KR20230146379A - 마이크로바이옴을 이용하여 당뇨족부궤양 예후를 예측하는 방법 - Google Patents
마이크로바이옴을 이용하여 당뇨족부궤양 예후를 예측하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis) 및 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense)로 이루어진 미생물을 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 조성물, 키트, 및 정보제공방법 등에 관한 것으로서, 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 환자로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양을 진단받은 환자로부터 분리된 시료에서 박테로이데스 유니포르미스의 수준이 높거나 코리네박테리움 두사넨스의 수준이 낮은 경우, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다. 본 발명은 환자의 마이크로바이옴 분석을 통해 당뇨족부궤양의 예후를 조기에 예측하여 즉각적인 치료가 가능하며, 감염 또는 괴사로의 진행을 최소화함으로써 환자 개개인의 맞춤형 진단 플랫폼을 구축할 수 있다.
Description
본 발명은 마이크로바이옴을 이용하여 당뇨족부궤양 예후를 예측하는 방법 등에 관한 것이다.
당뇨병은 전 세계 4억 명이 넘는 유병률을 보이며, 당뇨병이 발생하면 혈액의 점성이 높아져 점차 혈관이 좁아지거나 막히게 되며, 이 때 하지로 가는 혈관이 좁아지거나 막히면 발은 혈액을 충분히 공급받지 못하게 되어, 혈액을 통한 영양분이나 산소의 공급이 원활하지 않고, 노폐물의 이동과 배출이 어려워, 궤양이 발생하기 쉬운 환경이 조성된다. 따라서, 당뇨병 환자 중 약 15~25%는 일생 중 일정 지점에서 족부궤양이 발병되며, 당뇨병 자체가 상처 치유를 지연시키기 때문에 족부궤양이 한 번 발병하면 자가 회복이 더딘 편이다. 국내에서도 한 해 10만 명 이상의 환자가 당뇨족부궤양으로 하지 절단을 한다. 일생동안 족부궤양을 앓을 가능성은 약 20%이지만 치료가 쉽지 않으며 막대한 사회경제적 비용이 초래된다.
당뇨족부궤양은 병태생리와 진단, 치료가 매우 복잡하기 때문에 예후가 매우 좋지 않다. 4대 요소인 혈액순환부전, 감염, 당뇨신경병증, 세포들의 기능 감소를 모두 고려해서 치료를 해야 한다. 이 중 균주에 대해 정통적 배양 검사를 통하여 그에 맞는 항생제를 투여하는 대중적 치료 방법에 의해서 이루어지고 있지만 완전한 치유에 도움이 되지 못하고 있다. 당뇨족부궤양 부위의 감염은 84%가 복합감염이며, 바이오필름의 존재로 균의 박멸이 매우 어려워 재발의 위험이 높아 완치가 되기 어렵다.
본 발명은 유전체 분석, 머신러닝 기법을 기반으로 체내 마이크로바이옴(microbiome) 구성 환경과 당뇨족부궤양 치료간 상관관계를 분석하고, 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis) 및 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense)가 예후가 나쁜 당뇨족부궤양 환자에서 각각 특이적으로 과발현 및 저발현된다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis) 및 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense)로 이루어진 미생물을 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 미생물; 및 상기 미생물 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 조성물과 이를 포함하는 당뇨족부궤양 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 당뇨족부궤양 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물을 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물; 및 상기 미생물 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 미생물의 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 미생물의 16s rRNA에 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 LNA(Locked Nucleic Acids)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 박테로이데스 유니포르미스는 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양의 예후가 나쁜 개체로부터 분리된 시료에서 미생물 수준이 높은 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 코리네박테리움 두사넨스는 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양의 예후가 나쁜 개체로부터 분리된 시료에서 미생물 수준이 낮은 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 당뇨족부궤양 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
(1) 당뇨족부궤양을 진단받은 환자로부터 시료를 분리하는 단계;
(2) 상기 시료에서 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물의 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 미생물 수준을 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료의 미생물 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (3)단계 이후에 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양을 진단받은 개체로부터 분리된 시료에서 박테로이데스 유니포르미스의 수준이 높은 경우, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (3)단계 이후에 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양을 진단받은 개체로부터 분리된 시료에서 코리네박테리움 두사넨스의 수준이 낮은 경우, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 시료는 당뇨족부궤양을 진단받은 개체의 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 미생물의 수준을 측정하는 단계는 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 당뇨족부궤양 예후 예측용 바이오마커의 선별 방법을 제공한다.
