KR102317737B1 - 순환 미토콘드리아 dna를 이용한 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물 및 진단방법 - Google Patents

순환 미토콘드리아 dna를 이용한 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물 및 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공함으로써, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 환자의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 또한, 발견되는 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 변화를 분석하여 침습성 조직의 수집 없이 액체 생검이 가능하다.

Description

순환 미토콘드리아 DNA를 이용한 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물 및 진단방법{Compositions for diagnosis of　diabetes or diabetic complications using circulating cell free DNA and method thereof}
본 발명은 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단용 키트, 상기 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
당뇨병은 높은 혈당 수치가 오랜기간 동안 지속되는 대사 질환으로, 통상적으로 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신 당뇨병 등으로 분류된다. 제1형 당뇨병은 췌장이 충분한 인슐린을 만들어 내지 못하는 것에 의해 발병하며, ‘인슐린 의존당뇨병’ 또는 ‘연소성 당뇨병”이라고도 한다. 제2형 당뇨병은 세포가 인슐린에 적절하게 반응하기 못하는 인슐린 저항이 있는 것이 특징이다. 이외의 임신 중에 처음 발생하거나 진단되는 모든 형태의 내당능 장애를 임신 당뇨병이라 한다.
당뇨병은 노인인구의 증가와 생활습관의 변화로 유병률이 크게 증가하고 있으며, 2025년에는 전세계 당뇨병 환자가 약 3억명에 이를 것으로 추정되고 있다. 당뇨병의 치료는 식이요법, 운동요법, 약물요법으로 대별되며 환자의 병태에 따라 결정되는데 당뇨병은 발병 이후의 치료는 완치가 거의 불가능하기 때문에 증상을 개선시키고 급만성 합병증을 막는 이차적 예방에 두고 있다. 즉, 당뇨병은 질환 그 자체보다 합병증의 예방 및 치료가 매우 중요하므로 관리의 목적은 항상 혈당유지와 합병증을 예방하는데 있다고 할 수 있다.
따라서 당뇨병 및 이의 합병증의 조기 진단을 위한 기술에 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1168052호
본 발명의 하나의 목적은 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 수준을 검출하는 제제를 포함하는 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 의심개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ccf-DNA를 분리하는 단계 상기에서 분리된 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 수준을 측정하는 단계 및 상기 단계에서 측정된 mtDNA의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 수준을 검출하는 제제를 포함하는 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, “당뇨”은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당 농도가 높은 것이 특징인 질환이다. 당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하는 질환이다. 인슐린이 상대적으로 부족한 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성(insulin resistance; 혈당을 낮추는 인슐린 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것)을 특징으로 한다. 본 발명에서 당뇨병은 구체적으로 제2형 당뇨병를 의미한다.
본 발명의 “당뇨 합병증”은 당뇨병에 의해 유도되는 만성 염증으로 인해 유도되는 질환일 수 있으며, AIM2 인플라마좀에 의해 유도된 만성염증에 의해 발생하는 것일 수 있다.
만성염증은 제2형 당뇨병의 인슐린 저항성 및 포도당 항상성 손상과 관련이 있다. 인플라마좀(Inflammasomes)은 대식세포와 같은 면역 세포에서 인터루킨 -1β (IL-1) 및 IL-18의 성숙 및 분비를 포함하여 카스파제-1 및 하류 면역 반응을 활성화시키는 다중 단백질 복합체이다.
본 발명에서 AIM2 인플라마좀에 의해 유도된 염증은 건선, 피부염 및 신장병 및 신장병을 유발한다. 또한, 당뇨병성 신증 또는 비당뇨성 신증 환자에서 AIM2의 발현이 유도됨이 알려져 있다. 따라서 본 발명에서 당뇨 합병증은 구체적으로 당뇨병성 신증일 수 있다.
상기 “당뇨병성 신증”은 당뇨병에 의해 유발된 신장병을 의미하며, 사구체경화증(glomerulosclerosis), 혈관병소(vascular lesion) 및 세뇨관 간질성 질환(tubulointerstitial disease)을 모두 포함하나 특히 당뇨병성 사구체경화증을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 제2형 당뇨형 또는 제2형 당뇨 합병증의 발병 여부를 확인하는 것으로서, 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.
본 발명에서 “무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)”는 세포핵 안에 존재하지 않고 혈액에 떠돌아 다니는 DNA의 조각으로, 세포유리 DNA로도 불리며, 혈장(plasma) 및 기채 체액에서 발견된다. ccf-DNA를 이용하면 침습성 조직의 수집 없이 액체 생검이 가능하다.
