KR20110069796A - 발효유 제품 중의 비피도박테리아의 생장을 증진시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비피도박테리아를 락토코쿠스 락티스 ( Lactococcus lactis ), 스트 렙토코쿠스 써모필러스 ( Streptococcus thermophilus ) 및/또는 락토바실러스 불가 리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus ) 종의 젖산 박테리아와 배합물 상태로 함유하는 발효유 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 선택된 박테리아 균주에 의하여 발효유 제품 중의 비피도박테리아의 생장을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
유제품 및 특히 요거트 유사 제품은 프로바이오틱 (probiotic) 제품의 시장에서 단연코 가장 큰 부분을 형성한다. 유제품은 비피도박테리아 등의 유용한 프로바이오틱 박테리아를 운반하고 위장관 내로 도입하는 데 탁월한 매개체이다.
비피도박테리움 BB-12® (Bifidobacterium BB-12®)은 한센사 (Chr. Hansen A/S, Hørsholm, DK)로부터 얻을 수 있는, 잘 알려진 프로바이오틱 박테리아이다. BB-12®의 경우, 유용한 임상 자료에 의하면, 1일 투여량이 적어도 109~1010 cfu [cfu/CFU는 세포 형성 단위 (cell forming units)의 줄임말이다]의 생존 가능한 프로바이오틱 박테리아가 필요하다는 사실을 가리키고 있다. 따라서, 발효유 제품 (예컨대, 발효유 요거트 제품) 그램당 생존 가능한 프로바이오틱 박테리아 세포 수는 예컨대 108 의 높은 수준인 것이 좋다.
본 발명에 의하여 해결해야 할 과제는 최종 제품 중의 세포 수가 높은 비피도박테리아를 얻기 위하여 발효유 (예컨대, 요거트)를 만들기 위한 발효 과정 중에 우유 중의 비피도박테리아 개체수의 생장을 증진시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 해결책은 특정의 락토코쿠스 락티스 ( Lactococcus lactis ) 균주들은 우유의 발효 중에 비피도박테리아의 생장을 현저하게 증진시킨다는 본 발명의 발명자들에 의한 놀라운 발견에 기초한다. 이들 중에 한 가지 균주를 사용함으로써, 그 결과 생성되는 발효유 제품은 108 cfu/g 이상의 비피도박테리아를 함유한다 (발효 직후). 결과적으로, 상기 발효 종료 후, 예컨대 108 cfu/g 박테리아인 제품을 얻으려면, 추가의 비피도박테리아를 첨가할 필요가 없다. 본 발명자들은 일련의 상이한 락토코쿠스 락티스 균주들을 시험한 결과, 락토코쿠스 락티스 CHCC3912 및 CHCC4462로 알려지고 기탁 번호가 각각 DSM21406 및 DSM21408인 균주들이 우유 발효 중에 비피도박테리아의 생장을 크게 증진시킨다는 사실을 발견하였다. 사실상, 락토코쿠스 락티스 균주들 중 기타의 어떤 균주들은 비피도박테리아의 생장에 부정적인 영향을 미쳤다.
그 밖에, 본 발명자들은 스트렙토코쿠스 써모필러스 (CHCC7018)의 균주도 역시 비피도박테리아의 생장을 증진시키는 고유의 특성을 가진 균주라는 것을 관찰하였다. 따라서, 본 발명의 한 가지 관점은 발효유 그램당 최소 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유하는 제품 등의 발효유 제품을 제조하는 방법에 관한 것인데, 그 방법은,
i) 우유를 한 가지 이상의 락토코쿠스 락티스 [여기서, 상기 락토코쿠스 락티스 균주 중 한 가지는 락토코쿠스 락티스 균주 CHCC3912 (DSM21406), CHCC3912의 돌연 변이체 및 CHCC3912의 변종, 또는 CHCC4462 (DSM21407), CHCC4462의 돌연 변이체 및 CHCC4462의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 좋다], 한 가지 이상의 스트렙토코쿠스 써모필러스, 한 가지 이상의 비피도박테리움 균주 및 임의로 한 가지 이상의 락토바실러스 불가리쿠스 균주를 함유하는 배양액 (요거트 배양액 등)으로 접종하는 단계와,
ii) 상기 우유를 적절한 조건하에서 발효시키는 단계와,
iii) 임의로 적당량의 상기 발효유 제품을 적절한 패키지에 포장하는 단계
를 포함한다.
