CN111876352A - 一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌及其筛选方法 - Google Patents

一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及发酵工程技术领域，更具体地，本发明提供一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌及其筛选方法。本发明的第一方面提供一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌，保藏号为CGMCC No.14803，其在特定培养基下达到在pH 4.0，普通有氧33～39℃下培养得到的活菌数高达7.9×107，而相比于初始婴儿双歧杆菌在pH 4.0，普通有氧33～39℃下培养得到的活菌数为2.4×103，具有明显的耐酸、耐氧性的提高。

Description

一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌及其筛选方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，更具体地，本发明提供一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌及其筛选方法。
背景技术
2001年，世界粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对益生菌做了如下定义：通过摄取适当的量、对食用者的身体健康能发挥有效作用的活菌。作为益生菌应该具备以下条件：(1)无毒性、无致病性；(2)对人体安全；(3)能在消化道存活；(4)抗胃酸和胆汁；(5)能在肠道内定殖；(6)能够产生对宿主有用的酶类和代谢物；(7)在加工和贮存过程中能保持活性。2005年5月我国国家食品药品监督管理局颁布了《益生菌类保健食品申报与评审规定》，并公布了一批可用于保健食品的益生菌菌种，分别为：两歧双歧杆菌、双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌和罗伊氏乳杆菌。
双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状、严格厌氧的细菌属，广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中。双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一。双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。它能抑制人体有害细菌的生长，抵抗病原菌的感染，合成人体需要的维生素，促进人体对矿物质的吸收，产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，促进排便，防止便秘以及抑制肠道腐败作用、净化肠道环境、分解致癌物质、刺激人体免疫系统，从而提高抗病能力等方面有着重要作用。
影响双歧杆菌在生物制品存活率的因素有多种，包括菌种、pH、溶解氧、贮存条件、发酵产物等。由于双歧杆菌是专性厌氧菌，与好氧菌相比它缺乏将溶解氧转化为水分子的系统，致使氧气不能完全还原过氧化氢；另外，双歧杆菌体内缺乏过氧化氢酶，与氧气的接触会导致一些代谢产物如O2 -、OH-、H2O2在细胞内积累，最终导致细胞死亡，所以在制造和贮存过程中与溶解氧的接触是影响双歧杆菌存活和稳定性的一个重要因素。双歧杆菌对环境pH的变化也非常敏感，其最适生长pH为6.5～7.0，当环境pH一旦高于8.0或低于4.5时，便会停止生长，甚至会大量死亡，特别是人源性双歧杆菌其酸耐受力非常差。众所周知，双歧杆菌只有在肠道内才能发生益生功能，所以它必须具有良好的贮存稳定性和耐酸性能。双歧杆菌在有氧和酸度较低的条件下，生长缓慢并且容易死亡，而在实际生产过程中严格厌氧不仅难度大而且成本高，给生产双歧杆菌制品的厂家带来很大困难，因此筛选一株耐氧耐酸婴儿双歧杆菌具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一方面提供一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌，保藏号为CGMCC No.14803。
作为本发明的一种优选技术方案，所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的活菌数为7.9×107，其中，所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的培养条件为pH 4.0，普通有氧33～39℃下培养。
