이후 피험자를 두 그룹으로 나누었다. 불면증에 대한 TKM 패턴에 따라 17명은 HYD 그룹으로, 39명은 NHYD 그룹으로 나뉘었다. 실험 기간 동안, 본 실험과 관련이 없는 사유로 각 그룹에서 2명의 피험자가 중퇴하였다. 이로 인해, HYD 그룹에서 17명 중 15명 (88.24%)과 NHYD 그룹에서 39명 중 37명 (94.87%)이 본 실험을 마쳤다. 그러나 실험을 완료한 피험자 6명의 구강 미생물군 데이터는 설태 샘플량이 충분하지 않아 분석할 수 없었다 (도 1). 피험자의 기준 특성은 HYD 그룹이 NHYD 그룹에 비해 BDI와 ISI 점수가 현저히 높았다. 또한, HYD 그룹은 통계적으로 유의미한 차이는 아니었지만 NHYD 그룹에 비해 PSQI 점수와 맥박수가 더 높았다 (표 2).

변수	HYD (n=17)	NHYD (n=39)	P 값*
성별(남성/여성) (명)	2/15	7/32	0.707†
음주(예/아니오) (명)	5/12	16/23	0.409††
흡연(예/아니오) (명)	2/15	2/37	0.577†
카페인(예/아니오) (명)	10/7	22/17	0.867††
나이 (연령)	48.41 ± 9.49	51.38 ± 9.14	0.391
BMI (kg/m2)	23.22 ± 2.59	22.47 ± 2.60	0.325
BDI	15.65 ± 6.12	10.72 ± 5.80	0.007
ISI	20.94 ± 4.78	17.82 ± 5.00	0.034
PSQI	14.35 ± 2.94	12.56 ± 3.77	0.088
수축기 혈압 (mmHg)	121.41 ± 15.80	122.97 ± 12.73	0.696
이완기 혈압 (mmHg)	71.94 ± 11.32	73.69 ± 8.45	0.524
맥박수 (/분)	79.71 ± 11.08	74.82 ± 9.23	0.092
- 데이터 값은 평균±표준편차로 나타냈다. - HYD: 심음허, HYD: 비-심음허, BMI: 체질량 지수 *P값: Independent two sample t-test에서 얻은 값 †P값: Fisher exact test에서 얻은 값 ††P값: Pearson chi-square test에서 얻은 값

2-2. CBD에 의한 객관적 및 주관적 수면 질 향상

수면의 주관적인 패턴과 질을 분석하기 위해 피험자들은 설문지 PSQI와 ISI를 작성하였다. HYD 및 NHYD 그룹 모두 CBD 투여 6주차와 10주차에서 ISI와 PSQI 점수가 현저하게 하락하였다. ISI 점수는 6주간 CBD 투여에 대한 반응으로 HYD 그룹 (p<0.001)에서 평균 8.33점, NHYD그룹 (p<0.001)에서 평균 6.47점이 떨어졌다. 반면, 6주차에서, HYD 그룹은 NHYD 그룹에 비해 PSQI 점수 (p<0.05)가 현저히 낮은 것으로 나타났다. 구체적으로는, 이 시기에 PSQI 점수의 기준 값으로부터의 감소 크기는 NHYD 그룹 (평균 차이 3.53)에 비해 HYD 그룹 (평균 차이 6.00)에서 약 2배 더 높았다.

피험자들의 객관적인 수면 패턴과 질을 관찰하기 위해, 액티그래프를 착용하였다. TBT과 TST의 유의미한 증가 (p<0.05)는 6주간 CBD를 투여한 반응으로 HYD 그룹에서 나타났으나, NHYD 그룹은 그렇지 않았다. 이에 따라, 기준값에 대한 TBT와 TST의 상승 크기는 HYD 그룹이 NHYD 그룹에 비해 현저히 높았다 (p<0.01) (도 2).

