CN103131647A

CN103131647A - 婴儿双岐杆菌及其制剂

Info

Publication number: CN103131647A
Application number: CN2011103882950A
Authority: CN
Inventors: 陈蓓; 张军东; 王莎莎; 汪忠慧; 于鸿晶; 沈颐涵
Original assignee: SHANGHAI SINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI SINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: CN103131647B

Abstract

婴儿双歧杆菌菌株、药物组合物及其用途、以及制造方法。提供了一种婴儿双歧杆菌菌株IFA09，其保藏号为CCTCC NO：M2011310。本发明婴儿双歧杆菌具有更高的活性，能够更有效地治疗胃肠道功能紊乱性疾病。另外，本发明所涉及的种液培养基使种子活性增强，发酵培养基成分稳定，质量及生产条件易于控制，能够达到500L产业化生产，且能达到10¹⁰cfu/mL的高密度培养，完全能够满足生产需求；本文提供的冻干保护剂及冻干工艺能提高冻干制剂的活菌率及其保存时间，提高制剂的稳定性。

Description

婴儿双岐杆菌及其制剂

技术领域

本发明涉及新的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)菌株、即制备方法以及在治疗胃肠道功能紊乱性疾病的用途。

背景技术

双歧杆菌是人和动物肠道内重要的生理性细菌，它对促进人体的发育、维持和提高免疫力、延缓机体衰老等方面起着重要作用。近百年的研究证明双歧杆菌是人类肠道内的优势菌群。人体在成长过程中，由于疾病、衰老等原因，体内双歧杆菌在数量上和总菌占有率上逐渐下降。因此，有人将体内双歧杆菌的数量作为健康的标志之一。新生儿肠道中双歧杆菌占细菌总数的92％，其随年龄增长而减少，至老年临终前完全消失。双歧杆菌在生长发育过程中随时被消耗，又随时增长达到一定的平衡；但当人进入中老年，其自我调节能力减弱，适时地进行外源性补充，对保持和促进机体健康具有积极的意义，所以双歧杆菌制品越来越多的受到人们的欢迎。

目前采用的培养双歧杆菌的培养基配方较复杂，质量及生产条件控制不易，原料种类多，不适宜大规模发酵时应用，且发酵量较低，难以达到生产要求；冻干保护剂种类繁多，比例各异，冻干工艺不成熟，冻干品种活菌率低，保存时间也不长，直接影响了双歧活菌制剂的质量。

目前本领域中急需新的婴儿双歧杆菌及其制备方法，用于有效治疗胃肠道功能紊乱性疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的婴儿双歧杆菌及其制备方法，用于有效治疗胃肠道功能紊乱性疾病。

本发明一方面提供了一种婴儿双歧杆菌菌株IFA09，其保藏号为CCTCCNO：M2011310。

本发明另一方面提供了一种制备本发明所述婴儿双歧杆菌菌株IFA09的方法，其特征在于，所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09是通过如下方法获得的：

(a)在下述液体培养基中加入新鲜的健康婴儿的粪便，搅拌均匀后离心，取上清液放入厌氧培养箱中25-42℃培养18-30小时；

(b)取0.05-0.2mL培养液接种于厌氧血琼脂平板，在厌氧培养箱中于25-42℃培养36-72小时后，挑单菌落划线接种于厌氧培养平板，然后将所述厌氧培养平板置于厌氧培养箱中于25-42℃培养36-72小时；

(c)然后将厌氧培养平板上的菌种进行镜检观察，并做生理生化试验、遗传学鉴定、脂肪酸分析及抗生素敏感试验，从而获得婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCCNO：M2011310。

在本发明的一个优选实例中，所述培养基优选包括2-20重量份的胰蛋白胨、1-15重量份的酵母提取物、0.05-1重量份的L-半胱氨酸盐酸盐、1-15重量份的葡萄糖、0.0005-0.01重量份的氯化钙、0.0005-0.01重量份的硫酸镁、0.005-0.2重量份的磷酸二氢钾和0.005-0.2重量份的磷酸氢二钾；优选地，所述培养基包括5-15重量份的胰蛋白胨、2-7.5重量份的酵母提取物、0.1-0.5重量份的L-半胱氨酸盐酸盐、2-7.5重量份的葡萄糖、0.001-0.005重量份的氯化钙、0.000-0.005重量份的硫酸镁、0.01-0.05重量份的磷酸二氢钾和0.01-0.05重量份的磷酸氢二钾。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310。

本发明另一发面提供了一种婴儿双歧杆菌冻干粉制剂，它包括婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310菌粉和保护剂。