作为本发明的一种优选技术方案，所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的培养所用的培养基组成包括：葡萄糖、乳糖、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸粉、氯化钠、氯化镁，磷酸氢二钾、硫酸锌、L-半胱氨酸盐酸盐、谷氨酸。
本发明的第二方面提供一种所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，通过双歧杆菌进行连续耐氧、耐酸驯化所得。
作为本发明的一种优选技术方案，所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法包括第一种子液的制备、耐氧婴儿双歧杆菌初筛、耐氧婴儿双歧杆菌复筛、第二种子液的制备、耐酸菌株的驯化。
作为本发明的一种优选技术方案，第一种子液的制备方法为：以3.5～6.5％接种量将双歧杆菌接种于液体培养基中，于33～39℃厌氧箱中静置培养10～12h。
作为本发明的一种优选技术方案，耐氧婴儿双歧杆菌初筛过程为：将第一种子液以3.5～6.5％接种量接种于液体培养基中，33～39℃、100r/min恒温振荡培养14-18h，培养结束后对发酵液进行梯度稀释，并涂布于固体培养基，再放于普通生化培养箱中33～39℃好氧培养48h，挑取3个菌落较大并且光滑的单菌落于液体培养基中，33～39℃、100r/min恒温振荡培养14-16h，得到初耐氧婴儿双歧杆菌。
作为本发明的一种优选技术方案，第二种子液的制备为：以5％接种量将耐氧婴儿双歧杆菌复筛得到的耐氧婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，33～39℃、150r/min恒温振荡培养14-16h。
作为本发明的一种优选技术方案，耐酸菌株的驯化过程为：将第二种子液以5％接种量接种于液体培养基中，液体培养基pH由大到小依次设置多个梯度，每个pH梯度传代3～5次反复驯化，驯化后挑选耐酸的单菌落再接种到下一个pH值，即得，pH梯度范围为6.5～4。
作为本发明的一种优选技术方案，所述液体培养基成分包括：水解酪蛋白、大豆胨、酵母粉、葡萄糖、L-半胱氨酸、谷氨酸钠、维生素C、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸锌、氯化钙、氯化铁、吐温80。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.本发明所用的婴儿双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物，具有多种重要的生理功能，作为益生菌在食品与医药产业化领域倍受认可。
2.本发明有效改善了婴儿双歧杆菌的生理特性，增强了其耐氧耐酸能力，使其更容易存活与生长。
3.本发明将耐氧耐酸菌株在pH值4.0的发酵培养基中37℃有氧培养后，其活菌数能达到7.9×107CFU/mL，这对婴儿双歧杆菌活菌制品的研究及应用有重要意义。
附图说明
图1：本发明的实施例3所得耐氧耐酸婴儿双歧杆菌在普通有氧条件下与初始婴儿双歧杆菌在厌氧条件下发酵后OD600与pH的比较；
图2：本发明的实施例3所得耐氧耐酸婴儿双歧杆菌与初始婴儿双歧杆菌在普通有氧条件下发酵后OD600与pH的比较。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
本发明提供一种具有较好耐酸耐氧性的婴儿双歧杆菌，其在特定培养基下达到在pH 4.0，普通有氧33～39℃下培养得到的活菌数高达7.9×107，而相比于初始婴儿双歧杆菌在pH 4.0，普通有氧33～39℃下培养得到的活菌数为2.4×103，具有明显的耐酸、耐氧性的提高。
本发明的第一方面提供一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌，保藏号为CGMCC No.14803，保藏时间为2017年10月12日；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明的第二方面提供一种所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，通过初始婴儿双歧杆菌进行连续耐氧、耐酸驯化所得。
本发明对双歧杆菌的来源不做特别限定，所述婴儿双歧杆菌菌种购自上海复祥生物。
本发明所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法包括第一种子液的制备、耐氧婴儿双歧杆菌初筛、耐氧婴儿双歧杆菌复筛、第二种子液的制备、耐酸菌株的驯化。