본 발명에서 "미토콘드리아 DNA(mtDNA)"는 세포의 세포질에 있는 미토콘드리아에 존재하는 DNA이다. 구체적으로, 본 발명에서 상기 mtDNA는 인간 NADH 탈수소효소(dehydrogenase) 1 유전자일수 있다.
본 발명에서 인간 NADH 탈수소효소(dehydrogenase) 1 유전자를 검출하는 제제는 서열번호 1 및 서열번호2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트일 수 있다. 또한, 상기 mtDNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 제2형 당뇨병 환자에서 mtDNA 수준의 변화를 분석하였다. 제2형 당뇨병을 가진 141명의 환자와 대조군 22명의 혈장에서 mtDNA을 분석하였다. 혈장의 ccf-DNA의 mtDNA에 대한 카피 수의 정량화하여 mtDNA 수준을 측정하였다. mtDNA 수준은 대조군에 비해 제2 형 당뇨병 환자(T2D)에서 유의하게 더 높았다. 다음으로 제2형 당뇨의 진단을 위해, 고혈당 지표인 HbA1c와 mtDNA의 상관관계를 확인하였다. 제2형 당뇨병 환자의 혈장에서 증가된 mtDNA 수준과 HbA1c 수준 사이에는 약간 상관관계가 있었다(도 5). 반면, 제2형 당뇨병 환자 혈장에서 nDNA 수준은 mtDNA 수준보다 낮게 나타났다(도 6). 이러한 결과는 제2형 당뇨병 환자에서 mtDNA 수준이 증가함을 나타낸다.
즉, 제2형 당뇨병 환자의 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)에서 미토콘드리아 유전자인 NADH 탈수소효소(dehydrogenase) 1 유전자가 증가하는 것을 이용하는 것을 확인하였는바, 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)에서 미토콘드리아 유전자인 NADH 탈수소효소(dehydrogenase) 1 유전자 수준을 측정하는 제제를 제2형 당뇨병 진단에 활용할 수 있다.
IL-1β는 제2형 당뇨병 환자의 만성염증 동안 인플라마좀(inflammasome)에 의해 조절되는 중요한 전 염증성 사이토카인이다. 제2형 당뇨병 환자에서 만성 염증에서 mtDNA의 역할을 조사하고자, mtDNA 수준 증가가 IL-1β 수준에 미치는 영향을 분석하였다. 141명의 제2형 당뇨병 환자 및 22명의 대조군의 혈장에서 IL-1β수준을 측정하였다.
분석결과, IL-1β 수준은 제2형 당뇨병 환자에서 대조군과 비교하여 현저하게 높은 것을 확인하였으며, 높은 mtDNA 수준과 IL-1β 수준은 약한 상관관계를 가짐을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 높은 mtDNA 수준이 제2형 당뇨병 환자에서 IL-1β에 의해 매개되는 만성염증과 연관됨을 확인하였다.
또한 제2형 당뇨병 환자의 mtDNA가 대식세포에서 AIM2 염증 활성화를 유도함을 확인하였다.
따라서 mtDNA의 증가를 분석하여 제2형 당뇨로 인해 발생하는 만성염증으로 인한 합병증 진단할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로 의심개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)를 분리하는 단계, 상기에서 분리된 ccf-DNA에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 수준을 측정하는 단계 및 상기 단계에서 측정된 mtDNA의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 "무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)", "미토콘드리아 DNA(mtDNA)"에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 발병에 의해 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함한다.
본 발명의 실시예에서 생물학적 시료로 혈장을 사용하였다. 따라서 본 발명의 생물학적 시료는 바람직하게는 혈장일 수 있다.
상기 미토콘드리아 DNA(mtDNA)은 모두 정상 대조군과 비교하여, 당뇨병이 있는 개체에서 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 변화하면 당뇨로 진단할 수 있다.
구체적으로 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증 의심 개체의 분리된 생물학적 시료의 상기 mtDNA의 수준이 정상 대조군 시료의 mtDNA의 수준보다 높을 경우 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨 합병증으로 판단할 수 있다.
본 발명은, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공함으로서, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 환자의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 또한, 발견되는 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)의 미토콘드리아 유전자 변화를 분석하여 침습성 조직의 수집 없이 액체 생검이 가능하다.
