JPH04320642A

JPH04320642A - 耐酸性及び酸素耐性を有する新規ビフィズス菌

Info

Publication number: JPH04320642A
Application number: JP3112402A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Yoshino; 泰吉野; Ikuo Kato; 育男加藤; Kiyotaka Shiraiwa; 白岩　清隆; Shigeyuki Mihashi; 三橋　重之
Original assignee: YUKIJIRUSHI ROORII KK; Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: YUKIJIRUSHI ROORII KK; Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1991-04-17
Filing date: 1991-04-17
Publication date: 1992-11-11
Anticipated expiration: 2014-07-19
Also published as: JP2922013B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、耐酸性及び酸素耐性を
有する新規なビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆ
ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｒｅｖｅ）に関する。本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベは、耐酸性及
び酸素耐性が良好であるので、発酵乳のスターターとし
て有用である。

【０００２】

【従来の技術】一般的に、ビフィズス菌は、乳幼児から
老人に至るまで人の健康と深く関わっているといわれて
いる。現在、ビフィズス菌を利用した医薬品や食品は大
変多く、特に発酵乳（ヨーグルト）などの乳製品に多く
使われている。しかしながら、この商品の中で高い生菌
数を維持しているものは少ない。これは、ビフィズス菌
がその生存に嫌気条件を必要とし、発酵乳のような低ｐ
Ｈ域では生存し難いこと、また、栄養要求性が複雑で酵
母エキスのような生育促進物質の添加を必要とすること
等が挙げられる。

【０００３】このような点からビフィズス菌の耐酸性株
、酸素耐性株について研究が行われ、ビフィドバクテリ
ウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
　ｂｉｆｉｄｕｍ）については、耐酸性変異株の存在、
及びその菌株による発酵乳の製造法（特公昭５６−４２
２５０号公報）、耐酸性株を用いての酸性乳の製造法（
特開昭６１−２０５４８１号公報）、ビフィドバクテリ
ウム・ブレーベ（Ｂ．　ｂｒｅｖｅ）については、酸素
耐性変異株の存在、及びその菌株による発酵乳の製造法
（特公昭５９−５３０３１号公報）、耐酸性株を用いて
の酸性乳の製造法（特開昭６１−２０５４８１号公報）
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．　ｌｏｎｇｕｍ
　）については、耐酸性変異株の存在、及びその菌株に
よる発酵乳の製造法（特開昭５９−５３８２９号公報）
、過酸化水素耐性変異株の存在、及びその菌株による培
養組成物（特開昭６１−１８５１８２号公報）等が、現
在までに知られている。また、発酵乳などへの使用菌種
としては、乳幼児にはビフィドバクテリウム・ブレーベ
（Ｂ．　ｂｒｅｖｅ）、幼児から成人用にはビフィドバ
クテリウム・ロンガム（Ｂ．　ｌｏｎｇｕｍ　）が推奨
されている（化学と生物　　Ｖｏｌ．　２１，　Ｎｏ．
　１，８〜９頁）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ビフィ
ズス菌の利用におけるこのような現状に鑑み、発酵乳等
の乳製品中で高い生菌数で生存し得る乳酸菌、換言すれ
ば高い耐酸性、及び酸素耐性を示す乳酸菌を探索した。その結果、母乳栄養児の糞便からこのような性質をもつ
乳酸菌を発見し、これを発酵乳のスターターとして使用
し得ることを見出し、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明の目的は、高い耐酸性及
び酸素耐性をもち、発酵乳のスターターとして用いるこ
とができる乳酸菌を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、高い耐酸性及
び酸素耐性を示すビフィドバクテリウム・ブレーベに関
する。

【０００７】本発明の耐酸性は、（１）菌体をｐＨ４．
３の滅菌酢酸緩衝液に懸濁し、５℃で７日間保存したと
き、少なくとも生残を示し、かつ（２）菌体を還元脱脂
乳で培養し、ｐＨ４．１に達したとき急冷して５℃で７
日間保存しても少なくとも生残を示すものである。また
、さらに（３）酸素耐性は、菌体を撹拌還元脱脂乳で４
８時間培養したとき、少なくとも増殖を示すものである
。

【０００８】本発明は、ビフィドバクテリウム・ブレー
ベのなかで強い耐酸性を有する菌株を得るために、各種
の試料を用いて検索したところ、健康な母乳栄養児の糞
便から分離した菌株のなかに好気的発育の優れたものを
見出し、これを選び出し、さらに低ｐＨの酢酸緩衝液で
数回処理し、そのなかから最も生育性に優れた菌株ビフ
ィドバクテリウム・ブレーベＳＢＲ３２１２を分離した
。この菌株は、ビフィドバクテリウム・ブレーベの菌学
的性質を示すが、さらに高い耐酸性及び酸素耐性を有す
る点で新規であり、微工研に微工研菌寄第１１９１５号
として寄託されている。