本发明所述第一种子液的制备方法为：以3.5～6.5％接种量将初始婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，装液量为100/100mL蓝口瓶，于33～39℃厌氧箱中静置培养10～12h；优选地，所述第一种子液的制备方法为：以3.5～6.5％接种量将初始婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，装液量为100/100mL蓝口瓶，于33～39℃厌氧箱中静置培养10～12h；进一步优选地，接种量为4.5～5.5％；更优选地，接种量为5％。
本发明所述接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。
进一步地，所述耐氧婴儿双歧杆菌初筛过程为：将所得第一种子液以3.5～6.5％接种量接种于液体培养基中，33～39℃、100r/min恒温振荡培养14-18h，培养结束后对发酵液进行梯度稀释，分别为10-6、10-5、10-4，并涂布于固体培养基，再放于普通生化培养箱中33～39℃好氧培养48h，挑取3个菌落(挑取标准：菌落呈浅灰黄色，光滑圆形，中央稍微凸起，菌落直径能达到1mm以上)于液体培养基中，33～39℃、100r/min恒温振荡培养14-16h，得到初耐氧婴儿双歧杆菌。
进一步地，本发明所述耐氧婴儿双歧杆菌复筛过程为：将初筛所得3株初耐氧婴儿双歧杆菌以3.5～6.5％的接种量接种于液体培养基中，装液量为50/250mL三角瓶，37℃、150r/min恒温振荡培养14-16h，对菌株进行复筛，通过测定OD600值比较其耐氧性；OD600值由大至小排列，选出前三名的菌株，以同样的条件传代3～5次反复驯化，得到耐氧婴儿双歧杆菌。
本发明所述“OD600”用于测定细胞密度，测定方法为将紫外分光光度计上的吸光度调至600nm处，吸取一定量的待测样品加到石英比色皿中，并对样品进行稀释，最终的样品体积需为2.5-3.0mL，并且测出的结果在0.2-0.8之间，如果不在此区间内，则稀释倍数不合适，需要重新调整，OD600值为测定出的结果乘以相应的稀释倍数。
本发明所述第二种子液的制备为：以3.5～6.5％接种量将耐氧婴儿双歧杆菌复筛得到的耐氧婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，33～39℃、150r/min恒温振荡培养14-16h；优选地，所述第二种子液的制备为：以5％接种量将耐氧婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，装液量为50/250mL三角瓶，37℃、150r/min恒温振荡培养14-16h。
进一步地，所述耐酸菌株的驯化过程为：将第二种子液以3.5～6.5％接种量接种于液体培养基中，液体培养基pH由大到小依次设置多个梯度，每个pH梯度传代3～5次反复驯化，驯化后挑选耐酸的单菌落再接种到下一个pH值，即得，pH梯度范围为6.5～4；优选地，所述耐酸菌株的驯化过程为：将第二种子液以5％接种量接种于液体培养基中，液体培养基pH设置5个梯度，分别为6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0，每个pH梯度传代3～5次反复驯化，驯化后挑选耐酸的单菌落再接种到下一个pH值，即得。
本发明采用先进行耐氧条件的初筛与复筛，再将所得耐氧菌种进行耐酸驯化，且耐氧过程中利用不同梯度发酵液再次进行培养，筛选出耐氧效果较好的菌种，接着对其进行复筛与反复驯化，得到耐氧值较高的菌种；其次，对其进行酸驯化，且在酸驯化过程中利用梯度酸值减小的条件进行，避免菌种因为环境的骤变而死亡，通过逐步降低酸值，提高菌种对酸环境的适应能力，从而得到耐氧、耐酸的婴儿双歧杆菌，在该过程中，无论是氧环境还是酸环境，均通过层层筛选，再及进行培养，挑选、筛选、提高菌种对氧以及酸的适应能力。
本发明所述得到的耐氧耐酸的婴儿双歧杆菌的培养过程为：将所得耐氧耐酸的婴儿双歧杆菌的种子液以5％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/500mL三角瓶，37℃、150r/min恒温振荡培养14-16h，测OD600并进行活菌计数。