도 1은 제2형 당뇨병 환자(T2D) 141명과 대조군(control) 22명에서 혈장내 순환 미토콘드리아 DNA(circulating cell-free mitochondria, ccf-DNA) 수준을 측정한 것이다. (A) 단일가닥 DNA(ssDNA) 농도를 측정한 것이다. **p<0.001 two-tailed Student’s t-test; Cohen’s d 효과크기 d = 1.84. (B) 이중가닥 DNA(dsDNA) 농도를 측정한 것이다. **p<0.001 two-tailed Student’s t-test; Cohen’s d 효과크기 d = 0.69.
도 2는 제2형 당뇨병 환자(T2D) 141명과 대조군(control) 22명에서 혈장에서 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 수준을 정량적 PCR 분석한 결과이다. **p<0.001 two-tailed Student’s t-test.
도 3은 제2형 당뇨병 환자(T2D) 141명과 대조군(control) 22명에서 혈장에서 IL-1β 수준을 분석한 결과이다. **p<0.001 two-tailed Student’s t-test.
도 4는 대식세포에서 당뇨병 환자의 mtDNA에 의해 유도되는 absent in melanoma 2 (AIM2) 인플라좀 활성화를 분석한 결과이다. (a) 폴리 (dA : dT) 및 ccf-DNA (ccf-DNA # 1 및 ccf-DNA # 2) 또는 폴리 (dA : dT) 및 비히클 대조군 (대조군)으로 자극한 LPS- 프라임드 WT BMDM에서 카스파제-1 및 IL-1β에 대한 면역블롯 분석한 결과이다. 면역 블롯의 경우, 로딩 제어로서 β- 액틴을 사용 하였다. (b) 폴리 (dA : dT) 및 ccf-DNA (ccf-DNA # 1 및 ccf-DNA # 2) 또는 폴리 (dA : dT) 및 비히클 대조군 (대조군)으로 자극한 LPS- 프라임드 WT BMDM에서 IL-1β, IL-18 및 TNF-α의 분비를 정량한 것이다. (c) ATP, flagellin 또는 MDP와 ccf-DNA (ccf-DNA # 1 및 ccf-DNA # 2) 또는 비히클 대조군 (대조군)으로 자극한 LPS- 프라임드 WT BMDM에서 IL-1β 및 IL-18 분비를 분석한 것이다. (d) LPS- 프라임드 WT BMDM에서 면역형광 이미지 (그룹당 15 개의 개별 이미지에서 총 100 개의 세포) 및 카스파제 모집 도메인 (caspase recruitment domain, ASC) 스펙크 형성 (흰색 화살표) (각 마우스에 대한 ASC 스펙크 양성 세포의 백분율)의 정량화이다. (n = 그룹 당 마우스 6 마리). 폴리 (dA : dT) 및 ccf-DNA, 또는 폴리 (dA : dT) 및 비히클 대조군 (대조군)으로 자극시켰다. 스케일 바, 20㎛
도 5는 제2형 당뇨병 환자에서 고혈당 지표인 HbA1c 수준과 mtDNA 수준의 상관관계를 분석한 결과이다. R=0.279, P=0.0004 스피어만 상관계수(Spearman correlation coefficient) 분석, 검은 선은 선형 회귀이다(r2=0.0298).
도 6은 제2형 당뇨병 환자(T2D) 141명과 대조군(control) 22명에서 혈장에서 ccf-mtDNA 및 ccf-nDNA 수준을 정량적 PCR 분석한 결과이다. **p<0.001 two-tailed Student’s t-test.
도 7은 제2형 당뇨병 환자에서 IL-1β 수준과 ccf-mtDNA 수준의 상관관계를 분석한 결과이다. R=0.1404, P=0.0484 스피어만 상관계수(Spearman correlation coefficient) 분석, 검은 선은 선형 회귀이다(r2=0.1107).
