KR20230116237A

KR20230116237A - 고혈압과 관련된 장내 미생물 마커의 선별 방법 및 이를 이용한 고혈압 위험도 측정 방법

Info

Publication number: KR20230116237A
Application number: KR1020220012915A
Authority: KR
Inventors: 기창석; 송주선; 윤성민; 남용석; 김정헌; 송경영; 함주연; 권민정
Original assignee: 주식회사 지씨지놈; 주식회사 코젠바이오텍; (의) 삼성의료재단
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2023-08-04

Abstract

본 발명은 장내 미생물을 이용한 고혈압과 관련된 장내 미생물 마커의 선별 방법 및 이를 이용한 고혈압 위험도 측정 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 장내 미생물 중 특정 종류의 미생물 복제수 비율을 계산하여 정상혈압군과 고혈압군에서 통계적으로 유의미하게 차이나는 장내미생물 비율을 고혈압과 연관된 장내미생물 마커로 선별하고, 이를 이용하여 고혈압 위험도를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 고혈압과 관련된 장내미생물 마커는 실시간 PCR을 통해 분석을 수행하여 분석 시간이 NGS 방법에 비해 짧으며, 혈압 측정 방법만을 이용하던 고혈압의 진단에 보조적인 진단 마커로 도움을 줄 수 있을 뿐 아니라, 고혈압을 예방하고 치료하기 위한 마이크로바이옴 기반 치료제의 개발에 응용될 수 있어 유용하다.

Description

고혈압과 관련된 장내 미생물 마커의 선별 방법 및 이를 이용한 고혈압 위험도 측정 방법{Method for Screening Intestinal Microbial Markers Associated with Hypertension and Predicting Hypertension Risk using the same}

본 발명은 장내 미생물을 이용한 고혈압과 관련된 장내 미생물 마커의 선별 방법 및 이를 이용한 고혈압 위험도 측정 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 장내 미생물 중 특정 종류의 미생물 복제수 비율을 계산하여 정상혈압군과 고혈압군에서 통계적으로 유의미하게 차이나는 장내미생물 비율을 고혈압과 연관된 장내미생물 마커로 선별하고, 이를 이용하여 고혈압 위험도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

고혈압은 혈압이 만성적으로 높은 상태를 말하며, 구체적인 고혈압 상태는 수축기 혈압이 140 mmHg 이상이거나, 이완기 혈압이 90 mmHg 이상인 경우를 말한다. 고혈압 상태가 지속되면, 심장질환, 뇌졸중, 신부전증 등과 같은 합병증을 일으키고, 이러한 합병증은 건강 상태를 악화하여 조기 사망과 장애의 원인이 된다. 특히, 고혈압에 의해 유발되는 죽상동맥경화증은 세계적으로 높은 사망률을 가지는 질환으로 알려졌으며, 국내에서도 사망원인 2, 3위를 차지할 정도로 위험한 질환이다. 따라서 고혈압을 진단하는 것은 사망률이 높은 합병증을 예방하는데 중요하며, 고혈압의 예방은 사회적·공중 위생학적으로 중요한 일이다.

고혈압의 90%의 대부분을 차지하는 일차성 고혈압(본태성 고혈압)의 원인은 아직 확실치 않지만, 종족, 나이, 가족력, 비만, 운동부족, 흡연, 식생활 등 여러 가지 많은 요인들이 모여 질병을 발생시키며, 이차성 고혈압은 10%를 차지하는데 내분비계 질환, 대동맥 협착증, 신장 질환, 약물 등의 특정한 원인에 의해 발병된다고 보고되었다.

한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자 수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통화하여 우리 몸에 흡수된다.

환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다(대한민국 특허 제2011-0073049호). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) platform을 이용하여 분석한다.