【０００９】本発明の新菌株は、全乳、脱脂乳、又は還
元乳などからなる牛乳培地、あるいは乳糖またはグルコ
ース等を主成分とする合成あるいは半合成培地に接種培
養することによってビフィドバクテリウム菌を含有する
生残性の高い乳酸菌スターターを得ることができる。

【００１０】そして、この乳酸菌スターターを用いてド
リンクヨーグルト、酸性乳飲料等の発酵乳を製造すると
生菌数の高い発酵乳を得ることができる。

【００１１】次に、本発明の高い耐酸性及び酸素耐性を
もつビフィドバクテリウム・ブレーベの分離方法を具体
的に説明する。生後数ヶ月の母乳栄養児８名の糞便から
光岡の方法（１９８０年叢文社発行　　光岡知足著「腸
内細菌の世界」５３〜９２頁）に従って分離操作を行っ
てビフィズス菌２５菌株を得た。このうちビフィドバク
テリウム・ブレーベは１３菌株であった。

【００１２】この菌株１３株をまず酸素耐性菌株のスク
リーニングを行った。すなわち、この菌株をブリッグス
リバーブロス（Ｂｒｉｇｇｓ　ｌｉｖｅｒ　ｂｒｏｔｈ
）（光岡知足：臨床検査、１８、１１６３〜１１７２頁
（１９７４））中で培養し、集菌洗浄し、原液の２倍濃
度の菌体液を調製した。この菌体液を、０．５％酵母エ
キス入り１２％還元脱脂乳（１８×１８０ｍｍ試験管）
に２％接種し、１０秒間激しく撹拌し、３７℃で２４時
間培養した。培養物のカード形成性、乳酸酸度及びｐＨ
を測定し、少なくとも培養物のカード形成を示した菌株
を酸素耐性株とした。１３菌株から、酸素耐性株２株を
得た。

【００１３】次に、この酸素耐性株２株を用いて耐酸性
菌株のスクリーニング試験を行なった。すなわち、酸素
耐性株をブリッグスリバーブロスで培養し、集菌洗浄し
、原液の２倍濃度の菌体液を調製した。この菌体液を、
ｐＨ４．３の１／１００Ｍ酢酸緩衝液（１８×１８０ｍ
ｍ試験管）に５％分散し、５℃、３日間保存し、ＢＬ平
板寒天培地（日水製薬製）で３７℃、７２時間嫌気培養
を行なった。このような培養によって出現したコロニー
をブリッグスリバーブロスで３７℃、２４時間培養を行
なった。このようにして得られた培養液を用い、前記菌
体液の調製、嫌気培養及び出現したコロニーをブリッグ
スリバーブロスでの培養を繰り返して３回行い、最終操
作でＢＬ平板寒天培地に形成されたコロニーを耐酸性菌
とした。この結果、前記酸素耐性株から耐酸性菌１株を
得た。この菌株をビフィドバクテリウム・ブレーベＳＢ
Ｒ３２１２株とし、微工研に寄託した。この菌の受託番
号は、微工研菌寄第１１９１５号であった。

【００１４】次に本発明の耐酸性及び酸素耐性をもつ菌
株の菌学的性質を示すと次のとおりである。１．分類学
的性状（１）　　菌　　　　形（光学顕微鏡による観察）ＢＬ
寒天平板培地を用い、３７℃、４８〜７２時間スチール
ウール法により嫌気培養したとき大きさ：０．５±０．３×１．１±０．５μｍ形　　状
：棍棒状あるいは分岐状の菌形を示す（２）　　グラム
染色性前記（１）と同一条件で培養したとき陽性あるい
は弱陽性を示す（３）　　コロニー形態前記（１）と同一条件で培養したときのコロニーの形態
は次のとおりである形　　状：円　　形隆　　起：円錐状あるいは凸円状周　　縁：円　　滑大きさ：１〜３ｍｍ色　　調：白褐色あるいは赤褐色表　　面：円滑で光沢有り（４）　　芽胞形成：陰　　性（５）　　ガス産生：陰　　性（６）　　運動性　　：陰　　性（７）　　カタラーゼ活性：陰　　性（８）　　ミルク凝固性　　：陽　　性（９）　　ゼラ
チン液化性：陰　　性（１０）硝酸塩還元性　　：陰　　性（１１）インドール産生：陰　　性（１２）硫化水素産生　　：陰　　性（１３）酢酸／Ｌ（＋）乳酸のモル比：１．７±０．３