优选地，所述液体培养基成分包括：水解酪蛋白、大豆胨、酵母粉、葡萄糖、L-半胱氨酸、谷氨酸钠、维生素C、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸锌、氯化钙、氯化铁、吐温80；优选地，所述酵母粉为发酵级酵母粉，除含高蛋白之外，还富含肌醇，VB1、VB2、尼古丁酸、吡多胺、叶酸、未知生长因子和多种氨基酸等；进一步优选地，所述液体培养基成分包括：8～13g/L水解酪蛋白、3.5～6.5g/L大豆胨、0.5～3.5g/L酵母粉、3.5～6.6g/L葡萄糖、0.32～0.66g/LL-半胱氨酸、0.25～0.56g/L谷氨酸钠、0.5～1.3g/L维生素C、1.5～3.5g/L磷酸氢二钾、0.23～0.75g/L氯化镁、0.13～0.36g/L硫酸锌、0.05～0.3g/L氯化钙、0.000001～0.00001g/L氯化铁、0.37～1.79g/L吐温80；更优选地，所述液体培养基成分包括：10g/L水解酪蛋白、5.5g/L大豆胨、2.5g/L酵母粉、5g/L葡萄糖、0.55g/L L-半胱氨酸、0.45g/L谷氨酸钠、0.85g/L维生素C、2.2g/L磷酸氢二钾、0.46g/L氯化镁、0.23g/L硫酸锌、0.15g/L氯化钙、0.000005g/L氯化铁、1.23g/L吐温80。
所述酵母粉购自山东英朗生物科技有限公司，为发酵级酵母粉。
进一步优选地，所述液体培养基的条件为：pH为6.5±0.1；于121℃灭菌20min。
优选地，所述固体培养基的成分包括液体培养基的所有成分，此外还包括琼脂；优选地，琼脂的浓度为15～25g/L；进一步优选地，琼脂的浓度为20g/L。
进一步优选地，所述固体培养基的条件为：pH为6.5±0.1；于121℃灭菌20min。
在耐氧、耐酸筛选与驯化过程中，申请人发现当采用特定培养基进行菌种培养与发酵时，有利于提高所得菌种的耐氧、耐酸特性，尤其当液体培养基的成分与组成包括0.5～3.5g/L酵母粉、3.5～6.6g/L葡萄糖、0.32～0.66g/L L-半胱氨酸、0.25～0.56g/L谷氨酸钠、0.5～1.3g/L维生素C，其与培养基中的其他成分共同作用，提高所得菌种的耐氧、耐酸特性，可能是由于葡萄糖、L-半胱氨酸、谷氨酸钠、0.5～1.3g/L维生素C协同作用，降低培养基的氧化还原电位，促进菌种的生长，同时，随着氧气浓度的提高，对氧气的耐受力逐渐提高，生长过程中氧气浓度的提高以及培养基中氧化还原电位之间的平衡与抑制有利于筛选出耐氧型菌种；此外，由于培养基中H+的积累会在细胞膜内外形成质子传递链，而质子传递是消耗能量的，厌氧菌本身就比好氧菌难取得能量，所以H+积累不利于菌体生长，质子传递还会导致有机酸在细胞内积累，也不利于生长，由此可见pH对菌体的生长的很重要，而pH的缓慢变化有利于菌体生长，这也是本申请采用逐步递减的原因，此外，本申请采用特定的培养基，采用谷氨酸钠的盐、葡萄糖、L-半胱氨酸以及维生素C共同作用，调节体系的静电平衡以及碳氮比例，有利于在培养过程中pH的缓慢降低，从而提高菌种的耐酸特性。
优选地，所述发酵培养基的成分包括葡萄糖、乳糖、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸粉、氯化钠、氯化镁、磷酸氢二钾、硫酸锌、L-半胱氨酸盐酸盐、谷氨酸钠；优选地，所述发酵培养基的成分包括葡萄糖8～12g/L，乳糖8～12g g/L，蛋白胨15～25g/L，牛肉浸膏6.5～9.5g/L，酵母浸粉3.5～6.5g/L，氯化钠5～7g/L，氯化镁0.3～0.7g/L，磷酸氢二钾1.8～4.6g/L，硫酸锌1.5～3.5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.3～0.7g/L、谷氨酸0.35～0.72g/L；更优选地，所述发酵培养基的成分包括葡萄糖10g/L，乳糖10g/L，蛋白胨20g/L，牛肉浸膏8g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠6g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸锌2g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L、谷氨酸0.67g/L。
进一步优选地，所述发酵培养基的条件为：pH为4.0；于115℃灭菌20min。
在实验过程中可以实现在酸性条件下，双歧杆菌具有较高的活性，尤其当所用发酵培养基成分及比例为：葡萄糖8～12g/L，乳糖8～12g g/L，蛋白胨15～25g/L，牛肉浸膏6.5～9.5g/L，酵母浸粉3.5～6.5g/L，氯化钠5～7g/L，氯化镁0.3～0.7g/L，磷酸氢二钾1.8～4.6g/L，硫酸锌1.5～3.5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.3～0.7g/L、谷氨酸0.35～0.72g/L，可能是由于在葡萄糖、乳糖、牛肉浸膏、酵母浸粉以及半胱氨酸盐酸盐、谷氨酸协同作用下，使得体系具有合适的氮源、碳源的比例，有效维持培养基的pH，避免pH的突然变化给菌种带来的激烈反应，提高所得菌种的活菌数，实现在在pH值4.0的发酵培养基中37℃有氧培养后，其活菌数能达到7.9×107CFU/mL。