최근에는 이러한 메타게놈 분석을 통해, Faecalibacterium prausnitzii의 비율이 정상인에서 높다거나(Yan Q et al., Front. Cell. Infec. Microbiology, Vol. 7, pp. 381-390, 2017), 비만 중국인에서, Faecalibacterium prausnitzii 의 비율이 정상인에 비해 감소한다는 점이 보고 되었으나 (Yan Q et al., Front. Cell. Infec. Microbiology, Vol. 7, pp. 381-390, 2017), 실시간 PCR 검사 방법을 통한 고혈압과 관련이 있는 특정 장내 미생물 마커와 이의 고혈압 진단 정확도에 대해서는 확인된 바가 없다.

이에 본 출원의 발명자들은 고혈압과 관련된 장내 미생물 마커를 실시간 PCR 검사 방법으로 검출하기 위해 예의 노력한 결과, 실시간 PCR 검사에서 특정 장내 미생물의 비율이 정상혈압군과 고혈압군에서 유의미한 차이가 있음을 확인하였고, 이 비율이 고혈압 위험도와 높은 연관성이 있을 뿐만 아니라, 높은 정확도로 고혈압을 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 선별방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용한 고혈압 위험도 측정을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커를 이용한 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 장내 미생물 마커 기반 고혈압 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 (a) 정상 및 고혈압 샘플의 생체시료에서 핵산을 추출하여, 비피토박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminis), 페칼리박테리움 프라우스니치(Faecalibacterium prausnitzii), 유박테리움 할리(Eubacterium hallii) 및 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)으로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 장내 미생물의 복제수를 측정하는 단계; (b) 각 장내 미생물 복제수의 비율을 계산하는 단계; 및 (c) 계산한 비율이 정상 및 고혈압 샘플 사이에서 통계적으로 유의미한 차이가 있을 경우, 고혈압 관련 장내 미생물 마커로 선별하는 단계;

를 포함하는 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 선별방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 선별한 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율을 생체시료에서 핵산을 추출하여 계산하는 단계; 및 (b) 계산한 비율이 기준값 보다 높을수록 고혈압 위험도가 증가하는 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 고혈압 위험도 측정을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 선별한 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율을 생체시료에서 핵산을 추출하여 계산하는 단계; 및 (b) 계산한 비율이 기준값을 초과할 경우, 고혈압인 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (ii) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (iii) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (iv) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및 (v) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 으로 구성되는 군에서 선택되는 2 이상의 프라이머 쌍 및; (vi) 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 프로브; 를 포함하는 장내 미생물 마커 기반 고혈압 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 고혈압 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 고혈압과 관련된 장내미생물 마커는 실시간 PCR을 통해 분석을 수행하여 분석 시간이 NGS 방법에 비해 짧으며, 혈압 측정 방법만을 이용하던 고혈압의 진단에 보조적인 진단 마커로 도움을 줄 수 있을 뿐 아니라, 고혈압을 예방하고 치료하기 위한 마이크로바이옴 기반 치료제의 개발에 응용될 수 있어 유용하다.

도 1은 본 발명에서 고혈압과 관련된 장내미생물 마커의 검출 과정과 검출한 마커의 고혈압 진단 정확도를 확인하는 과정의 개요를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 개발한 장내 미생물 마커를 정상혈압군과 고혈압 환자에서 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 개발한 장내 미생물 마커의 고혈압 진단 정확도를 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라, 작성한 표적 균주별 표준곡선으로, (A)는 F. prausnitzii 이고, (B)는 L. ruminis 이며, (C)는 B. adolescentis 균주이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라, 작성한 표적 균주별 표준곡선으로, (A)는 E. hallii 이며, (B)는 B. thetaiotaomicron 균주이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 고혈압과 관련된 장내 미생물 마커를 검출하고 해당 마커의 고혈압 위험도 측정 및 진단 정확도를 확인하고자 하였다.