在本发明的一个优选实例中，所述保护剂包含脱脂奶粉0.1-30重量份、谷氨酸钠0.01-10重量份、甘露醇0.01-20重量份、Vc-Na 0.001-10重量份、淀粉0.1-30重量份；优选地，所述保护剂含脱脂奶粉0.5-20重量份、谷氨酸钠0.05-5重量份、甘露醇0.01-10重量份、Vc-Na 0.001-5重量份、淀粉0.5-20重量份；更优选地，所述含脱脂奶粉1.5-7.5重量份、谷氨酸钠0.15-1.5重量份、甘露醇0.1-1重量份、Vc-Na 0.003-1.5重量份、淀粉1.5-6重量份。

在本发明的一个优选实例中，所述保护剂的用量为0.1-99.9重量份，优选为20-90重量份，更优选为30-80重量份，最优选为40-60重量份。

本发面另一方面提供了一种本发面所述冻干粉制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将本发面所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310在一级种液培养基中接种培养，得到一级接种产物；

(b)将一级接种产物接种到二级种液培养基中接种培养，得到二级接种产物；

(c)将二级接种产物接到50L发酵罐中培养基中培养，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物接到发酵罐培养基中培养，得到发酵产物；

(e)将步骤(d)得到的发酵产物离心后与保护剂混匀，冻干得冻干粉制剂。

本发面还提供了本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310在制备药物中的用途，所述药物用于治疗胃肠道功能紊乱性疾病。

在本发明的一个优选实例中，所述胃肠道功能紊乱性疾病选自IBS症状、IBD症状、炎症、腹泻、自身免疫疾病和癌症。

本发明所述的婴儿双歧杆菌被命名为IFA09，已经于2011年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011310。

本发明婴儿双歧杆菌具有更高的活性，能够更有效地治疗胃肠道功能紊乱性疾病。另外，本发明所涉及的种液培养基使种子活性增强，发酵培养基成分稳定，质量及生产条件易于控制，能够达到500L产业化生产，且能达到10¹⁰cfu/mL的高密度培养，完全能够满足生产需求；本文提供的冻干保护剂及冻干工艺能提高冻干制剂的活菌率及其保存时间，提高制剂的稳定性。

具体实施方式

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、和2-5。

在本发明中，除非有其他说明，组合物的各组分的含量范围以及其优选范围之间可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。

在本发明中，除非有其他说明，所有“份”和百分数(％)都指重量百分数。

在本发明中，除非有其他说明，所有组合物中各组分的百分数之和为100％。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09是通过如下方法获得的：

培养基组分	重量份
		胰蛋白胨	1-30
酵母提取物	0.5-20
		L-半胱氨酸盐酸盐	0.01-2
葡萄糖	0.5-20
		氯化钙	0.0001-0.01
硫酸镁	0.0001-0.01
		磷酸二氢钾	0.001-0.5
磷酸氢二钾	0.001-0.5

(c)然后将厌氧培养平板上的菌种进行镜检观察，并做生理生化试验、遗传学鉴定、脂肪酸分析及抗生素敏感试验，从而获得婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCCNO：M2011310(例如可以由中国科学院微生物研究所检测鉴定)。

在上述方法中，所述实验步骤均是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以知道具体的操作。

在上述方法中，所述培养基优选包括2-20重量份的胰蛋白胨、1-15重量份的酵母提取物、0.05-1重量份的L-半胱氨酸盐酸盐、1-15重量份的葡萄糖、0.0005-0.01重量份的氯化钙、0.0005-0.01重量份的硫酸镁、0.005-0.2重量份的磷酸二氢钾和0.005-0.2重量份的磷酸氢二钾。在本发明的一个优选实例中，所述培养基包括5-15重量份的胰蛋白胨、2-7.5重量份的酵母提取物、0.1-0.5重量份的L-半胱氨酸盐酸盐、2-7.5重量份的葡萄糖、0.001-0.005重量份的氯化钙、0.000-0.005重量份的硫酸镁、0.01-0.05重量份的磷酸二氢钾和0.01-0.05重量份的磷酸氢二钾。

本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的培养特征、菌体形态及理化试验结果如下：

专性厌氧菌，最适生长温度为37℃-41℃，最适pH值为5.5-7.0，菌落为圆形凸起、光滑，边缘整齐。革兰氏染色阳性，其典型的特征是有分叉的杆菌，不形成芽孢，无运动性。接触酶阴性，氧化酶阴性。

表2.理化实验结果

将该理化实验结果与伯杰氏细菌系统鉴定手册对照，鉴定该菌种为婴儿双歧杆菌。

遗传学鉴定：由中国科学院微生物研究所进行婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCCNO：M2011310的16SrRNA基因序列、tuf基因序列分析，所得序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。

将16SrRNA基因序列与Genbank对照，鉴定该菌种为婴儿双歧杆菌。

脂肪酸分析：由中国科学院微生物研究所使用美国MIDI(MicrobialIdentification)公司Sherolock全自动细菌鉴定系统测定婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的菌体脂肪酸成分，结果如下：