도 8은 mtDNA에 의해 유도되는 absent in melanoma 2 (AIM2) 인플라좀 활성화에서 caspase-1 의존적 IL-1β 및 IL-18 분비가 필요함을 보여주는 결과이다. (a) LPS 인큐베이션 후 poly (dA : dT) 및 ccf-DNA 자극 전에 선택적 caspase-1 억제제(Z-VAD, 10μM, 1시간)로 사전한 BMDMs에서 IL-1β 및 IL-18의 면역블롯팅 분석한 결과이다. 베타 엑틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (b)는 LPS 인큐베이션 후 poly (dA : dT) 및 ccf-DNA 자극 전에 선택적 caspase-1 억제제(Z-VAD, 10μM, 1시간)로 사전한 BMDMs에서 IL-1β, IL-18 및 TNF-α의 분비를 정량한 것이다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 연구대상
인간 대상 연구는 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 수행하였다. 본 연구의 프로토콜(protocol)은 부산대학교 병원 기관심사위원회(20100024)의 승인을 받았다. 대상자들은 등록하기 전에 사전동의서를 제출하였다. 대상자는 당뇨병성 신장질환에 대한 향후 관찰 연구(Diabetic Kidney Disease Study, DKDS)에서 모집하였다. 외래환자 클리닉에서 2010년 2월부터 2012년 2월까지 총 172명이 등록하였으며, 이중 147명의 제2형 당뇨병 환자였고 나머지 25명의 건강한 대조환자였다. 등록된 환자 모두 추정 사구체 여과율(estimated glomerular filtration rates, eGFR)은 60㎖/분/1.73㎡ 이상, 혈청 크레아티닌(serum creatinine)은 1.2㎎/㎗ 미만으로, 비교적 보존된 신장기능을 가졌다. 또한, 레닌 앤지오텐신계(renin-angiotensin system, RAS) 억제제에 대한 충분한 세척 기간(washout period)을 가졌다. 환자는 등록 시 RAS 억제제의 투여이력이 없거나, 등록 전에 이들 약물에 대해 최소 2개월의 세척 기간을 가졌다. 등록 후, 초기 진료소 방문시 의료 이력 및 인체 측정을 수행하였으며, 동시에 혈액샘플을 채취하였다. 172명의 환자 중 9명은 기준 혈장(baseline plasma) 또는 스팟 유린(spot urine) 샘플이 부족하여 분석에서 제외하였다. 본 연구에 포함된 163명의 환자는 141명의 제2형 당뇨병 환자와 22명의 건강한 대조군으로 구성되어 있다.
2. 혈장에서 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)의 분리
혈장(plasma)을 EDTA- 코팅된 튜브에 수집하였다. 혈장 샘플을 -80 ℃에서 저장하였다. Maxwell® RSC 기기 (AS4500, Promega) 및 Maxwell® RSC ccf-DNA 플라즈마 키트(AS1480, Promega)를 사용하여 혈장(100㎕)에서 ccf-DNA를 분리하였다. 최종 용리(elution) 단계에서, 제조사 매뉴얼에 따라, 분리된 ccf-DNA를 1×TE 버퍼(50 ㎕)를 사용하여 용리시켰다.
3. 혈장의 ccf-DNA의 수준의 정량
ccf-DNA에서 dsDNA 및 단일 가닥 DNA (ssDNA) 농도의 정량은 Quantus- Fluorometer (E6150, Promega)를 이용한 형광 검출에 의해 측정되었다. QuantiFluor® dsDNA 시스템 (E2670, Promega)을 사용하여 dsDNA의 농도를 측정 하였고, QuantiFluor® ssDNA 시스템 (E3190, Promega)을 사용하여 ssDNA의 농도를 측정하였다.
4. ccf-DNA에서 mtDNA 및 nDNA 수준의 정량
mtDNA 카피 수의 표준으로, 인간 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (환원) (NADH) 탈수소 효소 1 (nicotinamide adenine dinucleotide (reduced) (NADH) dehydrogenase 1, MTND1)의 cDNA 클론을 사용하였다. 핵 DNA (nuclearDNA, nDNA) 카피 수의 표준을 위해, 인간 헤모글로빈, 베타(human hemoglobin, beta; HBB) cDNA ORF 클론(Myc-DDK tagged)을 사용하였다. 농도는 수학식 1의 공식을 이용하는 DNA 카피수 계산기를 이용하여 카피 수로 변환하였다.
Figure 112020036101052-pat00001
5 ㎕ ccf-DNA 및 유전자 특이적 프라이머 세트를 포함하는 10 ㎕ 혼합물(mixture)를 2×SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 10 ㎕와 혼합하고, ABI PRISM 7300 실시간 PCR 시스템을 이용하여 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 정량화를 수행 하였다.
상기 유전자 특이적 프라이머 세트의 염기서열은 표 1과 같다.