본 발명에서는 다양한 장내 미생물의 복제수를 측정하고, 복제수의 비율을 정상혈압군과 고혈압군에서 비교한 다음, 통계적으로 유의한 차이를 보이는 장내미생물 비율에 대해 고혈압 위험도 측정 및 진단 정확도를 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 남성 16S 대변미생물총 데이터의 선형판별분석을 통해 확인된 Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus ruminis, Faecalibacterium prausnitzii와 문헌조사를 통하여 고혈압과 관련된 것으로 알려진 Eubacterium hallii, Bacteroides thetaiotamicron을 마커로 선별한 다음, 남성 BMI 25 미만 그룹(그룹 I) 및 남성 BMI 25 이상인 (그룹 II)에서 real-time PCR을 이용하여 상기 미생물들의 대변 검체 내 복제수 비율을 모두 계산하고 이를 정상혈압군과 고혈압군에서 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보이는 특정 장내미생물의 복제수 비율을 확인하였으며, 해당 비율값이 높은 정확도로 고혈압을 예측할 수 있다는 것을 확인하였다(도 2, 도 3).

따라서, 본 발명은 일 관점에서,

다음의 단계를 포함하는 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 선별방법에 관한 것이다:

(a) 정상 및 고혈압 샘플의 생체시료에서 핵산을 추출하여, 비피토박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminis), 페칼리박테리움 프라우스니치(Faecalibacterium prausnitzii), 유박테리움 할리(Eubacterium hallii) 및 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)의 복제수를 측정하는 단계;

(b) 각 장내 미생물 사이의 복제수 비율을 계산하는 단계; 및

(c) 계산한 비율이 정상 및 고혈압 샘플 사이에서 통계적으로 유의미한 차이가 있을 경우, 고혈압 관련 장내 미생물 마커로 선별하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), (혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 대변(stool), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract), 정액, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포, 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 및 이의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는,

(i) 추출된 핵산을 이용하여 16s rRNA 유전자에 대한 real-time PCR을 수행하는 단계; 및

(ii) Ct 값을 기반으로 복제수를 계산하는 단계;

를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

나아가, 상기 복제수 확인 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (ii) 단계는 하기 수식으로 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다:

수식 3) F. prausnitzii 복제수: 10^{(샘플의 ct값-39.925)/3.4374}

수식 4) L. ruminis 복제수: 10^{(샘플의 ct값-39.949)/3.4044}

수식 5) B. adolescentis 복제수: 10^{(샘플의 ct값-38.459)/3.4292}

수식 6) E. hallii 복제수: 10^{(샘플의 ct값-41.287)/3.326}

수식 7) B. thetaiotaomicron 복제수: 10^{(샘플의 ct값-43.205)/3.8721}

본 발명에 있어서, 상기 장내 미생물 복제수의 비율은

(1) 비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;

(2) 비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수/락토바실러스 루미니스의 복제수;

(3) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수

(4) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/유박테리움 할리의 복제수;

(5) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;

(6) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/ 락토바실러스 루미니스의 복제수;

(7) 유박테리움 할리의 복제수/비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수;

(8) 유박테리움 할리의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;

(9) 유박테리움 할리의 복제수/ 락토바실러스 루미니스의 복제수; 및

(10) 락토바실러스 루미니스의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;

로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 체질량지수(BMI)가 25 이상인 남성에서 유래한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 통계적으로 유의미한 차이는 정상과 고혈압을 구별할 수 있는 값이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 P-value가 0.01 내지 0.08, 더욱 바람직하게는 0.06 내지 0.07, 가장 바람직하게는 0.068일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 고혈압은 혈압이 정상에 비해 높은 상태이면 제한없이 가능하며, 바람직하게 수축기 혈압 140mmHg 이상, 이완기 혈압 90mmHg 이상이 유지되는 상태인 2기 고혈압일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 고혈압은 장내 미생물의 불균형에 의해 발생한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서,

(a) 상기 방법으로 선별한 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율을 생체시료에서 핵산을 추출하여 계산하는 단계; 및

(b) 계산한 비율이 기준값 보다 높을수록 고혈압 위험도가 증가하는 것으로 판정하는 단계;

를 포함하는 고혈압 위험도 측정을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율은 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 기준값은 0.4 내지 2 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 고혈압 위험도 측정을 위한 정보의 제공방법은