实施例1
本发明的实施例1提供一种耐氧菌种，其制备方法如下：
(1)第一种子液的制备：以5％接种量将初始婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，装液量为100/100mL蓝口瓶，于37℃厌氧箱中静置培养12h；
(2)耐氧婴儿双歧杆菌初筛过程：将所得第一种子液以5％接种量接种于液体培养基中，37℃、100r/min恒温振荡培养16h，培养结束后对发酵液进行梯度稀释并涂布于固体培养基，分别为10-6、10-5、10-4，再放于普通生化培养箱中37℃好氧培养48h，挑取3个菌落(挑取标准：菌落呈浅灰黄色、光滑圆形、中央稍微凸起，菌落直径能达1mm以上)于液体培养基中，37℃、100r/min恒温振荡培养16h，得到初耐氧婴儿双歧杆菌；
(3)耐氧婴儿双歧杆菌复筛过程：将初筛所得3株初耐氧婴儿双歧杆菌以5％的接种量接种于液体培养基中(编号分别为1、2、3)，装液量为50/250mL三角瓶，37℃、150r/min恒温振荡培养16h，对菌株进行复筛，通过测定OD600值比较其耐氧性；OD600值由大至小排列，选出前三名的菌株，以同样的条件传代3～5次反复驯化，得到耐氧婴儿双歧杆菌。
测定所得耐氧婴儿双歧杆菌的OD600值，具体如下：
表1.
Figure BDA0002606149510000081
实施例2
本发明的实施例2提供一种耐氧耐酸菌种，其制备方法如下：
(1)第二种子液的制备：以5％接种量将实施例1所得编号1的菌种接种于液体培养基中，装液量为50/250mL三角瓶，37℃、150r/min恒温振荡培养16h；
(2)耐酸菌株的驯化过程：将第二种子液以5％接种量接种于液体培养基中，液体培养基pH设置5个梯度，分别为6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0，每个pH梯度传代3～5次反复驯化，驯化后挑选耐酸的单菌落再接种到下一个pH值，即得。
上述实施例1与实施例2所用到的培养基的成分与比例如下：
液体培养基成分包括：10g/L水解酪蛋白、5.5g/L大豆胨、2.5g/L酵母粉、5g/L葡萄糖、0.55g/L L-半胱氨酸、0.45g/L谷氨酸钠、0.85g/L维生素C、2.2g/L磷酸氢二钾、0.46g/L氯化镁、0.23g/L硫酸锌、0.15g/L氯化钙、0.000005g/L氯化铁、1.23g/L吐温80；pH为6.5±0.1；于121℃灭菌20min。
所述固体培养基的成分包括液体培养基的所有成分，此外还包括琼脂；琼脂的浓度为20g/L。
实施例3
本发明的实施例3培养所得耐氧耐酸菌种以判断生长特性，培养耐氧耐酸菌种的发酵培养基的成分为：葡萄糖10g/L，乳糖10g/L，蛋白胨20g/L，牛肉浸膏8g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠6g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸锌2g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L、谷氨酸0.67g/L；于115℃灭菌20min；
(i)培养条件为：有氧条件下，pH为4.0；所用菌种分别为实施例2所得耐氧耐酸婴儿双歧杆菌和初始婴儿双歧杆菌；发酵结束后活菌计数，比较其生长特性；结果如表2；
(ii)培养条件：将初始婴儿双歧杆菌厌氧条件下，实施例2所得耐氧耐酸婴儿双歧杆菌在有氧条件下培养，发酵培养基pH为6.7，每隔2h分别取样测定OD600和pH，发酵结束后活菌计数，比较其生长特性；结果如表2与图1；
(iii)培养条件：有氧条件下，pH为6.7；所用菌种分别为实施例2所得耐氧耐酸婴儿双歧杆菌和初始婴儿双歧杆菌；每隔2h分别取样测定OD600和pH，发酵结束后活菌计数，比较其生长特性；结果如表2与图2；
表2
Figure BDA0002606149510000091
实施例4
本发明的实施例4提供一种耐氧耐酸菌种，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，将液体以及固体培养基中的谷氨酸钠含量替换为0；
再将所得菌种进行培养，所用发酵培养基成分与比例同实施例3；
培养条件：有氧条件下，pH为4.0。
实施例5
本发明的实施例5提供一种耐氧耐酸菌种，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，将液体以及固体培养基中的维生素C含量替换为0；
再将所得菌种进行培养，所用发酵培养基成分与比例同实施例3；