(1) 당뇨족부궤양 치료 후 예후가 좋은 개체와 예후가 나쁜 개체로부터 각각 시료를 분리하는 단계;
(2) 상기 시료로부터 얻은 미생물의 16s rRNA 유전 정보를 분석하여, 미생물을 종(species) 단위로 동정하고, 상기 동정된 미생물의 군집 내 풍부도(abundance)를 분석하는 단계; 및
(3) 상기 분석 결과를 이용하여 당뇨족부궤양의 예후와 관련이 있는 미생물을 선별하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 당뇨족부궤양의 예후와 관련이 있는 미생물은 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물일 수 있다.
본 발명은 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis) 및 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense)로 이루어진 미생물을 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 조성물, 키트, 및 정보제공방법 등에 관한 것으로서, 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 환자로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양을 진단받은 환자로부터 분리된 시료에서 박테로이데스 유니포르미스의 수준이 높거나 코리네박테리움 두사넨스의 수준이 낮은 경우, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다. 본 발명은 환자의 마이크로바이옴 분석을 통해 당뇨족부궤양의 예후를 조기에 예측하여 즉각적인 치료가 가능하며, 감염 또는 괴사로의 진행을 최소화함으로써 환자 개개인의 맞춤형 진단 플랫폼을 구축할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1 및 2는 혈류, 감염, 치료 상태에서 LEfSe analysis 결과를 나타낸 것으로서, 도 1은 LDA score bar plot이고, 도 2는 LEfSe circus plot이다. 이 때 A는 예후가 나쁜 군을, C는 예후가 좋은 군을 나타낸다.
도 3은 혈류, 감염, 치료 상태에서 균 분포도 상위 3%에 해당하는 trigonal plot을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 및 5는 치료 상태에서 통계적 균 검정 Fisher-test를 진행한 결과로서, 도 4는 각 미생물의 상대적 풍부도(relative abundance)를, 도 5는 각 미생물의 p-value와 OR(odds ratio) 값을 나타낸 것이다.
도 3은 혈류, 감염, 치료 상태에서 균 분포도 상위 3%에 해당하는 trigonal plot을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 및 5는 치료 상태에서 통계적 균 검정 Fisher-test를 진행한 결과로서, 도 4는 각 미생물의 상대적 풍부도(relative abundance)를, 도 5는 각 미생물의 p-value와 OR(odds ratio) 값을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 당뇨족부궤양 예후 예측을 위하여 NGS 기반 메타게놈(metagenome)을 분석한 결과, 당뇨족부궤양 예후에 따라 미생물 수준이 달라짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 환자로부터 분리된 시료와 비교하여, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁜 환자로부터 분리된 시료에서 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis)의 수준이 높고, 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense)의 수준이 낮다는 점을 확인하였다.
이에, 본 발명은 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물을 포함하는 당뇨족부궤양 예후 예측용 바이오마커, 상기 미생물과 미생물 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨족부궤양 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 미생물을 이용한 당뇨족부궤양 예후 예측을 위한 정보제공방법 또는 진단방법 등을 제공한다.