상기 계산한 비율이 0.4 이하일 경우 저위험군;

0.4를 초과하고 15 이하인 경우에는 중증도 위험군; 및

15를 초과할 경우에는 고위험군으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(b) 계산한 비율이 기준값을 초과할 경우, 고혈압인 것으로 판정하는 단계;

를 포함하는 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 기준값은 0.4 내지 2인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법은

상기 계산한 비율이 0.4 이하일 경우 저위험군;

0.4를 초과하고 15 이하인 경우에는 중증도 위험군; 및

본 발명에서 고혈압 진단은 해당 생체시료를 제공한 환자의 고혈압 유무를 판정하는 것뿐만 아니라, 해당 생체시료를 제공한 환자가 현재는 정상이더라도, 추후 고혈압 환자로 발생할 가능성이 높은 고혈압 위험군인지를 판정할 수 있는 고혈압 위험군 진단 방법을 모두 포함한다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;

(ii) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;

(iii) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;

(iv) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및

(v) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;

으로 구성되는 군에서 선택되는 2 이상의 프라이머 쌍 및;

(vi) 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 프로브;

를 포함하는 장내 미생물 마커 기반 고혈압 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "프로브"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, LNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 장내 미생물 마커 기반 고혈압 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼(buffer), DNA 중합효소(DNA polymerase), DNA 중합효소 조인자(DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP)와 같은 핵산 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 분자, 역전사효소(reverse transcriptase), 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서의 기재사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기 및 프라이머 또는 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.

상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 16S 데이터 분석을 통한 장내 미생물 후보군 선정

고혈압은 남성에서 특히 호발한다고 알려져 있고, BMI는 대표적인 고혈압의 risk factor로 알려져 있어 비만하지 않은 남성에서의 장내미생물 고혈압 marker와 비만한 남성에서의 고혈압 marker가 다를 것으로 예상하였다.

먼저 남성 건강검진 수진자들 중 66명의 정상혈압군과 stage 2 고혈압군으로 구성된 남성 건강검진 수진자들을 대상으로 16S rDNA V4 amplicon sequencing 방법으로 장내미생물총 데이터를 분석하였고, 일반적으로 비만을 판단하는 기준인 BMI 25를 기준으로 BMI<25 그룹과 BMI≥25 그룹을 나눈 뒤 각 그룹에서 선형판별분석(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy, access date: 27 October 2020)을 진행하여 BMI<25 그룹에서 로그판별분석점수가 4를 넘으면서 정상혈압군에 풍부한 균종 Bifidobacterium, Lactobacillus과 BMI≥25 그룹에서 로그판별분석점수가 4를 넘으면서 정상혈압군에 풍부한 균종 Faecalibacterium을 선별하였다.

Bifidobacterium, Lactobacillus, Faecalibacterium 중 고혈압과 관련이 있다고 보고된 바 있는 Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus ruminis, Faecalibacterium prausnitzii와 문헌조사를 통하여 고혈압과 관련된 것으로 알려진 Eubacterium hallii, Bacteroides thetaiotamicron을 최종적인 실시간 PCR 마커로 선별하였다.

실시예 2. 임상 샘플에서 마커를 이용한 미생물 별 비율 계산

2-1 Real-Time PCR 용 프라이머 및 프로브 설계

실시예 1에서 선정한 장내 미생물 특이적 유전자를 증폭하기 위해 하기 표 1 및 표 2에 기재된 바와 같은 각 장내 미생물 검출용 프라이머와 프로브를 설계하였다.