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
human NADH dehydrogenase 1 gene (mtDNA), 5'-ATACCCATGGCCAACCTCCT-3'
(서열번호1)		 5'-GGGCCTTTGCGTAGTTGTAT-3'
(서열번호2)
human -globin (nuclear DNA) 5'-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3'
(서열번호3)		 5'-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3'
(서열번호4)
mtDNA를 검출하고자 아래와 같이 RT-PCR 분석을 수행하였다.
변성 단계는 95 ℃에서 10 분 동안 개시되고 그 후 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72 ℃에서 30 초를 50 회 사이클 반복하였 PCR을 수행하였다.
모든 혈장 분석에서 mtDNA의 수준을 하기 수학식 2에 기초하여 혈장 마이크로 리터당 카피로 계산하였다.
Figure 112020036101052-pat00002
여기서 C는 혈장 내 DNA 수준 (카피/마이크로 리터 혈장)이며; Q는 PCR에서 서열 검출기에 의해 결정된 DNA의 양 (카피)이고; VDNA는 단리 후 수득 된 혈장 ccf-DNA 용액의 총 부피 50㎕이고; VPCR은 PCR에 사용 된 혈장 ccf-DNA 용액의 부피 5 ㎕; VEXT는 혈장 추출량 100 ㎕이다.
5. 세포 배양
모든 마우스 실험 프로토콜은 순천향대 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호: SCH18-0032)에 의해 승인되었다. 일차(primary) 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)의 경우, 야생형 (WT) 마우스 (수컷, 8-10 주령) 대퇴골 및 경골로부터 수집 된 골수를 멸균 페트리 접시에 플레이팅하고 10 %(v/v) 열 불활성 소태아혈청(FBS), 100 유닛 /㎖ 페니실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토 마이신 함유 및 25% (v/v) 마우스 L929 섬유 아세포로부터 조절된 배지를 포함하는 DMEM 배지에서 7 일 동안 배양 하였다.
AIM2 인플라마좀 활성화를 위해, LPS- 프라임드 야생형(WT) 골수 유래 대 식세포 (BMDM)를 플러스 시약을 갖는 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용하여 폴리 (dA : dT) (1 ㎎/㎖, 3 시간)로 트렌스펙션 하였다.
NLRP3 인플라마좀 활성화를 위해, LPS- 프라임드 WT BMDM을 ATP (2 mM, 0.5 h)로 처리 하였다. NLRC4 염증 효소 활성화를 위해, LPS-프라임드 WT BMDM을 제조사의 지시에 따라 플러스 시약이 있는 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용하여 플라겔린(flagellin, 5 ㎍/㎖, 6 시간)으로 트렌스펙션 하였다. NLRP1 인플라마좀 활성화를 위해, LPS- 프라임드 WT BMDM을 MDP (5 ㎍/㎖, 16 시간)로 처리 하였다.
사이토 카인 분석을 위해, 세포 상청액 및 세포 용해물을 수집하고 ELISA 키트를 사용하여 IL-1β, IL-18 및 TNF-α의 수준에 대해 분석 하였다
6. 면역 블롯 분석
WT BMDM을 수거하여 NP40 세포 용해 완충액에 용해시켰다. 용해물을 4 ℃에서 10 분 동안 15,300×g에서 원심 분리하여 상청액을 수득 하였다. 브래드 포드 분석법을 적용하여 상청액의 단백질 농도를 측정 하였다. 단백질을 NuPAGE 4 -12% 비스-트리스 겔상에서 전기 영동하고 프로트란 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 25℃에서 30 분 동안 5 %(w/v) 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 TBS-T (TBS 및 1% v/v 트윈-20)에서 차단시켰다. 막을 4℃에서 16 시간 동안 TBS-T에서 1 %(w/v) BSA로 희석된 1차 항체 인큐베이션하고 서양고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase, HRP) 접합된 2차 항체(토끼 IgG-HRP 및 마우스 m-IgG BP-HRP) TBS-T에 1:2500으로 희석하고 25℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 면역 반응성 밴드는 SuperSignalWest Pico 화학 발광 기판을 사용하여 검출되었다
7. 사이토카인 분석
BMDM으로부터의 상청액은 제조사의 지시에 따라 마우스 IL-1β (MLB00C, R & D 시스템), 마우스 IL-18 (7625, R & D 시스템), 마우스 TNF-α(MTA00B, R & D 시스템)에 대해 측정하였다. 인간 대상의 혈장을 제조업체의 지시에 따라 인간 IL-1β (DLB50, R&D 시스템)에 대해 측정 하였다.