본 발명에서, 용어 “당뇨족부궤양(diabetic ulcer)”은 당뇨병 환자의 발에 발생하는 다양한 병적 상태 중 궤양이 발생한 경우를 말하며, 오랜 기간 고혈당증에 이환되면서 당뇨병성 말초신경병증과 말초 혈관의 기능장애 또는 폐색이 발생하고 이로 인하여 당뇨족부궤양이 발생하게 되는 것이 일반적이나, 그 원인은 다양하다. 당뇨족부궤양이 발생하면, 당뇨족부감염으로 진행될 수 있으며, 치유되지 않는 감염증으로 인하여 괴사가 발생하여 하지를 절단해야 하는 상황이 발생할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말하며, 환자의 생존율, 병세의 진행, 투약 및 치료에 따른 효과, 회복에 관한 예측 등을 나타내는 것이다. 본 발명에서 당뇨족부궤양의 예후가 좋다는 것은 혈류와 감염이 잘 조절되어, 완전한 치료(complete healing) 상태 혹은 이에 준하는 상태에 도달한 환자의 경우를 지칭하며, 상기 완전한 치료는 해당 상처(wound)가 완전히 혹은 거의 완전히 상피화(full epithelialization) 되어, 해당 부위에서 진물이나 분비물(discharge)이 나오지 않는 상태에 이른 경우를 의미한다. 한편, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁘다는 것은 혈류와 감염을 조절하기 위한 여러 의학적인 표준 치료를 진행했음에도 불구하고, 해당 부위의 상처가 닫히지 않는 상태가 지속되는 것, 혹은 지속적으로 그 깊이와 범위가 커지고 깊어져서, 최종적으로는 하지 절단(amputation) 등을 통해서 상처부위에 대한 치료가 종료되거나, 혹은 상처부위의 감염 및 악화로 전신상태의 악화를 불러일으켜 생명유지에 위해가 된 상태를 지칭한다.
본 발명은 바람직하게는 당뇨족부궤양이 감염과 괴사로 진행하는 것을 최소화하기 위하여 당뇨족부궤양의 예후를 예측함으로써 조기에 당뇨족부궤양을 치료하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서, 용어 “예측”은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 당뇨족부궤양으로 진단받은 환자의 병의 경과, 즉 예후를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "예후 예측용 조성물"은 질병의 예후를 예측하기 위한 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 각각의 제형에 따라 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 혼합물일 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수도 있다. 더 나아가, 당분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수도 있다.
본 발명에서, 용어 “개체”는 상기 질환의 예방, 치료, 및/또는 진단이 필요한 가축, 인간 등의 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 상기 개체에 약학적으로 유효한 양으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 개체의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “미생물 수준”은 생물학적 시료에서 미생물의 발현량, 생성량, 풍부도 또는 활성 정도를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 또는 소변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “측정하기 위한 제제”란 시료에서 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물의 존재를 검출하고, 미생물 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 물질을 말하며, 상기 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, LNA(Locked Nucleic Acids), 압타머 또는 항체 등일 수 있다.
바람직하게, 본 발명은 상기 미생물 수준을 측정하기 위해 미생물의 16s rRNA에 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 LNA 등을 이용할 수 있으며, 미생물 수준을 측정하는데 이용되는 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 “프라이머”는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “프로브”는 16s rRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 rRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.
본 발명은 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물; 및 상기 미생물 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로서 RT-PCR 키트의 경우, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 상기 키트에는 이외에 미생물 수준의 측정을 용이하게 하는 당업계에 공지된 여러 도구, 시약, 예를 들어 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 안정화제 등이 포함될 수 있다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
[실시예]
실시예 1. 당뇨족부궤양 환자 유래 검체의 서열정보 확보
당뇨족부궤양 병변의 조직(tissue), 골(bone), 또는 궤양 부위의 조직을 통하여 검체를 확보하였다. 환자의 예후를 판단하기 위해 각 병변의 혈류, 감염, 치료 3 단계의 정도에 따른 점수를 부여하고, 검체를 점수별로 분류하였다. 이 때, 점수는 낮을수록 좋지 않은 상태를 의미한다.