【００１５】（１４）糖の発酵性光岡の方法〔光岡知足：臨床検査、１８、１１６３〜１
１７２頁（１９７４年）〕に従い実施した。また、ビフ
ィドバクテリウム・ブレーベに属する菌株ＡＴＣＣ１５
７００及びＪＣＭ７０１６についても同様に試験を行な
った。結果を表１に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】以上の性状より、本発明のＳＢＲ３２１２
は、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９８６年）、「腸内細菌
の世界」（光岡知足著、叢文社、１９８０年）の分類基
準を参照して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉ
ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｒｅｖｅ）であると
同定した。２．さらに、本発明のＳＢＲ３２１２菌株について従来
のビフィドバクテリウム・ブレーベとの詳細な菌学的性
質の比較試験を行なった。すなわち、ＳＢＲ３２１２、
ＡＴＣＣ１５７００、ＪＣＭ７０１６、市販商品からの
分離株Ａの４菌株のビフィドバクテリウム・ブレーベを
用いて、次の方法により試験をした。

【００１８】〔１〕耐酸性（低ｐＨ緩衝液）の比較試験
（１）方　　法 ■　　ブリッグス　　リバー　　ブロスにて３７℃、２
４時間培養後、洗浄、集菌する。■　　集菌したものを
滅菌生理食塩水（Ｌ−システイン塩酸塩０．１％、チオ
グリコール酸Ｎａ　　０．１％入り）にて原菌液の４倍
濃度にする。■　　この菌液を各ｐＨの緩衝液（１７×
１００ｍｍファルコンチューブに５ｍｌ分注）に５％の
割で添加、混合し、最終的に３．８、４．０、４．３、
４．６、５．０の５段階のｐＨになるよう調整し５℃に
保存し、生菌数を経時的に測定した。緩衝液は、１／１
００モルの酢酸・酢酸Ｎａの酢酸緩衝液を使用した。ま
た、生菌数は、光岡の方法〔臨床検査、１８、１１６３
〜１１７２（１９７４）〕に従い血液を加えないＢＬ平
板寒天培地を用いてスチールウール法で３７℃、７２時
間の嫌気培養で測定した。

【００１９】（２）結　　果結果を表２に示す。表２から明かなように、ＳＢＲ３２
１２はいずれのｐＨにおいても他の３菌株より生残性が
高く、特にｐＨ３．８〜４．３の低ｐＨ域においてその
差が顕著であった。即ち、ＳＢＲ３２１２を５℃で１０
日間保存した場合、ｐＨ４．３において３７．６９％、
ｐＨ４．０において７．１０％、ｐＨ３．８において０
．３１％の生残率を示すのに対して、他の３菌株はｐＨ
４．３以下において生残率がいずれも１％未満だった。

【００２０】

【表２】

【００２１】〔２〕耐酸性（還元脱脂乳）の比較試験前
記試験結果から生残性の劣る分離株Ａを除き、ＳＢＲ３
２１２、ＡＴＣＣ１５７００、ＪＣＭ７０１６の３菌株
のビフィドバクテリウム・ブレーベを用いて、次の方法
により試験をした。（１）方　　法 ■　　０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）入り、１２％
還元脱脂乳を１１５℃、２０分間滅菌後、２％接種し、
３７℃、１８時間培養し、スターターとした。■　　次
に、０．３％酵母エキス入り１０％還元脱脂乳（１８×
１８０ｍｍ試験管に１０ｍｌ分注）を１１５℃、２０分
間滅菌後、上記スターターを２％接種し、３７℃で培養
した。■　　培養物がｐＨ４．６及び４．１に達したら
急冷し、５℃に保存し、生菌数を経時的に測定した。

【００２２】（２）結　　果結果を表３に示す。表３よりＳＢＲ３２１２は、ｐＨ４
．６において７日目で他の２菌株とほぼ同じ生残率を示
した。しかし、ｐＨ４．１においては、７日目で８．２
１％と高い生残率を示したのに対して他の２菌株は０．
００１％未満だった。