表3.脂肪酸成分分析结果

本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的抗生素敏感试验数据如下：

表4.抗生素敏感实验结果

本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310可以本领域中常规剂型进行给药。例如，上述婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310可以制成口服液、片剂、胶囊和其它口服固体制剂、以及冻干粉制剂等。在本发明的一个优选实例中，所述婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310可以制成冻干粉制剂。

本发明另一方面提供了一种婴儿双歧杆菌冻干粉制剂，它包括婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310菌粉和保护剂。

在上述制剂中，所述婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的含量是常规的，只要能起到预期效果即可。在本发明的一个优选实例中，所述婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的用量为0.1-99.9重量份，优选为10-80重量份，更优选为20-70重量份、最优选为40-60重量份。

在上述制剂中，所述保护剂是本领域中的常规保护剂。在本发明的一个优选实例中，所述保护剂包含脱脂奶粉0.1-30重量份、谷氨酸钠0.01-10重量份、甘露醇0.01-20重量份、Vc-Na 0.001-10重量份、淀粉0.1-30重量份。在本发明的另一个优选实例中，所述保护剂含脱脂奶粉0.5-20重量份、谷氨酸钠0.05-5重量份、甘露醇0.01-10重量份、Vc-Na 0.001-5重量份、淀粉0.5-20重量份。在本发明的还有一个优选实例中，所述含脱脂奶粉1.5-7.5重量份、谷氨酸钠0.15-1.5重量份、甘露醇0.1-5重量份、Vc-Na 0.003-1.5重量份、淀粉1.5-6重量份。

在上述制剂中，所述保护剂的用量是常规的。在本发明的一个优选实例中，所述保护剂的用量为0.1-99.9重量份，优选为20-90重量份，更优选为30-80重量份，最优选为40-60重量份。

在上述冻干粉制剂中，还可包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体在本领域中是常规的，它可以是例如药学可接受的填料、赋形剂、调味剂等。在本发明的一个优选实例中，所述药学上可接受的载体选自微晶纤维素、硬脂酸镁、乳糖及其组合。

在上述制剂中，所述药学上可接受的载体的用量是常规的，它可以是例如0.1-1000重量份，较好为1-500重量份，更好为1-200重量份，最后为1-100重量份。在本发明的一个优选实例中，所述药学上可接受的载体选自130-170重量份的微晶纤维素，1-2重量份的硬脂酸镁，5-15重量份的乳糖及其组合。

本发明还提供了一种本发明所述冻干粉制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将本发明的婴儿双歧杆菌菌种在一级种液培养基中接种培养，得到一级接种产物；

在上述方法中，所述一级种液在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员在阅读本发明的基础上结合其专业知识可以直接得到哪些种液可用作本发明的一级种液。在本发明的一个优选实例中，所述一级种液包括0.1-30重量份的胰蛋白胨、0.1-30重量份的牛肉膏、0.1-30重量份的酵母提取物、0.1-30重量份的乳糖、0.01-10重量份的葡萄糖、0.01-10重量份的磷酸氢二钾、0.01-5重量份的硫酸镁、0.001-5重量份的硫酸亚铁、0.001-5重量份的L-半胱氨酸盐酸盐。在本发明的一个优选实例中，所述一级种液包括1-20重量份的胰蛋白胨、0.1-20重量份的牛肉膏、1-20重量份的酵母提取物、1-20重量份的乳糖、0.1-5重量份的葡萄糖、0.1-5重量份的磷酸氢二钾、0.05-1重量份的硫酸镁、0.01-1重量份的硫酸亚铁、0.005-1重量份的L-半胱氨酸盐酸盐。在本发明的一个优选实例中，所述一级种液包括2.5-10重量份的胰蛋白胨、0.5-10重量份的牛肉膏、2.5-10重量份的酵母提取物、2.5-10重量份的乳糖、0.25-2.5重量份的葡萄糖、0.25-2.5重量份的磷酸氢二钾、0.1-0.5重量份的硫酸镁、0.05-0.25重量份的硫酸亚铁、0.01-0.25重量份的L-半胱氨酸盐酸盐。