보다 구체적으로, 혈류에 대한 평가를 위해 최초 당뇨족부궤양이 존재하는 하지에 대해서 도플러검사 및, TcPO2(Transcutaneous oxygen pressure 또는 Toe Pressure 검사를 시행하였다. (ⅰ) 도플러검사상 혈류 흐름이 미약하거나 들리지 않고, TcPO2 검사상 궤양병변의 가장 proximal한 레벨에서 측정한 결과 값이 40 mmHg 미만이며, 이로 인해 혈류개선을 위한 percutaneous transluminal angiography (PTA) 혈관성형술을 시행하였음에도 2주 뒤 시행한 TcPO2 수치에서 의미 있는 개선이 보이지 않은 경우 혈류 항목에서 1점을 부여하였다. (ⅱ) 초기 TcPO2 값이 40 mmHg 미만이었으나, 이를 개선하기 위한 PTA 시행을 하였고, 그 2주 뒤 재측정한 TcPO2 값에서 40 mmHg 이상의 값을 보이고, 유의미한 혈류의 개선이 임상적으로 보이는 경우 2점을 부여하였다. (ⅲ) 초기 TcPO2 값이 40 mmHg 이상이고, 도플러 값도 Triphasic 양상의 그래프를 그리는 등 양호한 수치가 보여서 PTA 시술이 필요 없었던 경우 3점을 부여하였다. 따라서, 1점을 부여받은 검체를 예후가 나쁜 군으로, 3점을 부여받은 검체를 예후가 좋은 군으로 분류하였다.
감염에 대한 평가는 항생제 치료 이후 균의 검출 여부와 염증 지표 (ESR (적혈구 침강속도, erythrocyte sedimentation rate), CRP (급성반응단백, C-Reactive Protein), 프로칼시토닌(Procalcitonin))를 기반으로 판단하였다. (ⅰ) 감염에 대한 염증 지표가 비정상을 보이고, 수술실에서 시행한 균 배양 검사 결과에 따라 맞춰서 3~4주 이상의 유의한 기간 동안 투여한 항생제치료에도 불구하고, 의학적으로 의미 있는 염증지표의 호전이 보이지 않은 경우 1점을 부여하였다. (ⅱ) 균 배양 검사 결과에 따라 맞춰서 투여한 항생제 치료에 따라 염증 수치가 악화와 호전을 반복하거나, 실제 궤양 병변에 대한 임상적 평가상 감염의 호전이 뚜렷하게 좋아지거나, 악화되지는 않은 경우 2점을 부여하였다. (ⅲ) 비록 균 배양 검사상 균이 검출되었다고 하더라도, 그에 따른 항생제 치료가 효과적으로 작용하여 일정 기간 이후 해당 균 배양 검사 결과 더 이상 균이 검출되지 않고, CRP 등의 염증 수치 또한 유의하게 감소되어 정상 범위 내로 들어온 상태가 지속적으로 유지된 경우 3점을 부여하였다. 따라서, 1점을 부여받은 검체를 예후가 나쁜 군으로, 3점을 부여받은 검체를 예후가 좋은 군으로 분류하였다.
치료에 대한 평가는 혈류와 감염이 잘 조절되어, 완전한 치료(complete healing) 상태 혹은 이에 준하는 상태에 도달한 환자의 경우를 지칭하며, 상기 완전한 치료는 해당 상처(wound)가 완전히 혹은 거의 완전히 상피화(full epithelialization) 되어, 해당 부위에서 진물이나 분비물(discharge)이 나오지 않는 상태에 이른 경우를 예후가 좋은 군으로, 혈류와 감염을 조절하기 위한 여러 의학적인 표준 치료를 진행했음에도 불구하고, 해당 부위의 상처가 닫히지 않는 상태가 지속되는 것, 혹은 지속적으로 그 깊이와 범위가 커지고 깊어져서, 최종적으로는 하지 절단(amputation) 등을 통해서 상처부위에 대한 치료가 종료되거나, 혹은 상처부위의 감염 및 악화로 전신상태의 악화를 불러일으켜 생명유지에 위해가 된 상태인 경우를 예후가 나쁜 군으로 분류하였다.