2-3. CBD에 의한 설태 분포 변화

설태의 분포는 WTCI를 기반으로 평가되었다. 이 지수에서, 분할된 혀의 6개 하위영역 각각에 대해 설태의 양을 평가하였다. 6주간 CBD를 투여한 결과, A와 C 부위의 설태양은 HYD 그룹 (p<0.05)에서 현저하게 증가하였으나, NHYD 그룹에서는 그렇지 않았다 (도 3). CBD 투여에 의한 혀 본체의 평균 청색 값의 변화는 두 그룹 간에 현저한 차이가 있으며 (p=0.031) CBD가 투여되었을 때 HYD 그룹에서 전체 혀 영역 내 픽셀 수가 현저히 감소하였지만 (p=0.026) (표 3), 이러한 두 파라미터는 본 실험의 객관성과 관련되어 임상적으로 중요한 것은 아니다.

변수	HYD (n=15)			NHYD (n=37)			그룹간 P값§
	Week 0	Week 6	within††	Week 0	Week 6	within††
R_TB	164.69 ± 8.29	166.65 ± 7.47	0.326	167.72 ± 7.16	166.12 ± 7.13	0.234	0.146
G_TB	103.40 ± 7.89	106.25 ± 7.05	0.165	106.57 ± 6.42	104.84 ± 7.98	0.219	0.073
B_TB	97.08 ± 7.54	101.31 ± 6.62	0.094	100.08 ± 8.31	98.21 ± 7.93	0.212	0.031*
L_TB	50.22 ± 2.99	51.25 ± 2.59	0.174	51.43 ± 2.44	50.78 ± 2.76	0.206	0.073
a_TB	23.87 ± 1.73	23.56 ± 1.91	0.565	23.66 ± 2.01	23.77 ± 2.53	0.771	0.545
b_TB	13.89 ± 2.35	12.85 ± 3.01	0.130	13.86 ± 2.73	14.03 ± 2.81	0.686	0.125
R_TC	153.94 ± 15.50	151.40 ± 16.88	0.516	153.85 ± 21.71	157.74 ± 16.96	0.314	0.325
G_TC	117.88 ± 16.02	114.81 ± 16.92	0.446	119.38 ± 21.78	122.91 ± 17.73	0.340	0.298
B_TC	104.18 ± 18.05	102.05 ± 18.94	0.677	106.26 ± 24.07	110.46 ± 21.20	0.302	0.374
L_TC	52.67 ± 6.22	51.54 ± 6.71	0.473	53.04 ± 8.61	54.52 ± 6.89	0.320	0.303
a_TC	12.16 ± 1.05	12.59 ± 0.75	0.085	11.59 ± 1.24	11.75 ± 1.26	0.420	0.412
b_TC	13.04 ± 3.42	12.69 ± 3.47	0.687	12.46 ± 3.80	12.08 ± 3.92	0.524	0.972
Pixel_Tongue	31614.67 ± 5016.68	29889.53 ± 5112.64	0.026*	33587.27 ± 6335.98	32549.65 ± 5615.03	0.073	0.490
Pixel_TC	4199.80 ± 3218.68	4343.80 ± 2984.74	0.844	5223.03 ± 3866.47	4471.68 ± 3464.53	0.267	0.438
PTC	12.91 ± 9.23	14.51 ± 9.63	0.492	15.73 ± 12.33	13.89 ± 10.89	0.362	0.324
- 데이터 값은 평균±표준편차로 나타냈다. - R_TB: 혀 본체 영역 내 픽셀의 평균 적색 값, G_TB: 혀 본체 영역 내 픽셀의 평균 녹색 값, B_TB: 혀 본체 영역 내 픽셀의 평균 청색 값, L_TB: 혀 본체 영역 내 픽셀의 평균 CIE-밝기 값, a_TB: 혀 본체 영역 내 픽셀의 평균 CIE-적색 채도 값, b_TB: 혀 본체 영역 내 픽셀 평균 CIE-황색 채도 값, R_TC: 설태 영역 내 픽셀의 평균 적색 채도 값, G_TC: 설태 영역 내 픽셀의 평균 녹색 채도 값, B_TC: 설태 영역 내 픽셀의 평균 청색 채도 값, L_TC: 설태 영역 내 픽셀의 평균 CIE-밝기 값, a_TC: 설태 영역 내 픽셀의 평균 CIE-적색 채도 값, b_TC: 설태 영역 내 픽셀의 평균 CIE-황색 채도 값, Pixel_TC: 설태 영역 내 픽셀 수, PTC: 전체 혀 영역에 대한 설태 영역의 백분율. †P값: paired t-test에서 얻은 값 §P값: Mann-Whitney test 또는 independent t-test에서 얻은 값 *: p<0.05