在上述方法中，所述二级种液在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员在阅读本发明的基础上结合其专业知识可以直接得到哪些种液可用作本发明的二级种液。在本发明的一个优选实例中，所述二级种液包括0.1-30重量份的胰蛋白胨、0.1-30重量份的牛肉膏、0.1-30重量份的酵母提取物、0.1-30重量份的乳糖、0.01-10重量份的葡萄糖、0.01-10重量份的磷酸氢二钾、0.01-5重量份的硫酸镁、0.001-5重量份的硫酸亚铁、0.001-5重量份的L-半胱氨酸盐酸盐。在本发明的一个优选实例中，所述二级种液包括0.5-10重量份的胰蛋白胨、0.1-10重量份的牛肉膏、0.5-10重量份的酵母提取物、0.5-10重量份的乳糖、0.05-5重量份的葡萄糖、0.05-5重量份的磷酸氢二钾、0.01-1重量份的硫酸镁、0.001-1重量份的硫酸亚铁、0.001-1重量份的L-半胱氨酸盐酸盐。在本发明的一个优选实例中，所述二级种液包括1.5-6重量份的胰蛋白胨、0.3-3重量份的牛肉膏、1.5-6重量份的酵母提取物、1.5-6重量份的乳糖、0.15-1.5重量份的葡萄糖、0.15-1.5重量份的磷酸氢二钾、0.03-0.3重量份的硫酸镁、0.003-0.15重量份的硫酸亚铁、0.003-0.15重量份的L-半胱氨酸盐酸盐。

在上述方法中，所述步骤(c)和(d)中的培养基在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员在阅读本发明的基础上结合其专业知识可以直接得到哪些培养基可用于本发明的。在本发明的一个优选实例中，所述培养基包括0.1-30重量份的胰蛋白胨、0.1-30重量份的牛肉膏、0.1-30重量份的酵母提取物、0.1-30重量份的乳糖、0.01-10重量份的葡萄糖、0.01-10重量份的磷酸氢二钾、0.01-5重量份的硫酸镁和0.001-5重量份的硫酸亚铁。在本发明的一个优选实例中，所述培养基包括0.5-20重量份的胰蛋白胨、0.1-10重量份的牛肉膏、0.5-20重量份的酵母提取物、0.5-20重量份的乳糖、0.05-5重量份的葡萄糖、0.05-5重量份的磷酸氢二钾、0.01-1重量份的硫酸镁和0.001-1重量份的硫酸亚铁。在本发明的一个优选实例中，所述培养基包括1-9重量份的胰蛋白胨、0.3-3重量份的牛肉膏、3-9重量份的酵母提取物、6-12重量份的乳糖、0.15-1.5重量份的葡萄糖、0.15-1.5重量份的磷酸氢二钾、0.03-0.3重量份的硫酸镁、0.003-0.15重量份的硫酸亚铁、0.003-0.15重量份的L-半胱氨酸盐酸盐。

在上述方法中，所述保护剂是常规的所述保护剂是本领域中的常规保护剂。在本发明的一个优选实例中，所述保护剂包含脱脂奶粉0.1-30重量份、谷氨酸钠0.01-10重量份、甘露醇0.01-20重量份、Vc-Na 0.001-10重量份、淀粉0.1-30重量份。在本发明的另一个优选实例中，所述保护剂含脱脂奶粉0.5-20重量份、谷氨酸钠0.05-5重量份、甘露醇0.01-10重量份、Vc-Na 0.001-5重量份、淀粉0.5-20重量份。在本发明的还有一个优选实例中，所述含脱脂奶粉1.5-7.5重量份、谷氨酸钠0.15-1.5重量份、甘露醇0.2-1重量份、Vc-Na 0.003-1.5重量份、淀粉1.5-6重量份。

本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310使用简单，例如可通过口服进行给药。

本发明所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310能长期保存，且能有效地治疗治疗胃肠道功能紊乱性疾病。

下面结合实施例细说明本发明，这些实施例只是用于举例说明的目的，并没有限制本发明的范围。

实施例

实施例1.制备婴儿双歧杆菌的菌种

A.配制PYG液体培养基(配比1)。用50mL纯水溶解下表所示数量的胰蛋白胨(德国MERCK KGAA)、酵母提取物(英国OXID)、L-半胱氨酸盐酸盐(上海康捷生物科技有限公司)、葡萄糖(山东西王生化科技有限公司)、氯化钙(国药集团化学试剂有限公司)、硫酸镁(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司)，得到混悬液，用少许氢氧化钠溶液调节培养基的pH。将培养基置于锥形瓶中，封好瓶口后置于灭菌锅内于121℃灭菌15min。向PYG液体培养基中加入新鲜的健康婴儿的粪便(取自中国福利会国际和平妇幼保健院)，搅拌均匀后低速离心，取上清液于灭过菌的锥形瓶中，用纱布包好，放入厌氧培养箱中37℃培养24小时。

表5.PYG液体培养基配比

B.取0.1mL培养液接种于厌氧血琼脂平板(英国OXOID)，在厌氧培养箱中37℃培养48小时后，挑单菌落划线接种于厌氧培养平板做纯培养，平板置于厌氧培养箱中37℃培养48小时；

C.将平板上的菌种进行镜检观察，并做生理生化试验、遗传学鉴定、脂肪酸分析及抗生素敏感试验，由中国科学院微生物研究所检测鉴定，从而获得婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310。