상기 검체에서 DNA를 분리하여 16s rRNA의 V3-V4 region을 선택적으로 서열 분석(sequencing)할 수 있는 라이브러리를 적용하고, Illumina MiSeq 장비를 이용하여 검체로부터 수득한 미생물의 서열정보를 확보하였다.
실시예 2. LEfSe 분석
실시예 1에서 확보한 서열에서 생물학적 분류(taxonomic rank)(속(genus), 과(family), 목(order), 강(class), 문(phylum))별로 미생물 종(taxa)에 대한 상대적 풍부도(relative abundance)를 측정함으로써 마이크로바이옴 정보를 확보하였다. 상기 상대적 풍부도 수치를 기반으로 각 분류군별로 알파-다양성, 베타-다양성 값을 계산하고, 각 미생물 종별 탐지 빈도를 barplot로 나타내었다. 도 1은 LDA score bar plot으로 메타게놈 분석에서 분석할 범주를 상대적으로 비교하여 나타낸 선형 판별 분석 점수이다. 메타게놈 결과를 통해 LDA score 순위에 따라 구분 지었으며, 이 때 5가지 생물학적 분류(속(genus), 과(family), 목(order), 강(class), 문(phylum))에 관계없이 순위를 나타내었다.
치료와 관련하여 예후가 나쁜 군의 LDA score가 높게 나타나 예후가 좋은 군과 명확하게 구분되었으며, 특히 예후가 나쁜 군에서 슈도모나스과(Pseudomonadaceae)와 박테로이데스과(Bacteroidaceae)가 높은 LDA score를 가졌다.
LEfSe(Linear discriminant analysis effect size) 분석은 유전체 특징을 식별하는 고차원 바이오마커를 발견하기 위한 알고리즘이다. 상기 LDA score를 통계적으로 계산한 후, 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 군과 예후가 나쁜 군에서 특이적으로 나타나는 미생물 종(taxa)을 추출하고, LEfSe 분석을 통해 각 미생물 종의 분류학적 위치를 circus plot으로 나타내었다(도 2). 상기 circus plot는 밖에서부터 속(genus) - 과(family) - 목(order) - 강(class) - 문(phylum)의 순서로 균을 배치하였다.
이 때, LHuttenhower lab에서 제공하는 Galaxy platform에서(https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) 마이크로바이옴 정보를 input하여 LEfSe 분석을 수행하였다.
실시예 3. Trigonal plot 분석
메타게놈 분석 결과 나타난 전체 균 풍부도(taxanomy abundance) 상위 3%에 해당되는 미생물 종(taxa)에 대해 분석하여 trigonal plot에 나타내었다(도 3).
R의 plotrix library를 이용하여 trigonal plot 분석을 수행했으며, triax.plot 함수를 사용하여 시각적으로 구현하였다. 이 때, Input data로서 혈류, 감염, 치료 정도에 따른 점수별로 각 미생물 종의 상대적 풍부도의 평균값을 투입하여 output data로 trigonal plot을 수득하였다.
상기 trigonal plot에서 아래쪽 빗변에 가까울수록 예후가 나쁜 군에서 많이 분포하는 균을 나타낸다. 빗변의 수치는 각 미생물 종의 상대적 풍부도를 가리키며, 1에 가까울수록 상대적 풍부도가 높으므로, 당뇨족부궤양의 예후와 상관관계가 높다고 볼 수 있다.
그 결과, 예후가 나쁜 군에서 포피로모나스속(Porphyromonas), 세라티아속(Serratia), 박테로이데스속(Bacteroides), 슈도모나스속(Pseudomonas), 슈도체리키아속(Pseudescherichia)이 풍부한 것으로 나타났다. 실시예 2 및 3의 결과를 종합했을 때, 예후가 나쁜 군에서 박테로이데스속(Bacteroides), 슈도모나스속(Pseudomonas)의 수준이 높게 나타남을 알 수 있다.