흥미로운 실시 상태는 발효유 제품 그램당 최소 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유하는 발효유의 제조 방법에 관한 것인데, 그 방법은,
i) 우유를 한 가지 이상의 락토바실러스 불가리쿠스 균주, 한 가지 이상의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주, 한 가지 이상의 락토코쿠스 락티스 균주 [여기서 상기 락토코쿠스 락티스 균주 중의 하나는 락토코쿠스 락티스 균주 CHCC3912 (DSM21406) 또는 CHCC4462 (DSM21407)중 하나이다] 및 한 가지 이상의 비피도박테리움 균주를 함유하는 요거트 배양액으로 접종하는 단계와,
ii) 적절한 조건에서 상기 우유를 발효시켜 발효유 제품 그램당 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유하는 발효유 제품을 얻는 단계와,
iii) 적당량의 발효유 제품을 적절한 패키지에 포장하는 단계
를 포함한다.
또한, 본 발명은 기탁 번호가 DSM21408인 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 CHCC7018 및 그의 돌연 변이체/변종에 관한 것이며, 그리고 본 발명의 균주를 임의로 비피도박테리움 균주 (예컨대, BB-12®) 등의 또 한 가지 균주와 함께 함유하는 배양액 (출발 배양액 등)에 관한 것이다. 흥미로운 조성물은 i)105 내지 1012 cfu/g의 BB-12® 및 ii) 105 내지 1012 cfu/g의 CHCC7018을 함유한다.
본 발명은, 제1의 관점에 있어서, 발효유 제품의 제조 방법에 관한 것인데, 그 방법은,
i) 우유를
a) 비피도박테리움 균주에 속하는 박테리아와,
b) 락토코쿠스 락티스 균주, 좋기로는 비피도박테리움 균주의 생장을 증진시키는 CHCC4462 (DSM21407), CHCC3912 (DSM21406) 등의 균주, 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주, 좋기로는 비피도박테리움 균주의 생장을 증진시키는 CHCC7018 등의 균주 및 이 균주들 중의 돌연 변이체 또는 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주에 속하는 박테리아로 접종하는 단계와,
ii) 상기 우유를 발효시키는 단계와,
iii) 임의로 추가의 미생물 및/또는 첨가제를 상기 발효유에 첨가하는 단계와,
iv) 임의로 상기 발효유 제품을 포장하는 단계
를 포함한다.
본 발명에서의 양호한 실시 상태에 있어서는, 단계 i)은 상기 우유를 락토바실 러스 불가리쿠스 , 스트렙토코쿠스 써모필러스 , 락토코쿠스 락티스 및 락토바실러스 아시도필러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종에 속하는 박테리아로 우유를 접종하는 것을 더 포함한다.
본 발명의 방법의 한 가지 실시 상태는 단계 i)이 우유를
a) 비피도박테리움 균주와,
b) 락토바실러스 불가리쿠스 균주와,
c) CHCC4462, CHCC4462의 돌연 변이체, CHCC4462의 변종, CHCC3912, CHCC3912의 돌연 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 락토코쿠스 락티스 균주 및/또는 CHCC7018, CHCC7018의 돌연 변이체 및 CHCC7018의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 함유하는 배양액으로 접종하는 것을 포함하는 방법이다.