D.将婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310划线接种于厌氧血琼脂平板，置于厌氧培养箱中37℃培养48小时后，用接种环挑下菌种，与20％脱脂奶粉溶液混匀，取0.2mL于安瓿管中，置冻干机内冻干，冻干机冷冻温度调至-40℃，冷冻4小时后，一次干燥温度为-30℃，真空0.2mbar，时间为30小时；解析干燥温度为15℃，真空0.2mbar，时间为15小时。

E.将安瓿罐充氮气后熔封，置冰箱内保存，为婴儿双歧杆菌菌种。

重复上述步骤，不同的是使用表5所列的其他PYG培养基(即配比2-5)，分别得到婴儿双歧杆菌菌株，由中国科学院微生物研究所通过生理生化试验、遗传学鉴定、脂肪酸分析及抗生素敏感试验鉴定所得的婴儿双歧杆菌菌株与婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310具有相同的性质，分别计为婴儿双歧杆菌菌株2-5，以与上述配比2-5相对应。

实施例2.制备婴儿双歧杆菌的一级种液培养基

用300mL纯水溶解下表所示数量的胰蛋白胨(德国MERCK KGAA)、牛肉膏(英国OXID)、酵母提取物(英国OXID)、乳糖(德国DMV-Fonterra Excipients)、葡萄糖(山东西王生化科技有限公司)、磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司)、硫酸镁(国药集团化学试剂有限公司)、硫酸亚铁(国药集团化学试剂有限公司)、L-半胱氨酸盐酸盐(上海康捷生物科技有限公司)，得到混悬液，用少许氢氧化钠溶液调节培养基的pH。将培养基置于锥形瓶中，封好瓶口后置于灭菌锅内于121℃灭菌15min。

表6.一级种液培养基配比

实施例3.制备婴儿双歧杆菌的二级种液培养基

用3L纯水溶解下表中各组分，得到培养基的混悬液，用少许氢氧化钠溶液调节培养基的pH，将培养基置于5L血清品中，于121℃灭菌15min。

表7.二级种液培养基配比

实施例4.制备婴儿双歧杆菌50L发酵罐培养基

将下表中各组分导入不锈钢桶中，再加入5L纯水溶解，得到培养基的混悬液，将培养基倒入发酵罐中，加水补充至30L，搅拌均匀后，用少许氢氧化钠溶液调节培养基的pH，将培养基于121℃灭菌15min。

表8.50L发酵罐培养基配比

实施例5.制备婴儿双歧杆菌的500L发酵罐培养基

将下表中各组分倒入匀浆机中，加入适量水混匀后，倒入500L发酵罐中，加水补足至300L，搅拌均匀后，用少许氢氧化钠溶液调节培养基的pH，将培养基于121℃灭菌15min。

表9.500L发酵罐培养基配比

实施例6.培养婴儿双歧杆菌并制备菌泥

将实施例1得到的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的菌种以及婴儿双歧杆菌菌株2-5的菌种以无菌接种方式分别接种至实施例2所得一级种液培养基的配比1-5中，静置于厌氧培养箱中37℃恒温培养约12小时，得到一级接种产物1-5；将一级接种产物1-5分别接种到实施例3所得的二级种液培养基的配比1-5中，静置于厌氧培养箱中37℃恒温培养约12小时，得到二级接种产物1-5；将二级接种产物1-5分别接种到实施例4所得50L发酵罐培养基的配比1-5中，保持37℃恒温、转速200rpm/min、通氮气保持厌氧条件培养约12小时后得到50L发酵产物1-5；将50L发酵产物1-5分别接种到实施例5所得500L发酵罐培养基的配比1-5中，保持37℃恒温、转速200rpm/min、通氮气保持厌氧条件培养约12小时后得到发酵产物1-5；将发酵产物1-5分别通入上海离心机械研究所生产的管式离心机进行常温离心，通入发酵液流量控制在4000-9000mL/min，离心结束后，从离心管内挖出菌泥1-5分别置入不锈钢桶。

实施例7.制备婴儿双歧杆菌菌粉

将实施例6所得菌泥1--5分别与下表所示冻干保护剂配比混合均匀，将混合物置入真空冷冻干燥机内冻干。

表10.冻干保护剂配比

冻干机冷冻温度调至-45℃，冷冻4小时后，一次干燥温度为-30℃，真空0.2mbar，时间为30小时；解析干燥温度为10℃，真空0.2mbar，时间为15小时，最终得到冻干菌粉1-5。

实施例8.制备婴儿双歧杆菌胶囊

将填充胶囊所用的辅料微晶纤维素、硬脂酸镁和乳糖烘粉后与实施例7所得菌粉1-7按下列比例投入到多向运动混合机中混合30分钟，得到均匀混合物，使用胶囊填充剂制得胶囊1-5。