실시예 4. Fisher-test
당뇨족부궤양 치료 중이지만 혈류와 감염 상태에 따라 예후가 좋은 군과 예후가 나쁜 군을 분류하였다. 예후가 좋은 군과 예후가 나쁜 군에서 검출되는 균인지 여부에 따라 confusion matrix를 제작하였고, 총 55개 미생물 종에 대한 56개의 matrix로부터 통계적으로 유의한 균 검출을 위해서 Fisher 분석법을 이용하였으며, p-value와 odds ratio(OR)를 확보하였다.
도 4는 메타게놈을 분석하여 검출된 전체 균 중에서 OR 값이 1 이하인 균들을 나열한 것으로서, 예후가 좋은 군과 예후가 나쁜 군에서 상대적 풍부도를 barplot으로 나타내었다.
도 5는 도 4에 나타낸 미생물들의 p-value와 OR 값을 꺾은선 그래프로 나타낸 것이다. OR은 대조군(예후가 좋은 군)의 균 발현 정도 / 확인하고자 하는 군(예후가 나쁜 군)의 균 발현 정도로 계산하였다. x축에서 왼쪽으로 갈수록 OR 값이 0에 가까우며, OR=0에 가까울수록 확인하고자 하는 군, 즉 예후가 나쁜 군 또는 예후가 좋은 군과 관련성이 높음을 의미한다.
그 결과, p-value가 0.5 이하인 통계적으로 유의미한 균들 중 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis)는 예후가 나쁜 군에서 특이적으로 높은 풍부도를 나타냈으며, 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense)는 예후가 좋은 군에서 특이적으로 높은 풍부도를 나타내었다.
결론적으로, 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스는 당뇨족부궤양의 예후를 예측하는 바이오마커로서 유효하다는 점을 시사한다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
Claims (11)
- 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis) 및 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense)로 이루어진 미생물을 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물; 및
상기 미생물 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨족부궤양 예후 예측용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 미생물의 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 미생물의 16s rRNA에 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 LNA(Locked Nucleic Acids)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 박테로이데스 유니포르미스는 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양의 예후가 나쁜 개체로부터 분리된 시료에서 미생물 수준이 높은 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 코리네박테리움 두사넨스는 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양의 예후가 나쁜 개체로부터 분리된 시료에서 미생물 수준이 낮은 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
- 제2항의 조성물을 포함하는 당뇨족부궤양 예후 예측용 키트.
- (1) 당뇨족부궤양을 진단받은 환자로부터 시료를 분리하는 단계;
(2) 상기 시료에서 박테로이데스 유니포르미스 및 코리네박테리움 두사넨스로 이루어진 미생물의 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 미생물 수준을 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료의 미생물 수준과 비교하는 단계;
를 포함하는 당뇨족부궤양 예후 예측을 위한 정보제공방법.
- 제7항에 있어서,
상기 (3)단계 이후에 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양을 진단받은 개체로부터 분리된 시료에서 박테로이데스 유니포르미스의 수준이 높은 경우, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 정보제공방법.
- 제7항에 있어서,
상기 (3)단계 이후에 당뇨족부궤양의 예후가 좋은 개체로부터 분리된 시료와 비교하여 당뇨족부궤양을 진단받은 개체로부터 분리된 시료에서 코리네박테리움 두사넨스의 수준이 낮은 경우, 당뇨족부궤양의 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 정보제공방법.
- 제7항에 있어서,
상기 시료는 당뇨족부궤양을 진단받은 개체의 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 정보제공방법.
- 제7항에 있어서,
상기 미생물의 수준을 측정하는 단계는 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
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| US7465704B2 (en) | 2001-12-20 | 2008-12-16 | Centro De Ingeniera Genetica Y Biotecnologia | Methods for enhancing healing of diabetic foot ulcers by injecting epidermal growth factor (EGF) |
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2022
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