8. ASC 올리고머 화 및 ASC 스펙 형성
WT BMDM을 챔버 슬라이드 상에 시딩 하였다. LPS 및 폴리(dA : dT) 자극 후, 세포를 4% 파라포름 알데히드로 고정한 다음 16 시간 동안 폴리클로날 ASC 항체 (ADI-905-173-100, Enzo Life Sciences) 및 FITC 염소 항 토끼(IgG)와 배양 하였다. 2차 항체(ab6717, Abcam, Cambridge, MA, USA)에 이어 1 시간 동안 DAPI (P36962, Thermo Fisher Scientific) 염색하였다. Zeiss LSM880 레이저 스캐닝 공 초점을 사용하여 ASC 스펙을 분석 하였다. 현미경을 사용하고 ImageJ 소프트웨어 v1.52a (NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화 하였다. 도 4d의 그래프는 각 마우스에 대한 ASC 스펙크 양성 세포의 백분율의 정량을 나타낸다.
9. 통계분석
모든 데이터는 세 개의 독립적인 실험에서 결합된 평균 SD입니다. 모든 통계 테스트는 통계 소프트웨어 패키지(GraphPad Prism 버전 4.0, GraphPad 소프트웨어)를 사용하여 두 그룹의 비교를 위해 양측 스튜던트 t- 테스트와 분산 분석 (ANOVA) (Dunnett 테스트를 사용한 사후 비교)을 사용하여 분석하였다.
두 그룹의 비교를 위해 Spearman 상관 계수(Spearman 's R)를 사용하여 상관 테스트를 분석하였다. 차이의 강도는 두 그룹의 비교를 위해 Cohen의 효과 크기 (d)를 사용하여 분석되었습니다. 선형회귀 분석 (r2)은 두 그룹을 비교하여 분석되었으며, 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.
<결과>
1. 제2형 당뇨병 환자에서 혈장 ccf-DNA 수준의 증가
제2형 당뇨병 환자에서 ccf-mtDNA의 역할을 조사하기 위해 제2형 당뇨병 환자의 대조군에서 분리한 혈장에서 전체 ccf-DNA 수준을 분석하였다. 제2형 당뇨병 환자의 혈장에서 단일가닥 DNA(ssDNA) 및 이중가닥 DNA(dsDNA)를 포함하는 전체 ccf-DNA를 분리하였다. ccf-DNA는 제2형 당뇨병을 가진 141명의 환자와 대조군인 2형 당뇨병을 가지지 않는 22명의 건강한 대상체(이하 대조군)의 혈장에서 분리하였다(표 2).
표는 비 당뇨병 대조군 및 제2형 당뇨병 환자의 기준 특성이다.
대조군
n=22 		제2형 당뇨병 환자 n=141 p-Value
연령, 년 51.6 ± 6.0 56.5 ± 10.7 0.003
성별, 남성(%) 11 (50.0) 60 (42.6) 0.672
ccf-mtDNA, 카피수(1 × 103)/㎕ 0.1 ± 0.01 1.91 ± 0.17 <0.01
IL-1β, pg/㎕ 30.27 ± 0.12 38.53 ± 0.71 <0.001
HbA1c (%) 0 (0.0) 8.1 ± 1.99 1.000
고혈압, 현재 0 (0.0) 103 (75.2) 1.000
체질량지수(BMI), kg/m2 23.0 ± 2.6 23.5 ± 3.5 0.464
수축기 혈압, mmHg 119.1 ± 15.1 124.0 ± 13.6 0.129
확장기 혈압, mmHg 74.1 ± 8.3 77.3 ± 9.4 0.124
헤모글로빈, g/dL 14.7 ± 1.7 13.5 ± 1.7 0.001
요소질소, mg/dL 14.2 (11.5-16.4) 15.9 (12.8-20.4) 0.039
크레아틴, mg/dL 0.83 ± 0.14 0.81 ± 0.20 0.580
알부민, g/dL 4.49 ± 0.28 4.43 ± 0.42 0.522
아스파르테이트아니노전달효소(AST), IU/L 19.5 (18.0, 23.8) 19.0 (16.0, 25.0) 0.459
알라닌아니노전달효소(ALT), IU/L 16.5 (13.0, 23.0) 20.0 (16.0, 27.3) 0.044
총 빌리루빈, mg/dL 1.09 ± 0.38 0.65 ± 0.26 <0.001
총 콜레스테롤, mg/dL 195.0 ± 34.5 178.7 ± 37.6 0.059
트리글리세라이드, mg/dL 120.5
(60.0, 141.0)		 142.0
(91.5, 216.5)		 0.020
요산, mg/dL 5.02 ± 0.88 4.76 ± 1.33 0.367
칼슘, mg/dL 9.42 ± 0.45 9.35 ± 0.43 0.465
인, mg/dL 3.45 ± 0.58 3.69 ± 0.58 0.077
사구체여과속도추정(eGFR), ㎖/분/1.73 m2 101.2
(89.7, 110.2)		 99.2
(87.6, 109.9)		 0.690
C-반응 단백질, mg/L 0.04 (0.03, 0.08) 0.07 (0.03, 0.15) 0.193
혈장으로부터 ccf-DNA 분리한 후, 혈장 내의 ssDNA 및 dsDNA의 농도를 정량하여 DNA 수준을 측정하였다. ssDNA 및 dsDNA 농도는 건강한 피험자(대조군)과 비교하여 2형 당뇨병 환자(T2D)의 혈장에서 상대적으로 높게 나타났다(도 1A 및 B). 상기 결과에서 ccf-DNA의 수준이 제2형 당뇨병 환자의 혈장에서 증가하였다.