表11.填充辅料配比

实施例9.婴儿双歧杆菌制剂的应用

A.抑菌性

婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310产生的乙酸和乳酸有抗菌性，实验研究表明它对葡萄球菌、假单胞菌、大肠杆菌和芽孢杆菌的生长均有抑制作用。在TPY培养基上做抑菌圈试验时，假单胞菌和葡萄球菌的抑菌圈直径约为4.4mm，大肠杆菌的抑菌圈直径约为7.0mm，而在缓冲TPY培养基上进行实验时却没有抑菌圈出现，说明只有婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310产生酸性发酵产物后才能有抑菌活性。

B.缓解IBS症状

IBS是一种非器质性胃肠道功能紊乱性疾病，由于遗传和心理因素的作用，导致胃肠道功能的易感性，出现胃肠道运动异常、内脏高敏感和粘膜免疫的变化，患者表现为与排便或排便习惯改变相关的腹痛或不适，并有排便紊乱的特点。关于婴儿双歧杆菌对IBS疗效的临床研究结果如下：

1.改善IBS患者症状

入选病例：362名罗马II型女性IBS患者。

研究方法：采用随机空白对照试验。在经过两周的基准线期后开始口服实施例8所得胶囊1，实验组分3个剂量组，分别为1×10⁶cfu(n＝90)，1×10⁸cfu(n＝90)，1×10¹⁰cfu(n＝90)。每天记录患者的相关症状并采用立斯特式量表给出分数，根据准备期的情况进行调整，最终得出临床试验结果。

结果：4周实验期结束后，每天摄入1×10⁸cfu婴儿双歧杆菌的患者在腹痛、腹胀、排便不畅或便秘、肠道功能紊乱症状的改变方面明显好于其他剂量组和空白对照组，而总体的症状评估优于对照组20％(p＜0.02)。其他两个剂量组较对照组没有明显改善。说明每天摄入1×10⁸cfu婴儿双歧杆菌能够明显改善IBS患者症状。实验数据如下表所示：

表12.患者症状对比结果

症状	对照组	实验组	P值
				腹痛	-0.58±0.10	-0.89±0.10	0.0226
腹胀	-0.44±0.10	-0.71±0.10	0.0458
				不完全排泄	-0.25±0.10	-0.54±0.10	0.0335
菌株	-0.07±0.09	-0.38±0.09	0.0152
				排气	-0.30±0.09	-0.54±0.09	0.0383
IBS整体症状	-0.42±0.09	-0.76±0.09	0.0074
				排便满意度	-0.26±0.09	-0.55±0.09	0.0151
总分	-1.27±0.26	-2.12±0.25	0.0126
				患者临床症状缓解度	42.0％	62.3％	0.0118

2.使患者肠道蠕动频率恢复正常

入选病例：165名女性IBS患者。

研究方法：采用随机、双盲、空白对照试验。实验开始前7天为基准线期，测定患者的肠道蠕动频率，随后为实验期，实验组85名患者每天摄入含1×10⁸cfu婴儿双歧杆菌的胶囊(实施例8所得的胶囊1)，并测定实验组与对照组患者的肠道蠕动频率，采用协方差分析两者的不同。

结果：摄入婴儿双歧杆菌的患者腹泻及便秘情况均得到了改善，其肠道蠕动频率恢复正常。排便频率分布结果如下表：

表13.排便频率结果

3.对健康人及IBS患者粪便菌群的影响

入选病例：34名健康人，47名IBS患者。

研究方法：所有参与者在2周基准线期内每天摄入不含益生菌的牛奶，随后3周则摄入含10¹⁰cfu婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的牛奶，采集粪便样品，并用分离大肠杆菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、拟杆菌属、所有厌氧菌和肠道病原体的培养基进行分析，双歧杆菌采用特异性探针通过荧光原位杂交技术进行检测，从粪便样品中萃取出DNA，采用末端约束性片段的长度多态性分析来辨别菌群。通过定量PCR分析对健康人及IBS患者体内的双歧杆菌进行比对。

结果：在基线期，健康人及IBS患者粪便中的厌氧菌、拟杆菌属、大肠杆菌和乳酸杆菌是相似的，而IBS患者粪便中金黄色葡萄球菌偏少，肠道病原菌则较多。摄入婴儿双歧杆菌2周后，两组参与者粪便中肠道病原菌的数量差异减小，健康人体内的乳酸杆菌增多。荧光原位杂交分析表明，随着实验的进行，两组参与者体内的婴儿双歧杆菌两菌增加。末端约束性片段的长度多态性分析表明健康人及IBS患者体内的菌群有差异，部分片段是IBS患者特有的，健康人体内由限制性内切酶MspI剪切得到的476-551、553-554碱基对比IBS患者体内的更普遍，而IBS患者体内检测出特有的88、89及552片段。IBS患者体内的婴儿双歧杆菌量明显少于健康人。每天摄入婴儿双歧杆菌能降低IBS患者肠道病原菌数量，提高健康人体内乳酸杆菌的量。