2-4. CBD에 의한 경구 미생물군 변화

LefSe 평가의 두 가지 필수 측정 결과인 분지도(cladogram)와 LDA 점수는 HYD 그룹에 비해 NHYD 그룹에서 Corynebacterium, Porphyromonas, Capnocytophaga 및 Fusobacterium 속(genus)이 더 풍부한 것으로 나타났다. 반면, Atopobium, Lactobacillus 및 Veillonella 속은 NHYD 그룹에 비해 HYD 그룹에서 더 풍부하였다 (도 4).

16S rRNA 시퀀싱 데이터를 분석한 결과, NHYD 그룹과 HYD 그룹 모두에서 구강 미생물군의 알파 및 베타 다양성은 CBD 투여 전후가 유의미하게 다르지 않았다 (도 5). 강(class) 수준에서, Bacteroidia, Clostridia, Bacilli, Betaproteobacteria 및 Betaproteobacteria는 NHYD와 HYD 그룹 모두에서 가장 풍부한 경구 미생물군이였다. 속(genus) 수준에서, Prevotella, Veillonella, Streptococcus 및 Neisseria는 NHYD와 HYD 그룹 모두에서 가장 풍부한 구강 미생물이었다. 총체적으로, 구강 미생물 개체군(population)은 NHYD와 HYD 그룹 모두에서 CBD 투여 전후 간에 현저한 차이가 있었다. 그럼에도 불구하고, 강 수준에서의 Clostridia와 속 수준에서의 Veillonella의 풍부함은 NHYD 그룹에 비해 HYD 그룹에서 현저히 높았다 (p<0.05) (도 6).

2-5. 임상적 파라미터와 구강 미생물군의 상관관계

구강 미생물군의 16S rRNA 시퀀싱 데이터에 대한 Spearman's correlation 분석 결과, 문(phylum) 수준에서 가장 풍부한 미생물군 8개 중 Firmicutes는 PSQI, 이완기 혈압과 긍정적인 상관관계가 있으며 총 깨어난 빈도(total wake frequency, TWF)와 부정적인 상관관계가 있는 반면, Proteobacteria는 TWF와 긍정적인 상관관계가, PSQI, 맥박수와 부정적인 상관관계가 있는 것으로 나타났다. TM7의 풍부함은 수축기 및 이완기 혈압과 긍정적인 관계를 갖지만 설태의 황색 지표인 CIE-b*와 부정적인 상관관계를 보였다 (도 7a).

속 수준에서 풍부한 구강 미생물군 상위 34개 중 Veillonella와 Streptococcus는 PSQI와 긍정적인 상관관계를 보였으며, Neisseria는 PSQI와 부정적인 상관관계를 보였다. 또한, Veillonella의 풍부함은 이완기 혈압, CIE-a*와 긍정적인 상관관계를 가지고 있었다. 한편, Peptococcus와 Fusobacterium은 PSQI, WMT(mean wake time)과 부정적인 상관관계를 보였다. Selenomonas와 Leptotrichia는 자율신경계의 두 가지 활력 지수인 HFn과 부정적인, LFn과 긍정적인 상관관계가 있었다. 반면, Lautropia는 HFn과 긍정적인 상관관계를 보였으며, LFn, ISI와 부정적인 상관관계를 보였다. Porphyromonas는 PSQI, 맥박수와 부정적인 상관관계를, TST와 긍정적인 상관관계를 보였다. Gemella는 수축기 혈압, 이완기 혈압과 긍정적인 상관관계, 혀의 CIE-a*와 부정적인 상관관계를 보였다 (도 7b).

2-6. 심장 기능, 자율신경 기능 및 혈액 검사에 대한 CBD의 영향

심장 기능과 자율신경 기능은 NHYD 및 HYD 그룹간에서 차이가 없었으며, CBD 투여 전후에서도 차이가 없었다. 마찬가지로, CBD 투여에 대한 반응에서 두 그룹 간의 혈액 검사에서도 주목할만한 차이가 없었다.