또 다른 실시 상태는 발효유 제품 그램당 적어도 108 cfu의 비피도박테리아를 함유하는 제품 등의 발효유 제품의 제조 방법에 관한 것인데, 그 방법은,
i) 우유를 한 가지 이상의 락토코쿠스 락티스 균주 (여기서, 상기 락토코쿠 스 락티스 균주 중의 한 가지는 기탁 번호가 DSM21406인 락토코쿠스 락티스 균주 CHCC3912, CHCC3912의 돌연 변이체 및 CHCC3912의 변종 또는 기탁 번호가 DSM21407인 CHCC4462, CHCC4462의 돌연 변이체 및 CHCC4462의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다) 및 한 가지 이상의 비피도박테리움 균주 및 임의로 한 가지 이상의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 및 한 가지 이상의 락토바실러스 불가리쿠 스 균주를 함유하는 배양액 (요거트 배양액 등)으로 접종하는 단계와,
ii) 적절한 조건 하에서 상기 우유를 발효시키는 단계와,
iii) 임의로 적당량의 상기 발효유 제품을 적절한 패키지에 포장하는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시 상태는 발효유 제품 그램당 적어도 108 cfu의 비피도박테리아를 함유하는 발효유 제품의 제조 방법에 관한 것인데, 그 방법은,
i) 우유를 한 가지 이상의 락토바실러스 불가리쿠스 균주, 한 가지 이상의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주, 한 가지 이상의 락토코쿠스 락티스 균주 (여기서 상기 락토코쿠스 락티스 균주의 한 가지는 기탁 번호 DSM21406의 락토코쿠스 락티스 균주 CHCC3912 또는 기탁 번호 DSM21407의 락토코쿠스 락티스 균주 CHCC4462이다) 및 한 가지 이상의 비피도박테리움 균주를 함유하는 요거트 배양액으로 접종하는 단계와,
ii) 발효유 제품 그램당 최소 108 cfu의 비피도박테리아를 함유하는 발효유 제품을 얻기 위하여 적절한 조건하에서 상기 우유를 발효시키는 단계와,
iii) 적당량의 상기 발효유 제품을 적절한 패키지에 포장하는 단계
를 포함한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법은 우유를 추가의 스트렙토코쿠 스 써모필러스 균주, 좋기로는 ST-BODY-3 (Chr. Hansen A/S, Hørsholm, DK) 및 ST8833 (DSM17876)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주 등의 조직화 균주 (texturizing strain)로 더 접종하는 것을 포함한다.
비피도박테리움 균주는 좋기로는 비피도박테리움 어돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테리움 아니말리스 ( Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 아스테로이즈 ( Bifidobacterium asteroids ), 비피도박테리움 비피덤 ( Bifidobacterium bifidum ), 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve ), 비피도박테리움 카테눌라텀 ( Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 인판티스 ( Bifidobacterium infantis ), 비피도박테리움 락티스 ( Bifidobacterium lactis ), 비피도박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum ) 및 비피도박테리움 수도카테눌라텀 ( Bifidobacterium pseudocatenulatum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종에 속하고, 본 발명에서 양호한 비피도박 테리움 균주는 비피도박테리움 아니말리스 아종 (亞種) 락티스이다. 균주의 예들은 기탁 번호가 DSM15954인 CHCC5445 (BB-12®), CHCC7158 (HN019, 기탁 번호 DSM17280), 기탁 번호가 ATCC 27536인 비피도박테리움 균주, 비피도박테리움 인판티스 균주 Bbi99 (DSM 13692), BB-420, BI-04, CHCC2037, LAFTI B-94, DN 173 010, STB-2938, R0071, R0175 및 BB-46TM (DSM15955) 및 이들 균주들의 돌연 변이체/변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주들이다.
유용한 실시 상태에 있어서, 생성된 발효유 제품은, 발효의 종말점에서 발효유 제품 그램당 최소 108 cfu의 비피도박테리아를 함유하고/하거나, +6℃에서 28일간 저장 후에 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유한다.
본 방법의 중요한 실시 상태에 따르면, 단계 i)에서 우유는 105 내지 3xlO7 cfu/g의 비피도박테리움 및/또는 104 내지 3.5xlO6 cfu/g의 스트렙토코쿠스 써모필러스 또는 락토코쿠스 락티스 박테리아로 접종된다. 우유는 박테리아 종들과 함께 동시에 접종시킬 수 있다. 이는 우유를 두 가지 박테리아 종들을 함유하는 출발 배양액으로 동시에 접종시킴으로써 간편하게 달성된다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 우유는 락토코쿠스 락티스 아종인 락티스 균주 (예컨대, 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 DN224; 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 DN223 및 이들 중의 돌연 변이체 또는 변종 균주로 이루어진 군으로부터 선택된다)와 같은 적어도 한 가지의 박테리아 균주로 접종될 수 있다. 본 발명에서 양호한 이 추가의 헬퍼 미생물은 (helper organism) 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 DN224; 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 DN223으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 균주이다.