4.调节细胞因子水平的系统免疫平衡

入选病例：10名健康人，13名IBS患者。

研究方法：所有参与者连续3周每天摄入112mL含10¹⁰cfu婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的牛奶，实验前后取静脉血液样品，体外培养分离出的外周血单核细胞3天，分析培养物上清液人细胞因子IL1-β、IL10、IL12、TNF-α、TNF-γ，通过方差分析见准线期及实验结束后健康人及IBS患者体内双歧杆菌的细胞因子水平的差异。

结果：在基准线期，IBS患者的外周血单核细胞自然产生的细胞因子与健康人的没有明显差异，而体外用脂多糖刺激IBS患者的外周血单核细胞的产物中促炎性的细胞因子(IL12、TNF-α、TNF-γ)水平较高(p＜0.1)，抗炎性细胞因子与促炎性细胞因子水平的比例(IL10/TNF-γ)低于健康人。试验期间，摄入婴儿双歧杆菌对两组参与者体内自然产生的细胞因子水平无明显影响，而体外用脂多糖刺激IBS患者的外周血单核细胞的产物中IL12、TNF-α、TNF-γ减少，IL10/IL12、IL10/TNF-γ比例增高。当同样的外周血单核细胞用双歧杆菌刺激后，不仅能产生同样的效果，而且IL10水平也得到提高。口服摄入婴儿双歧杆菌，产生更多的抗炎性细胞因子(IL10)，提高抗炎性细胞因子与促炎性细胞因子水平的比例(IL10/IL12、IL10/TNF-γ)，因此，IBS患者体内的免疫系统更趋向于Th-1型免疫。

5.对结肠中免疫基因表达的影响

入选病例：51名IBS患者

研究方法：采用随机单盲空白对照试验。实验组(n＝37)摄入婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310，对照组不摄入。采集所有患者的结肠组织切片，提取出RNA，分析细胞因子IL1-β、IL8、IL10、IL12、CCL5、CCL20和TGFβ的表达。

结果：相对于对照组，实验组IBS患者的TGFβ的表达表现出最大的增长(p＝0.0003)，IL1-β(p＝0.0022)、CCL5(p＝0.0010)增加量也较多，IL8、IL10、IL12、CCL20的表达量没有明显改变。

C.缓解IBD症状

近亲繁殖饲养实验证实婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310能缓解IBD症状。将8周大的雌性CB-17严格免疫缺陷的小鼠分成四组，A组为对照组，摄入10％脱脂牛奶；B组摄入2.55×10⁸cfu/ml唾液乳杆菌；C组摄入2.55×10⁸cfu/ml唾液乳杆菌及2.35×10⁸cfu/ml婴儿双歧杆菌；D组只摄入2.35×10⁸cfu/ml婴儿双歧杆菌。所有的CB-17严格免疫缺陷小鼠在注入CD4+CD45RB^high细胞两天后开始喂养不同的饲料。实验开始时给小鼠称重，以后每周两次，并观察小鼠的临床症状：外观、皮毛的竖立情况及腹泻情况。每周采集小鼠的粪便样品称重后用PBS连续稀释，在恰当的培养基上培养细菌计数，并与小鼠粪便中原有的益生菌进行对比。饲养结束后，小鼠被处死解剖，取其周围淋巴结、肠系膜淋巴结和部分脾脏样品，称重后用10mL PBS重悬，连续稀释后在恰当的培养基上培养细菌计数。最终的实验结果显示：对照组小鼠体重明显减轻，在第两周半至三周时症状较明显：身体缩成一团，毛发竖立，粪便稀软；B组小鼠症状与对照结果相似，体重均有较明显的减轻；C组小鼠状况较对照组有明显的好转，体重减轻较少，部分小鼠体重略有增加；D组小鼠表现健康，且与对照组相比，体重减轻及其微量，因而能够总结出摄入婴儿双歧杆菌能够缓解IBD症状。

D.抗炎活性

由18名健康志愿者每天摄入1×10⁹cells的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCCNO：M2011310，连续摄入3周，在实验前后取其血液样品做细胞因子分析，取粪便样品做微生物学分析。实验结果表明，志愿者的外周血细胞因子水平有较明显的改变，血清中可溶性的IL-6受体(p＝0.007)、IFN-γ(p＝0.041)和IL-8(p＝0.004)的水平明显减少，而血清TNF-α和IL-1受体拮抗物水平没有变化。在实验过程中，粪便样品中婴儿双歧杆菌含量约为1×10⁵cfu/g。按照体外筛选的标准，能证明婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310具有体外免疫调节的能力。根据免疫缺陷的小鼠和人类志愿者摄入婴儿双歧杆菌的实验结果，表明婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310能调节全身的免疫系统。