2-7. 수면 질과 구강 균주에 따른 약물 반응 차이

피험자는 오로타입(orotype)에 기초한 하위그룹(subgroup) 분석을 통해 오로타입 1과 오로타입 2로 나뉘었다. CBD 투여 반응에서 오로타입 1과 오로타입 2 의 하위그룹 간 미생물 구성에는 큰 변화가 없었다. 그러나, 기준에서 Prevotella와 Veillonella 분류군의 상대적 풍부함은 오로타입 1이 오로타입 2에 비해 현저히 높았던 반면, Neisseria 분류군의 개체군은 오로타입 2가 오로타입 1에 비해 현저히 높았다 (도 8).

기준에서, 오로타입 1 내 피험자의 PSQI 점수와 맥박수는 오로타입 2에 비해 현저히 높았다 (표 4). 흥미롭게도, ISI와 PSQI 점수는 CBD 투여 6주차와 10주차에서 오로타입 1 및 오로타입 2의 하위그룹에서 모두 현저하게 하락하였다. 특히, 오로타입 1 내 PSQI 점수의 감소 크기 (평균 차이 5.55)는 오로타입 2 (평균 차이 3.46)에 비해 현저하게 컸다 (p=0.045) (도 9). 반면, 피험자들은 CBD 투여의 결과로 혀 특징, 심장 기능 및 자율 신경 기능에서 내부적으로 큰 차이를 보이지 않았다 (표 5).

특성	Orotype 1 (n=20)	Orotype 2 (n=26)	그룹간 P 값*
성별(남성/여성) (명)	3/17	4/22	1.000†
음주(예/아니오) (명)	8/12	8/18	0.515††
흡연(예/아니오) (명)	3/17	0/26	0.075†
카페인(예/아니오) (명)	13/7	15/11	0.615††
나이 (연령)	48.50 ± 11.95	51.08 ± 7.56	0.406
BMI (kg/m2)	22.92 ± 2.64	22.97 ± 2.07	0.945
BDI	14.10 ± 7.35	11.65 ± 5.71	0.227
ISI	19.55 ± 5.12	18.12 ± 5.71	0.382
PSQI	14.30 ± 3.26	11.69 ± 3.77	0.018*
수축기 혈압 (mmHg)	122.40 ± 15.00	116.19 ± 12.62	0.135
이완기 혈압 (mmHg)	74.60 ± 11.74	69.50 ± 8.33	0.092
맥박수 (/분)	77.50 ± 6.75	72.23 ± 9.77	0.036*
- 데이터 값은 평균±표준편차로 나타냈다. - BMI: 체질량 지수. *P값: Independent two sample t-test에서 얻은 값 †P값: Fisher exact test에서 얻은 값 ††P값: Pearson chi-square test에서 얻은 값