【００２３】

【表３】

【００２４】〔３〕好気的生育性試験ＳＢＲ３２１２、ＡＴＣＣ１５７００、ＪＣＭ７０１６
の３菌株のビフィドバクテリウム・ブレーベを用いて、
次の方法により試験を行った。（１）内　　容 ■　　上記各菌株をスターターとして０．５％酵母エキ
ス入り１２％還元脱脂乳（１１５℃、２０分間滅菌）培
地にて３７℃、１８時間培養した。■　　１６％還元脱
脂乳１５０ｍｌを３００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ
、綿栓を施し１１５℃、２０分間滅菌後、３７℃まで撹
拌冷却した。その後、上記スターターを２％接種し撹拌
分散後、３７℃で培養を行い生菌数、乳酸酸度、ｐＨを
経時的に測定した。また、増殖率（％）＝各時間生菌数
／初期生菌数×１００を算出した。

【００２５】（２）結　　果結果を表４に示す。表４から明らかなようにＳＢＲ３２
１２は、培養時間２４時間後に増殖率１０００％以上と
なり、４８時間後にも５００％を維持していた。一方、
他の２菌株は２４時間後に増殖率４００％程度で４８時
間後には５０％以下と増殖性を示さなかった。

【００２６】

【表４】

【００２７】

【発明の効果】現在までに知られているビフィズス菌の
耐酸性株、酸素耐性株は、ビフィドバクテリウム・ビフ
ィダムの耐酸性及び酸素耐性株、ビフィドバクテリウム
・ブレーベの酸素耐性株あるいは耐酸性株、ビフィドバ
クテリウム・ロンガムの耐酸性あるいは過酸化水素耐性
株などが挙げられる。しかしながら、ビフィドバクテリ
ウム・ブレーベの耐酸性と酸素耐性の両特性を持つ菌株
は、知られていなかった。そこで、本発明者らは、健康
な母乳栄養児の糞便から分離した中で好気的発育に優れ
たものを選び出し、さらに低ｐＨの緩衝液で処理したも
のの中から最も生育性に優れた菌株ＳＢＲ３２１２を分
離した。

【００２８】さらに、この分離株ＳＢＲ３２１２の性状
把握試験を行った。その結果は、（１）分類学的性状試
験からビフィドバクテリウム・ブレーベに属する菌株で
あると同定した。（２）耐酸性（低ｐＨ緩衝液）の比較試験からｐＨ３．
８、４．０、４．３、４．６、５．０のいずれのｐＨに
おいても他のＢ．　ｂｒｅｖｅの３菌株（ＡＴＣＣ１５
７００、ＪＣＭ７０１６、市販品分離株Ａ）より生残性
が高く、特に５℃で１０日間保存した場合、ｐＨ４．３
において３７．６９％、ｐＨ４．０で７．１０％、ｐＨ
３．８で０．３１％の生残性を示すのに対して、他の３
菌株はｐＨ４．３以下において生残率がいずれも１％未
満だった。（３）耐酸性（還元脱脂乳）の比較試験では、生残性の
劣る市販品分離株Ａを対照から除き試験を行った。この
試験からｐＨ４．６では、他の２菌株と５℃、７日間の
保存でほとんど差がなかった。しかし、ｐＨ４．１では
、７日目で８．２１％の生残率を示すのに対して、他の
２菌株は０．００１％未満の生残率を示し顕著な差があ
った。（４）好気的生育性試験では、培養時間２４時間後に増
殖率１０００％以上となり、４８時間後にも５００％を
維持していた。一方、他の２菌株は２４時間後に増殖率
４００％程度で４８時間後には５０％以下と増殖性を示
さなかった。このことから、溶存酸素を多く含んだ還元
脱脂乳培地において増殖性があると考える。となった。

【００２９】このように、ＳＢＲ３２１２は、（２）、
（３）の低ｐＨ緩衝液及び還元脱脂乳培養物において、
生残率が他のＢ．　ｂｒｅｖｅの生残率との間には顕著
な差が認められ、優れた耐酸性を有する。また、（４）
の好気的生育性でも増殖率が他のビフィドバクテリウム
・ブレーベの増殖率との間には差が認められ、酸素耐性
も有する。このことは、ＳＢＲ３２１２が優れた耐酸性
と酸素耐性を持ち、従来の文献に記載されていない優れ
た新規菌株である。

【００３０】また、この菌株を使用する培養物、その加
工物での保存中の生菌数は、低下が少なく広いｐＨ域の
飲食物への加工が可能であり、特に、ドリンクヨーグル
ト、酸性乳飲料等への使用には、高い生菌数を維持でき
る。また、整腸剤として使用することができる。さらに
飼料に添加することもできる。