우유는 각 박테리아 종들과 별도로/순차로 또는, 2 또는 그 이상의 박테리아종들과 동시에 접종시켜도 된다는 것을 이해하여야 한다. 현재는 우유를 모든 박테리아 종들과 동시에 접종하는 것이 좋다. 이는 우유를 박테리아 종들을 함유하는 출발 배양액으로 접종함으로써 간편하게 수행된다.
본 발명의 방법으로 얻는 제품은 “요거트”로 정의될 수 있다. 즉 락토바실 러스 불가리쿠스 균주 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주의 두 가지 균주로 접종된 경우이다.
발효유 제품 (요거트 등)은 25 내지 3000 ml 또는 50 내지 1000 ml처럼 제품 10~5000 ml를 함유하는 밀봉 패키지에 간편하게 포장된다. 패키지의 예로서는 10~300 ml, 20~200 ml 또는 30~100 ml를 들 수 있다.
제2의 관점에 있어서, 본 발명은,
a) CHCC5445 (BB-12®) 등의 비피도박테리움 균주에 속하는 박테리아와,
b) 락토코쿠스 락티스 균주, 좋기로는 CHCC4462, CHCC3912 등의 비피도박테 리움 균주의 생장을 증진시키는 균주 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주, 좋기로는 비피도박테리움의 생장을 증진시키는 균주 (CHCC7018 등), 또는 이들 중 임의의 균주의 돌연 변이체 또는 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주에 속하는 박테리아에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 105 내지 1012 cfu/g의 BB-12® 및 105 내지 1012 cfu/g의 CHCC7018 및/또는 105 내지 1012 cfu/g의 락토코쿠스 락티스 CHCC3912 또는 CHCC4462를 함유하는 배양액 (출발 배양액 등)에 관한 것이다. 상기 배양액은 105 내지 1012 cfu/g의 DN224 또는 DN223을 더 함유할 수 있다.
본 발명의 추가의 관점은 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 발효유 제품, 특히 CHCC7018 (DSM21408); CHCC7018의 돌연 변이체 및 CHCC7018의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트렙토코쿠스 써모필러스를 함유하는 발효유 제품에 관한 것이다. 본 발명에서는 발효유 제품이 103 내지 1010 cfu/g의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 함유하는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 또한 CHCC4462 및 CHCC3912 및 이들 중 임의의 균주의 돌연 변이체 또는 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주에 속하는 박테리아를 함유하는 발효유 제품에 관한 것이다. 상기 발효유 제품은 좋기로는 103, 좋기로는 적어도 105 cfu/g의 박테리아 균주를 함유한다.
본 발명의 발효유 제품은 103 내지 1010 cfu/g의 비피도박테리아 및/또는 103 내지 1010 cfu/g 의 락토코쿠스 락티스 균주 (CHCC3912, CHCC4462, DN224 또는 DN223등)를 더 함유할 수 있다. 본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 발효유 제품은 적어도 105, 좋기로는 적어도 107 cfu/g의 비피도박테리아 및/또는 적어도 105, 좋기로는 최소 107 cfu/g의 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 균주를 함유한다.
추가의 관점에서 보면, 본 발명은 CHCC7018, CHCC7018의 돌연 변이체, CHCC7018의 변종, CHCC4462, CHCC4462의 돌연 변이체, CHCC4462의 변종, CHCC3912, CHCC3912의 돌연 변이체, CHCC3912의 변종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 균주에 관한 것이다. 양호한 것은 모균주(母菌株)의 특성 중의 한 가지 또는 그 이상 (좋기로는, 전부)을 가진 돌연 변이체/변종 균주이다. 예컨대, 돌연 변이체/변종은 비피도박테리움 균주의 생장을 촉진할 수 있다 (특히 BB-12®). 상기 균주는 예컨대 실질적으로 기타 박테리아 균주가 함유되지 않은 단리형(單離形)이어도 좋다.
양호한 실시 상태에 있어서 비피도박테리움은 비피도박테리움 어돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테리움 아니말리스 ( Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 아스테로이즈 ( Bifidobacterium asteroids ), 비피도박테리움 비피덤 ( Bifidobacterium bifidum ), 비피도박테리움 브레베 ( Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum ), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis ), 비피도박테리움 락티스 ( Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) 및 비피도박테리움 수도카테눌라텀 ( Bifidobacterium pseudocatenulatum )으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 비피도박테리움이다. 또한, 이들 열거된 균주들 중의 두 가지 또는 그 이상을 함유하는 혼합물을 사용하여도 좋다.