Tube 1

Target analyte	서열 번호	Primer/probe	Sequence (5'→3')
Faecalibacterium prausnitzii (16s rRNA)	1	Forward	ATGACGGTACTCAACAAGGAAGTGA
	2	Reverse	CGCTCCCTTTACACCCAGTAAT
	3	Probe	FAM- CGGTAAAACGTAGGTCACAAGCGTTGTCC -BHQ
Lactobacillus ruminis (16s rRNA)	4	Forward	AGAAGGCCTTCGGGTCGTA
	5	Reverse	CACGTAGTTAGCCGTGGCT
	6	Probe	VIC- TCAGATACCGTCAATACGTGAA -MGB
Bifidobacterium adolescentis (23s rRNA)	7	Forward	GTTTGACGTCTAACCTCGACA
	8	Reverse	CAACCGCCCCAGTTGAACT
	9	Probe	Cal610- CCAGGCACTGTCCCTGACAAGGATGA -BHQ2

Tube 2

Target analyte	서열 번호	Primer/probe	Sequence (5'→3')
Eubacterium hallii (16s rRNA)	10	Forward	CGTGCTACAATGGCGGTCA
	11	Reverse	TAGTCGGGTTGCAGACTACA
	12	Probe	FAM- AACTGGGACGGCCTT -MGB
Bacteroides thetaiotaomicron (16s rRNA)	13	Forward	AATAAATCATAAGGAACACCTCCTTTCTGGAG
	14	Reverse	AATAAATCATAATCTATACTTCTATAGATGGTTGATCT
	15	Probe	Cal610- CAAGTACCAGTAGTACAATAA -MGB

2-2 복제수 계산

일반적으로 비만을 판단하는 기준인 BMI 25를 기준으로 남성, BMI<25인 그룹(집단 1)과 남성, BMI≥25인 그룹(집단 2)으로 나누어(표 5) 각 그룹별로 실시예 1에서 선별한 미생물의 복제수를 측정하였다.

즉, 남성 66명의 대변 샘플에서 Chemagic DNA stool kit(PerkinEimer, USA)를 이용하여 장내 미생물의 DNA를 추출하여 농도를 측정하고, 실시예 2-1의 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 CFX96 Real-time PCR System(Biorad, USA)에서 시험하였고, 결과 Ct값과 농도를 이용하여 장내 미생물 균총 분석(ng 당 copy number 측정)을 실시하였다.

보다 구체적으로는 Real-Time PCR 검사는 1) 반응액 제조와 2) PCR 반응으로 나눠서 진행하였다. 실험에 사용된 Real-Time PCR Premix와 Primer/Probe Mix는 자체 제조하였으며, Primer와 Probe의 농도는 각각 900 nM과 250 nM 이다. 반응액 제조는 표 3과 같이 구성하여 최종 20 uL PCR 반응액을 완성하였다.

실험 조성

반응액 제조	Component	Volume (μL)
	Real-time PCR Premix	10
	Primer/Probe Mix	5
	Template	5
	Total	20

PCR 반응은 Bio-Rad의 CFX 96 장비를 사용하여 진행하였으며, 온도와 시간 조건은 표 4와 같이 정리할 수 있다.

반응 조건

PCR 조건	Temp. (℃	Time	Cycle
	50	2 min	1
	95	10 min	1
	95	15 sec	40
	60	60 sec	40

특정 미생물을 확인하는 프로브의 형광값은 실시간증폭반응이 일어나는 60도에서 1분 동안 40회 반복하여 측정하였다.

	남성, BMI < 25 (group I)	남성, BMI ≥ 25(group II)
정상군	22	11
Stage 2* 고혈압군	19	14

* Stage 2 고혈압: SBP≥140mmHg 또는 DBP≥90mmHg 인 상태를 의미한다(Paul K et al., Hypertension, Vol.71(6), e13-e115, 2018).

보다 자세하게는 우선, 복제수를 알고 있는 표적 균주별 증폭용 표적핵산 플라스미드를 이용하여 각 표적 균주별로 농도별 Ct값을 기반으로 표준곡선을 작성한 결과, 표준곡선의 선형도(R²) 값이 0.99이상인 것을 확인하였으며(도 4 및 도 5), 하기 수식 1로 프라이머/프로브 세트의 PCR 효율을 계산한 결과, 표 6에 기재된 바와 같이 각 샘플의 PCR 효율이 95%이상으로 분석에 적합한 것을 확인하였다.