【００３１】

【実施例１】１８％還元脱脂乳を滅菌後、攪拌冷却した
培地にあらかじめ培養しておいたビフィドバクテリウム
・ブレーベＳＢＲ３２１２スターターとラクトバチルス
・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃａｓｅｉ
）スターターをそれぞれ１％づつ接種し、３７℃で１８
時間、好気的条件下で培養した。この培養液５０００ｍ
ｌと蔗糖８００ｇを含むシロップ５０００ｍｌとを混合
し、均質機で均質化して発酵乳を得た。製造直後の製品
の乳酸酸度０．８０％、ｐＨ４．３０でビフィドバクテ
リウム・ブレーベＳＢＲ３２１２の生菌数２．０×１０
９　／ｍｌ、ラクトバチルス・カゼイの生菌数６．５×
１０８　／ｍｌであり、保存７日目でビフィドバクテリ
ウム・ブレーベＳＢＲ３２１２の生菌数５．３×１０７
　／ｍｌ、ラクトバチルス・カゼイの生菌数５．８×１
０８　／ｍｌとなり、ビフィドバクテリウム・ブレーベ
ＳＢＲ３２１２の生残率は２．７％であった。

【００３２】

【実施例２】１８％還元脱脂乳を滅菌後、攪拌冷却した
培地にあらかじめ培養しておいたビフィドバクテリウム
・ブレーベＳＢＲ３２１２スターターを２％接種し、３
７℃で４８時間、好気的条件下で培養した。同様にラク
トバチルス・カゼイスターターも３７℃で４８時間培養
した。培養後、ビフィドバクテリウム・ブレーベＳＢＲ
３２１２培養液２５００ｍｌとラクトバチルス・カゼイ
培養液２５００ｍｌと蔗糖８００ｇを含むシロップ５０
００ｍｌとを混合し、酸味料を加えてから均質機で均質
化して発酵乳を得た。製造直後の製品の乳酸酸度０．７
３％、ｐＨ４．５４でビフィドバクテリウム・ブレーベ
ＳＢＲ３２１２の生菌数１．２×１０８　／ｍｌ、ラク
トバチルス・カゼイの生菌数７．８×１０８　／ｍｌで
あり、保存７日目でビフィドバクテリウム・ブレーベＳ
ＢＲ３２１２の生菌数１．１×１０７　／ｍｌ、ラクト
パチルス・カゼイの生菌数６．３×１０８　／ｍｌとな
り、ビフィドバクテリウム・ブレーベＳＢＲ３２１２の
生残率は９．２％であった。

【００３３】

【実施例３】ポリペプトン４０ｇ、ミートエキス２０ｇ
、酵母エキス４０ｇ、乳糖１２０ｇ、ＫＨ２　ＰＯ４　
２０ｇ、Ｋ２　ＨＰＯ４　４ｇ、Ｌ−アスコルビン酸ナ
トリウム２ｇを含む４０００ｍｌの培地を濾過滅菌した
。そして、先に同一組成の培地により３７℃で１８時間
培養したビフィドバクテリウム・ブレーベＳＢＲ３２１
２のシードカルチャー２００ｍｌを前記の培養液に接種
し、３７℃で１８時間培養した。培養後の生菌数は、３
．２×１０９　／ｍｌであった。次いで、遠心分離機で
菌体を集め、培地と同量の９５℃で３０分間殺菌の生理
食塩水に再懸濁し、再度遠心分離して集菌した。得られ
た菌体を９５℃、３０分間殺菌した脱脂粉乳１００ｇ、
グルタミン酸ナトリウム１０ｇを含む１０００ｍｌの分
散液に懸濁し、凍結乾燥を行った。得られた１１３ｇの
粉末は、生菌数が１．０×１０１１／ｇであった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　下記の菌学的性質を示すビフィドバク
テリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｂｒｅｖｅ）。（１）菌体をｐＨ４．３の滅菌酢酸緩衝液に懸濁し、５
℃で７日間保持した時、少なくとも生残を示す耐酸性。（２）菌体を還元脱脂乳で培養し、ｐＨが４．１に達し
たら急冷して５℃で７日間保持した時、少なくとも生残
を示す耐酸性。（３）菌体を撹拌還元脱脂乳で４８時間培養した時、少
なくとも増殖を示す酸素耐性。
【請求項２】　　菌株がビフィドバクテリウム・ブレー
ベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒｅｖｅ）ＳＢ
Ｒ３２１２（微工研菌寄第１１９１５号）である請求項
１に記載のビフィドバクテリウム・ブレーベ。