변수	Orotype 1 (n=20)			Orotype 2 (n=26)			그룹간 P값§
	Week 0	Week 6	within††	Week 0	Week 6	within††
L_TB	50.78 ± 2.76	51.49 ± 2.50	0.325	51.65 ± 2.39	50.96 ± 2.64	0.250	0.130
a_TB	23.65 ± 1.75	23.66 ± 2.20	0.978	23.63 ± 2.11	23.52 ± 2.65	0.806	0.861
L_TC	53.27 ± 8.19	53.22 ± 6.93	0.980	52.64 ± 8.17	55.27 ± 5.92	0.094	0.281
b_TC	12.08 ± 3.20	12.28 ± 3.44	0.847	12.73 ± 3.99	12.18 ± 4.04	0.322	0.493
PTC	16.84 ± 13.96	14.76 ± 11.16	0.505	14.15 ± 9.84	15.19 ± 10.52	0.579	0.365
수축기 혈압 (mmHg)	122.40 ± 15.00	120.85 ± 14.54	0.696	116.19 ± 12.62	120.19 ± 14.43	0.334	0.078
이완기 혈압(mmHg)	74.60 ± 11.74	73.55 ± 12.72	0.748	69.50 ± 8.33	73.77 ± 9.16	0.110	0.053
맥박수(/분)	77.50 ± 6.75	76.25 ± 9.84	0.666	72.23 ± 9.77	70.81 ± 6.62	0.502	0.954
평균 HRT (bpm)	73.90 ± 7.03	70.10 ± 9.99	0.225	68.27 ± 7.87	68.35 ± 8.35	0.974	0.129
심장 안정성	89.00 ± 15.11	91.05 ± 16.00	0.699	100.65 ± 18.33	97.58 ± 17.66	0.584	0.205
HFn (n.u.)	39.06 ± 21.16	45.45 ± 24.67	0.380	47.45 ± 23.39	47.91 ± 19.70	0.942	0.389
LFn (n.u.)	60.94 ± 21.16	54.55 ± 24.67	0.380	52.55 ± 23.40	52.10 ± 19.70	0.942	0.389
VLF (ms2)	434.27 ± 544.37	805.70 ± 1174.55	0.246	690.02 ± 1148.62	598.71 ± 606.51	0.732	0.186
LF/HF ratio	2.88 ± 3.26	3.26 ± 6.15	0.818	2.13 ± 2.58	1.67 ± 1.87	0.512	0.570
- 데이터 값은 평균±표준편차로 나타냈다. - L_TB: 혀 본체의 CIE-밝기, a_TB: 혀 본체의 CIE-적색 채도, L_TC: 설태의 CIE-밝기, b_TC: 설태의 CIE-황색 채도, PTC: 전체 혀 면적에 대한 설태의 백분율, HRT: 심박수, VLF: 초저주파(Very Low Frequency), LF/HF ratio: 저주파/고주파 비율. †P값: paired t-test에서 얻은 값 §P값: independent t-test에서 얻은 값 *: p<0.05

2-8. CBD 반응 예측 방정식

구강 미생물 데이터의 Fisher's discriminant analysis에 기초하여, Paludibacter, Selenomonas, Peptococcus, Peptostreptococcus 및 Gemella가 CBD 투여에 대한 반응을 예측하는 후보 속(genus)으로 확인되었다. ISI 점수의 감소는 CBD 반응의 근거로 간주되었다. 얻어진 예측 방정식은 다음과 같다:

상기 방정식에서, C는 ISI의 예측된 변화(Estimated change of ISI)를 의미한다.

상기 예측 방정식에서 도출된 분석 값이 1.8525 이상일 경우에는 이러한 구강 미생물 조성을 가진 불면증 환자가 CBD에 대해 반응, 즉 치료 효과가 있을 것을 예상될 수 있으며, 1.8525 미만일 경우에는 CBD에 반응, 즉 치료 효과가 없을 것으로 예상될 수 있다. 이때, 상기 방정식의 민감도(sensitivity)는 72.00%, 특이도(specificity)는 90.48%이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 팔루디박터(Paludibacter)속 균주, 셀레노모나스(Selenomonas)속 균주, 펩토코커스(Peptococcus)속 균주, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)속 균주 및 게멜라(Gemella)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측용 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
   
3. a) 불면증을 갖는 개체의 구강에서 생물학적 시료를 채취하는 단계;
   b) 상기 시료에서 팔루디박터(Paludibacter)속 균주, 셀레노모나스(Selenomonas)속 균주, 펩토코커스(Peptococcus)속 균주, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)속 균주 및 게멜라(Gemella)속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 구강 미생물을 측정하는 단계; 및
   c) 상기 측정된 미생물 검출량을 이용하여 불면증 치료제의 치료 효과를 예측하는 단계
   를 포함하는 불면증 치료제의 불면증 치료 효과 예측 방법.
   
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 a) 단계의 개체는 인간을 포함한 포유동물인 것인, 방법.
   
5. 청구항 3에 있어서,
   상기 a) 단계의 생물학적 시료는 구강 내 점막세포, 혈액, 혈장, 타액, 설태, 치석 및 이를 포함하는 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인, 방법.
   
6. 청구항 3에 있어서,
   상기 c) 단계는 미생물 검출량을 하기 수학식 1에 적용하여 계산된 값이 1.8525 이상일 경우, 불면증 치료제에 대해 치료 효과가 존재하는 것으로 예측하는 것인, 방법.
   [수학식 1]
   

   

   
   

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