培养条件：有氧条件下，pH为4.0。
实施例6
本发明的实施例6提供一种耐氧耐酸菌种，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，将液体以及固体培养基中的氯化铁含量替换为0；
再将所得菌种进行培养，所用发酵培养基成分与比例同实施例3；
培养条件：有氧条件下，pH为4.0。
实施例7
本发明的实施例7提供一种耐氧耐酸菌种，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，将液体以及固体培养基中的氯化铁含量替换为0.01g/L；
再将所得菌种进行培养，所用发酵培养基成分与比例同实施例3；
培养条件：有氧条件下，pH为4.0。
实施例8
本发明的实施例8培养所得耐氧耐酸菌种以判断生长特性，所用菌种为实施例2所得菌种，所用发酵培养基成分与比例同实施例3；不同之处在于，发酵培养基中乳糖替换为果胶；
培养条件：有氧条件下，pH为4.0。
实施例9
本发明的实施例9培养所得耐氧耐酸菌种以判断生长特性，所用菌种为实施例2所得菌种，所用发酵培养基成分与比例同实施例3；不同之处在于，发酵培养基中蛋白胨替换为大豆胨；
培养条件：有氧条件下，pH为4.0。
实施例10
本发明的实施例10培养所得耐氧耐酸菌种以判断生长特性，所用菌种为实施例2所得菌种，所用发酵培养基成分与比例同实施例3；不同之处在于，发酵培养基中谷氨酸替换为L-半胱氨酸；
培养条件：有氧条件下，pH为4.0。
发酵结束后比较实施例4～10所得活菌数，比较其生长特性，见表3；
表3
菌体数(CFU/mL)
实施例4 5.8×10<sup>7</sup>
实施例5 5.1×10<sup>7</sup>
实施例6 4.8×10<sup>7</sup>
实施例7 4.2×10<sup>7</sup>
实施例8 6.5×10<sup>7</sup>
实施例9 6.2×10<sup>7</sup>
实施例10 6.9×10<sup>7</sup>
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种耐氧耐酸婴儿双歧杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.14803。
2.根据权利要求1所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌，其特征在于，所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的活菌数为7.9×107，其中，所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的培养条件为pH 4.0，普通有氧33～39℃下培养。
3.根据权利要求1或2所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌，其特征在于，所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的培养所用的培养基组成包括：葡萄糖、乳糖、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸粉、氯化钠、氯化镁，磷酸氢二钾、硫酸锌、L-半胱氨酸盐酸盐、谷氨酸。
4.一种如权利要求1～3任一项所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，其特征在于，通过初始婴儿双歧杆菌进行连续耐氧、耐酸驯化所得。
5.根据权利要求4所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，其特征在于，包括第一种子液的制备、耐氧婴儿双歧杆菌初筛、耐氧婴儿双歧杆菌复筛、第二种子液的制备、耐酸菌株的驯化。
6.根据权利要求5所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，其特征在于，第一种子液的制备方法为：以3.5～6.5％接种量将初始婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，于33～39℃厌氧箱中静置培养10～12h。
7.根据权利要求5所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，其特征在于，耐氧婴儿双歧杆菌初筛过程为：将第一种子液以3.5～6.5％接种量接种于液体培养基中，33～39℃、100r/min恒温振荡培养14-18h，培养结束后对发酵液进行梯度稀释并涂布于固体培养基，再放于普通生化培养箱中33～39℃好氧培养48h，挑取3个菌落较大并且光滑的单菌落于液体培养基中，33～39℃、100r/min恒温振荡培养14-16h，得到初耐氧婴儿双歧杆菌。