수식 1: 증폭 효율 (%) = 10^(-1/slope)-1 X 100%

PCR 효율 결과	F. prausnitzii	L. ruminis	B. adolescentis	E. hallii	B. thetaiotaomicron
증폭배수	1.95	1.97	1.96	2.00	1.81
증폭효율	95.4	96.7	95.7	99.8	81.2
R²	0.9984	0.9986	0.9996	0.9955	0.9997

그런 다음, 수득한 샘플별 Ct 값을 이용하여 하기 수식 2로 샘플당 표적 균주의 복제수를 계산하였으며, 이를 샘플별 핵산 농도(ng/uL)로 나누어 1ng 당 표적 균주의 복제수를 결정하였다.

수식 2:

샘플 내 표적 균주의 복제수=10^{(샘플의 ct값-표준곡선 y절편 값)/(표준곡선 기울기 값)}

더욱 구체적으로는 각 표적 균주의 복제수는 하기 수식으로 계산하였다.

수식 3) F. prausnitzii 복제수: 10^{(샘플의 ct값-39.925)/3.4374}

수식 4) L. ruminis 복제수: 10^{(샘플의 ct값-39.949)/3.4044}

수식 5) B. adolescentis 복제수: 10^{(샘플의 ct값-38.459)/3.4292}

수식 6) E. hallii 복제수: 10^{(샘플의 ct값-41.287)/3.326}

수식 7) B. thetaiotaomicron 복제수: 10^{(샘플의 ct값-43.205)/3.8721}

2-3. 비율 계산 및 통계 분석

복제수가 검출되지 않은 0값에 대해서는 copy 수에 pseudocounts인 1을 더한 다음, 선별한 다섯 가지 균종에 대하여 모든 경우의 비율을 계산하였다(총 10가지). 그 뒤, 각 비율을 이용하여 정상혈압군, 고혈압군에 대한 비모수검정(Wilcoxon test)을 진행하였다.

그 결과, 표 7 및 표 8에 기재된 바와 같이, 집단 1의 33명을 대상으로 정상혈압군과 stage 2 고혈압군의 각 균종별 비율을 분석한 결과, 통계적으로 유의하게 차이를 보이는 균종 비율은 확인되지 않는 반면, 집단 2의 33명을 대상으로 정상군과 stage 2 고혈압군의 각 균종별 비율을 분석한 결과, 통계적으로 유의하게 차이를 보이는 한 개 균종 비율(B.thetaiotaomicron_div_F.prausnitzii)을 확인하였다.

아울러, 도 2에 기재된 바와 같이, 상기 균종의 비율값이 정상군과 stag2 고혈압군에서 통계적으로 유의하게 차이가 나는 것을 확인하였다.

2-4. AUC 계산

집단 2 내에서 통계적으로 유의한 B.thetaiotaomicron / F.prausnitzii 복제수 비율값을 이용하여 ROC curve를 확인한 결과,

도 3에 기재된 바와 같이, cutoff 값이 0.068일 경우 specificity = 0.789, sensitivity = 0.714가 되는 것을 확인하였으며, 이때 AUC는 0.774이다.

실시예 3. 장내 미생물 마커를 이용한 고혈압 위험도 측정

실시예 2의 분석방법으로 B. thetaiotaomicron 의 복제 수와 F. prausnitzii 의 복제 수를 정상군 25명과 고혈압군 37명(BMI 25 초과 남성)으로부터 측정하여 B. thetaiotaomicron / F. prausnitzii 의 비율을 확인하였다.

B. thetaiotaomicron / F. prausnitzii 의 비율값은 0.04 ~ 63.17의 분포를 나타냈으며 누적백분위로 12.5 %에 해당하는 Cut-off는 0.4, 50 %에 해당하는 Cut-off는 1.9, 87.5 %에 해당하는 Cut-off는 15.1이었다. 누적백분위 12.5 %, 50 %, 87.5 %의 Cut-off값으로 나누었을 때의 정상군과 고혈압군의 비율은 하기 표 9와 같이 나타낼 수 있었다.