2. 제2형 당뇨병 환자 혈장에서 mtDNA 수준의 증가
다음으로 제2형 당뇨병 환자에서 mtDNA 수준의 변화를 분석하였다. 제2형 당뇨병을 가진 141명의 환자와 대조군 22명의 혈장에서 mtDNA을 분석하였다. 혈장의 ccf-DNA의 mtDNA에 대한 카피 수의 정량화하여 mtDNA 수준을 측정하였다. mtDNA 수준은 대조군에 비해 제2 형 당뇨병 환자(T2D)에서 유의하게 더 높았다(도 2).
다음으로 제2형 당뇨의 진단을 위해, 고혈당 지표인 HbA1c와 mtDNA의 상관관계를 확인하였다. 제2형 당뇨병 환자의 혈장에서 증가된 mtDNA 수준과 HbA1c 수준 사이에는 약간 상관관계가 있었다(도 5). 반면, 제2형 당뇨병 환자 혈장에서 nDNA 수준은 mtDNA 수준보다 낮게 나타났다(도 6). 이러한 결과는 제2형 당뇨병 환자에서 mtDNA 수준이 증가함을 나타낸다.
3. 제2형 당뇨병 환자 혈장에서 인터루킨-1β(interleukin-1 β, IL-1β)의 수준 증가
IL-1β는 제2형 당뇨병 환자의 만성염증 동안 인플라마좀(inflammasome)에 의해 조절되는 중요한 전 염증성 사이토카인이다. 제2형 당뇨병 환자에서 만성 염증에서 mtDNA의 역할을 조사하고자, mtDNA 수준 증가가 IL-1β 수준에 미치는 영향을 분석하였다. 141명의 제2형 당뇨병 환자 및 22명의 대조군의 혈장에서 IL-1β수준을 측정하였다. 분석결과, IL-1β 수준은 제2형 당뇨병 환자에서 대조군과 비교하여 현저하게 높은 것을 확인하였다(도 3).
다음으로 제2형 당뇨병 환자에서 높은 mtDNA 수준과 IL-1β 수준과의 상관관계를 확인하였다. 분석결과, 높은 mtDNA 수준과 IL-1β 수준은 약한 상관관계를 가짐을 확인하였다(도 7). 상기 결과를 통해, 높은 mtDNA 수준이 제2형 당뇨병 환자에서 IL-1β에 의해 매개되는 만성염증과 연관됨을 확인하였다.
4. 제2형 당뇨병 환자의 mtDNA의 대식세포에서 AIM2 임플라마좀 활성화 유도
제2형 당뇨병의 만성 염증 조절에 ccf-mtDNA의 분자 표적을 조사하기 위해, 제 2 형 당뇨병 환자로부터 높은 mtDNA 수준을 갖는 ccf-DNA를 검사하여 대 식세포에서 AIM2 인플라좀 활성화를 유도할 수 있는 확인하였다. 제2형 당뇨병 환자의 ccf-DNA 및 AIM2 인플라마좀 활성화제(inflammasome activator)인 폴리(dA:dT)를 이용하여 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)-프라임드 골수유래 대식세포 (bone marrow-derived macrophages, BMDMs)에서 카스파제-1(caspase-1) 활성화, IL-1β 및 IL-18의 분비를 분석하였다.