8.根据权利要求5所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，其特征在于，第二种子液的制备为：以3.5～6.5％接种量将耐氧婴儿双歧杆菌复筛得到的耐氧婴儿双歧杆菌接种于液体培养基中，33～39℃、150r/min恒温振荡培养14-16h。
9.根据权利要求8所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，其特征在于，耐酸菌株的驯化过程为：将第二种子液以3.5～6.5％接种量接种于液体培养基中，液体培养基pH由大到小依次设置多个梯度，每个pH梯度传代3～5次反复驯化，驯化后挑选耐酸的单菌落再接种到下一个pH值，即得，pH梯度范围为6.5～4。
10.根据权利要求6～9任一项所述耐氧耐酸婴儿双歧杆菌的筛选方法，其特征在于，所述液体培养基成分包括：水解酪蛋白、大豆胨、酵母粉、葡萄糖、L-半胱氨酸、谷氨酸钠、维生素C、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸锌、氯化钙、氯化铁、吐温80。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806920A (zh) * 2022-02-28 2022-07-29 广州栋方生物科技股份有限公司 一种双歧杆菌的培养基及其培养方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04320642A (ja) * 1991-04-17 1992-11-11 Yukijirushi Roorii Kk 耐酸性及び酸素耐性を有する新規ビフィズス菌
TW357191B (en) * 1996-06-04 1999-05-01 Food Industry Development Res Institute Bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method the invention relates to bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method
CN102206599A (zh) * 2011-04-11 2011-10-05 天津科技大学 一种耐氧耐酸性长双歧杆菌
CN103131647A (zh) * 2011-11-29 2013-06-05 上海信谊药厂有限公司 婴儿双岐杆菌及其制剂

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04320642A (ja) * 1991-04-17 1992-11-11 Yukijirushi Roorii Kk 耐酸性及び酸素耐性を有する新規ビフィズス菌
TW357191B (en) * 1996-06-04 1999-05-01 Food Industry Development Res Institute Bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method the invention relates to bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method
CN102206599A (zh) * 2011-04-11 2011-10-05 天津科技大学 一种耐氧耐酸性长双歧杆菌
CN103131647A (zh) * 2011-11-29 2013-06-05 上海信谊药厂有限公司 婴儿双岐杆菌及其制剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张德纯: "双歧杆菌的分离驯化与鉴定", 《中国微生态学杂志》 *
张旭等: "双歧杆菌的分离鉴定与耐氧驯化", 《现代食品科技》 *
顾瑞霞等: "一株婴儿双歧杆菌生长及存活特性的研究", 《江苏农学院学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806920A (zh) * 2022-02-28 2022-07-29 广州栋方生物科技股份有限公司 一种双歧杆菌的培养基及其培养方法与应用
CN114806920B (zh) * 2022-02-28 2024-02-06 广州栋方生物科技股份有限公司 一种双歧杆菌的培养基及其培养方法与应用

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