*B. thetaiotaomicron* / *F. prausnitzii* Ratio	정상군 (n=25)	고혈압군 (n=37)
< 0.40 (n=8)	7 (28.0 %)	1 (2.7 %)
0.40-1.89 (n=23)	9 (36.0 %)	14 (37.8 %)
1.90-15.09 (n=23)	8 (32.0 %)	15 (40.5 %)
≥15.10 (n=8)	1 (4.0 %)	7 (18.9 %)

B. thetaiotaomicron / F. prausnitzii 의 비율이 0.4 미만인 군을 기준으로 하여 위험도를 로지스틱 회귀분석법을 사용하여 오즈비 (Odds Ratio; OR) 로 계산한 결과, 비율이 0.40-1.89인 군은 OR = 10.89 (95 % CI: 1.14-103.98; P=0.04) 의 값, 비율이 1.90-15.09인 군은 OR = 13.13 (95 % CI: 1.36-126.31; P=0.03) 의 값, 비율이 ≥15.10인 군은 OR = 49.00 (95% CI: 2.53-948.67; P=0.01) 의 값을 확인하였다.

즉 B. thetaiotaomicron / F. prausnitzii 의 비율이 높아질수록 고혈압의 위험도가 통계적으로 유의미하게 증가하는 것을 확인하였으므로 이는 고혈압의 위험도를 평가하는 중요한 마커인 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Green Cross Genome Corporation KoGene BioTech Co., LTD Samsung Medical Center <120> Method for Screening Intestinal Microbial Markers Associated with Hypertension and Predicting Hypertension Risk using the same <130> P21-B031 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Faecalibacterium prausnitzii_F <400> 1 atgacggtac tcaacaagga agtga 25 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Faecalibacterium prausnitzii_R <400> 2 cgctcccttt acacccagta at 22 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Faecalibacterium prausnitzii_Probe <400> 3 cggtaaaacg taggtcacaa gcgttgtcc 29 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus ruminis_F <400> 4 agaaggcctt cgggtcgta 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus ruminis_R <400> 5 cacgtagtta gccgtggct 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus ruminis_Probe <400> 6 tcagataccg tcaatacgtg aa 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium adolescentis_F <400> 7 gtttgacgtc taacctcgac a 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium adolescentis_R <400> 8 caaccgcccc agttgaact 19 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium adolescentis_Probe <400> 9 ccaggcactg tccctgacaa ggatga 26 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eubacterium hallii_F <400> 10 cgtgctacaa tggcggtca 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eubacterium hallii_R <400> 11 tagtcgggtt gcagactaca 20 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eubacterium hallii_Probe <400> 12 aactgggacg gcctt 15 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides thetaiotaomicron_F <400> 13 aataaatcat aaggaacacc tcctttctgg ag 32 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides thetaiotaomicron_R <400> 14 aataaatcat aatctatact tctatagatg gttgatct 38 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides thetaiotaomicron_Probe <400> 15 caagtaccag tagtacaata a 21