E.抗腹泻

目前已有很多研究表明摄入乳酸菌对于预防及治疗新生儿、儿童以及成年人的抗生素引起的腹泻、旅行性腹泻已取得较好的效果。检查摄入婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310的小鼠，发现炎症明显减轻，且粪便性状紧密，而对照组小鼠腹泻症状明显，表明婴儿双歧杆菌有抗腹泻的作用。

F.调节自身免疫

自身免疫病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。免疫复合物的沉积、II型过敏反应和细胞调节反应是免疫病理学破坏发生的主要机理。自身免疫病包括系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、重症肌无力、恶性贫血等。婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310是免疫调节性细菌，因此，有免疫调节疾病的患者摄入该菌能限制器官的破坏，帮助恢复人体内的平衡。

G.缓解癌症

涵盖多种肿瘤类型的多功能细胞因子产品表明，癌症患者都有很明显的炎症反应，而目前尚不清楚这种反应对对抗体内肿瘤细胞的生长和扩散有什么保护作用，另外炎症反应对肿瘤的宿主也有不利作用。肿瘤细胞和正常的组织间，在普通的细胞因子制造和细胞扩增过程中会发生复杂的细胞因子反应。长期以来人们一直认为体重下降是癌症患者致死的最普遍的原因，而且初期的营养不良也不能预测这样的结果。肿瘤要生长和传播，就必需诱导产生新的血管，并减少细胞外间质，炎症反应就起了明显的作用，使宿主衰弱并促进肿瘤的生长。由于婴儿双歧杆菌的抗炎特性，能减少恶性肿瘤细胞转化的比例，更重要的是，肠道菌能再食物组分，含有基因毒性、致癌性和提高肿瘤活性的物质中生长。通常，相对于其他肠道菌如拟杆菌属、真细菌类和梭菌属细菌，双歧杆菌都有较低的异物代谢酶，因此增加它在肠道中的菌量能更有益的调节这种酶的量。

Claims

1.一种婴儿双歧杆菌菌株IFA09，其保藏号为CCTCC NO：M2011310。

2.一种制备权利要求1所述婴儿双歧杆菌菌株IFA09的方法，其特征在于，所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09是通过如下方法获得的：

3.如权利要求2所述的方法，所述培养基优选包括2-20重量份的胰蛋白胨、1-15重量份的酵母提取物、0.05-1重量份的L-半胱氨酸盐酸盐、1-15重量份的葡萄糖、0.0005-0.01重量份的氯化钙、0.0005-0.01重量份的硫酸镁、0.005-0.2重量份的磷酸二氢钾和0.005-0.2重量份的磷酸氢二钾；优选地，所述培养基包括5-15重量份的胰蛋白胨、2-7.5重量份的酵母提取物、0.1-0.5重量份的L-半胱氨酸盐酸盐、2-7.5重量份的葡萄糖、0.001-0.005重量份的氯化钙、0.000-0.005重量份的硫酸镁、0.01-0.05重量份的磷酸二氢钾和0.01-0.05重量份的磷酸氢二钾。

4.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310。

5.一种婴儿双歧杆菌冻干粉制剂，它包括婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCCNO：M2011310菌粉和保护剂。

6.如权利要求5所述的婴儿双歧杆菌冻干粉制剂，其特征在于，所述保护剂包含脱脂奶粉0.1-30重量份、谷氨酸钠0.01-10重量份、甘露醇0.01-20重量份、Vc-Na 0.001-10重量份、淀粉0.1-30重量份；优选地，所述保护剂含脱脂奶粉0.5-20重量份、谷氨酸钠0.05-5重量份、甘露醇0.01-10重量份、Vc-Na 0.001-5重量份、淀粉0.5-20重量份；更优选地，所述含脱脂奶粉1.5-7.5重量份、谷氨酸钠0.15-1.5重量份、甘露醇0.1-1重量份、Vc-Na 0.003-1.5重量份、淀粉1.5-6重量份。

7.如权利要求5所述的婴儿双歧杆菌冻干粉制剂，其特征在于，所述保护剂的用量为0.1-99.9重量份，优选为20-90重量份，更优选为30-80重量份，最优选为40-60重量份。

8.一种权利要求5所述冻干粉制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将权利要求1所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09 CCTCC NO：M2011310在一级种液培养基中接种培养，得到一级接种产物；

9.权利要求1所述的婴儿双歧杆菌菌株IFA09CCTCC NO：M2011310在制备药物中的用途，所述药物用于治疗胃肠道功能紊乱性疾病。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述胃肠道功能紊乱性疾病选自IBS症状、IBD症状、炎症、腹泻、自身免疫疾病和癌症。