독립적인 2명의 제2형 당뇨병 환자에서 분리한 ccf-DNA(ccf-DNA # 1 및 ccf-DNA # 2)는 폴리(dA:dT) 자극에 반응하여 비히클 대조군과 비교하여 카스파제-1(caspase-1) 및 클리브드 IL-1β(cleaved IL-1β)의 발현이 현저히 높게 나타났다. 그러나 프로-IL-1β의 발현은 비히클 대조군과 비교하여 변화하지 않았다(도 4a).
일관되게, 제2형 당뇨병을 가진 2명의 독립적인 환자로부터의 ccf-DNA (ccf-DNA # 1 및 ccf-DNA # 2)는 비히클 대조군과 비교하여 폴리 (dA : dT)에 반응하여 현저히 높은 IL-1β 및 IL-18 분비를 나타냈다(도 4b), 반면 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)의 분비는 변하지 않았다 (도 4b).
다음으로 mtDNA 유도 AIM2 인플라마좀 활성화에 중요한 caspase-1 활성화 의존적인 IL-1β 및 IL-18 분비 여부를 확인하였다. LPS 인큐베이션 후 poly (dA : dT) 및 ccf-DNA 자극 전에 선택적 caspase-1 억제제(Z-VAD)로 사전한 BMDMs에서 caspase-1 활성화 및 IL-1β 및 IL-18 분비를 분석했다. Z-VAD는 비히클 대조군에 비해 ccf-DNA 및 폴리 (dA : dT) 자극에 반응하여 카스파제 -1 활성화, IL-1β 절단 및 IL-1β 및 IL-18의 분비를 억제하였고, TNF-α는 변하지 않았다(도 8). 이러한 결과는 ccf-DNA 유도 AIM2 인플라마좀 활성화가 카스파제-1 의존적 IL-1β 및 IL-18 분비에 필요함을 보여준다.
대조적으로, ccf-DNA(ccf-DNA # 1 및 ccf-DNA # 2)는 도 4c를 참조하면 ATP (NLRP3 인플라마좀 활성화제) 또는 플라겔린(flagellin) (NLRC4 인플라마좀 활성화 제) 또는 무라마일리 펩티드(muramyldipeptide, MDP), (NLRP1 인플라마좀 활성화제)와 반응하여 IL-1과 IL-18의 분비에 영향을 미치지 않았다.
또한, 제2형 당뇨병에서 ccf-DNA NLRP3 종속 caspase-1 활성화에 필요한 ASC 얼룩 형성 촉진 여부를 조사했다. 제2형 당뇨병 환자의 ccf-DNA는 비히클 대조군과 비교하여 LPS 및 폴리 (dA : dT) 자극에 의해 유도 된 ASC 반점의 형성이 상당히 더 높았다 (도 4d). 이러한 결과는 제2형 당뇨병 환자의 mtDNA가 대식세포에서 AIM2 염증 활성화를 유도함을 확인하였다.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Compositions for diagnosis of diabetes or diabetic complications using circulating cell-free DNA and method thereof <130> DP20190360 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NADH dehydrogenase 1 gene (mtDNA) forward primer <400> 1 atacccatgg ccaacctcct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NADH dehydrogenase 1 gene (mtDNA) reverse primer <400> 2 gggcctttgc gtagttgtat 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta globin (nuclear DNA) forward primer <400> 3 gtgcacctga ctcctgagga ga 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta globin (nuclear DNA) reverse primer <400> 4 ccttgatacc aacctgccca g 21

Claims (8)

  1. 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)에서 미토콘드리아DNA(mtDNA) 수준을 검출하는 제제를 포함하고,
    상기 mtDNA는 인간 NADH 탈수소효소(dehydrogenase) 1 유전자이며,
    상기 인간 NADH 탈수소효소(dehydrogenase) 1 유전자는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 검출되는, 제2형 당뇨 합병증인 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 조성물을 포함하는, 제2형 당뇨 합병증인 당뇨병성 신증 진단용 키트.
  7. 의심개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 무세포 순환 DNA(circulating cell-free DNA, ccf-DNA)를 분리하는 단계;
    분리된 ccf-DNA에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 단계에서 측정된 mtDNA의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 mtDNA는 인간 NADH 탈수소효소(dehydrogenase) 1 유전자인,
    제2형 당뇨 합병증인 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈장인 것을 특징으로 하는, 제2형 당뇨 합병증인 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공방법.
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