Claims

다음의 단계를 포함하는 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 선별방법:
(a) 정상 및 고혈압 샘플의 생체시료에서 핵산을 추출하여, 비피토박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminis), 페칼리박테리움 프라우스니치(Faecalibacterium prausnitzii), 유박테리움 할리(Eubacterium hallii) 및 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)의 복제수를 측정하는 단계;
(b) 각 장내 미생물 사이의 복제수 비율을 계산하는 단계; 및
(c) 계산한 비율이 정상 및 고혈압 샘플 사이에서 통계적으로 유의미한 차이가 있을 경우, 고혈압 관련 장내 미생물 마커로 선별하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 소변, 대변, 정액, 눈물, 림프액 및 타액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 선별방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 선별방법:
(i) 추출된 핵산을 이용하여 16s rRNA 또는 23s rRNA 유전자에 대한 real-time PCR을 수행하는 단계; 및
(ii) Ct 값을 기반으로 복제수를 계산하는 단계.
제3항에 있어서, 상기 (ii) 단계는 하기 수식으로 계산하는 것을 특징으로 하는 선별방법:
수식 3) F. prausnitzii 복제수: 10^{(샘플의 ct값-39.925)/3.4374}
수식 4) L. ruminis 복제수: 10^{(샘플의 ct값-39.949)/3.4044}
수식 5) B. adolescentis 복제수: 10^{(샘플의 ct값-38.459)/3.4292}
수식 6) E. hallii 복제수: 10^{(샘플의 ct값-41.287)/3.326}
수식 7) B. thetaiotaomicron 복제수: 10^{(샘플의 ct값-43.205)/3.8721}
제1항에 있어서, 상기 장내 미생물 사이의 복제수 비율은,
(1) 비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;
(2) 비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수/락토바실러스 루미니스의 복제수;
(3) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수
(4) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/유박테리움 할리의 복제수;
(5) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;
(6) 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/ 락토바실러스 루미니스의 복제수;
(7) 유박테리움 할리의 복제수/비피토박테리움 아돌레센티스의 복제수;
(8) 유박테리움 할리의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;
(9) 유박테리움 할리의 복제수/ 락토바실러스 루미니스의 복제수; 및
(10) 락토바실러스 루미니스의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수;
인 것을 특징으로 하는 선별방법.
제1항에 있어서, 상기 고혈압 샘플의 생체시료는 체질량지수(BMI)가 25 이상인 남성에서 유래한 것을 특징으로 하는 선별방법.
제1항에 있어서, 상기 통계적으로 유의미한 차이는 P-value가 0.01 내지0.08 이하인 것을 특징으로 하는 선별방법.
제1항에 있어서, 상기 고혈압은 2기 고혈압인 것을 특징으로 하는 선별방법.
다음의 단계를 포함하는 고혈압 위험도 측정을 위한 정보의 제공방법:
(a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 선별한 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율을 생체시료에서 핵산을 추출하여 계산하는 단계; 및
(b) 계산한 비율이 기준값 보다 높을수록 고혈압 위험도가 증가하는 것으로 판정하는 단계;
제9항에 있어서, 상기 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율은 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수인 것을 특징으로 하는 고혈압 위험도 측정을 위한 정보의 제공방법.
제9항에 있어서, 상기 기준값은 0.4 내지 2인 것을 특징으로 하는 정보의 제공방법.
제9항에 있어서,
상기 계산한 비율이 0.4 이하일 경우 저위험군;
0.4를 초과하고 15 이하인 경우에는 중증도 위험군; 및
15를 초과할 경우에는 고위험군으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압 위험도 측정을 위한 정보의 제공방법.
다음의 단계를 포함하는 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법:
(a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 선별한 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율을 생체시료에서 핵산을 추출하여 계산하는 단계; 및
(b) 계산한 비율이 기준값을 초과할 경우, 고혈압인 것으로 판정하는 단계;
제13항에 있어서, 상기 고혈압 관련 장내 미생물 마커의 복제수 비율은 박테로이데스 테타이오타오미크론의 복제수/페칼리박테리움 프라우스니치의 복제수인 것을 특징으로 하는 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법.
제13항에 있어서, 상기 기준값은 0.4 내지 2 인 것을 특징으로 하는 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법
제13항에 있어서,
상기 계산한 비율이 0.4 이하일 경우 저위험군;
0.4를 초과하고 15 이하인 경우에는 중증도 위험군; 및
15를 초과할 경우에는 고위험군으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압 진단을 위한 정보의 제공방법.
(i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(v) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
으로 구성되는 군에서 선택되는 2 이상의 프라이머 쌍 및;
(vi) 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 프로브;
를 포함하는 장내 미생물 마커 기반 고혈압 진단용 조성물.
제15항의 조성물을 포함하는 장내 미생물 마커 기반 고혈압 진단용 키트.