본 방법의 양호한 실시 상태에 있어서, 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주이다. 특히, 상기 그 균주는 기탁 번호 DSM15954으로 기탁된 BB-12® (CHCC5445) 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스이다.
또 한 가지 양호한 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주는 HN019 (이는 또한 DR-10TM 또는 HOWARUTM로 알려져 있다)이다. 상기 균주는 2000년 중에 타이완에서 판매되었던 Fernleaf DR-10 bifidus라는 라벨이 붙은 시판용의 유아용 분유로부터 단리되었다. 이것은 한센 배지 기탁 기관 (Hansen culture cellection)에 기탁 번호 CHCC7158로 기탁되어 있으며, DSMZ에는 기탁 번호 DSM17280로 기탁되었다.
비피도박테리아의 cfu/g 세포수 측정은 이 기술 분야의 표준법에 따라 발효 제품의 희석액을 연속적으로 아가 플레이트 (agar plate) 위에서 집락을 계수하여 집락 형성 단위 [Colony Forming Units (cfu)]의 수를 정량함으로써 수행된다. 적절한 배지와 배양은 다음과 같다.
배지: MRS (de Man et al. 1960. J. Appl. Bacteriol. 23 : 130) 무산(無酸) + 1% 디클록사실린 (dicloxacilline) (SIGMA D-9016) + 1% 시스테인 (MERCK n°2839)
배양: 산소가 없는 조건하에서 37℃, 3일
본 발명에서 논의하는 바와 같이, CHCC3912 또는 CHCC4462 (및/또는 CHCC7018)을 사용하면, 발효 도중에 비피도박테리아의 생장으로부터 직접 108 cfu/g 이상의 비피도박테리아를 얻을 수 있는 가능성이 제공된다. 따라서, 제1의 관점에서의 단계 ii)의 적어도 108 cfu/g 의 비피도박테리아는 발효 직후 얻은 비피도박테리아의 cfu/g에 관한 것이다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 비피도박테리움 BB-12®는 락토코쿠스 락티스 균주 CHCC3912 또는 CHCC4462 및/또는 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 CHCC7018와 함께 배양될 때 생존률이 양호하다.
따라서, 양호한 실시 상태에 있어서, 발효유 제품은 +6℃에서 1일 저장 후 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아, 더 좋기로는 +6℃에서 7일 저장 후 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아, 더욱 좋기로는 +6℃에서 14일 저장 후 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아, 더 더욱 좋기로는 +6℃에서 21일 저장 후 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아, 가장 좋기로는 +6℃에서 28일 저장 후 최소 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유한다.
이 기술 분야의 숙련자는 우유를 본 발명에 관련된 박테리아로 발효시키는 데 적절한 발효 조건을 알고 있다.
적절한 조건은 예컨대 우유를 박테리아로 접종하고, 38℃ 내지 43℃, 최적 4O℃에서, pH 4.4 내지 4.6에 이를 때 (대략 약 8 시간 후)까지 배양하는 것이다.
상기 우유를 +6℃까지 냉각하면, 비피도박테리아 등의 본 발명에 관련된 박테리아의 발효 및 생장은 종료된다.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 설명되어 있는 증진된 생장은 105 내지 3xlO7 cfu/g 의 비피도박테리움을 배양하고 락토코쿠스 락티스 균주 CHCC3912 또는 CHCC4462 및/또는 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 CHCC7018을 동시에 104 내지 3.5xlO6 cfu/g의 농도로 배양하여 얻는다.
필요하다면, 관심 있는 시점 (예컨대, 발효의 완료 후)에 추가의 박테리아 (예컨대, 추가의 비피도박테리움)를 첨가하여도 좋다.
이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 바와 같이, 우유를 발효시킴으로써 여러 가지 다양한 발효유 제품을 얻을 수 있는데, 이들 제품은 액체 또는 고체형이어도 좋다. 양호한 실시 상태에 있어서, 발효유 제품은 요거트, 마시는 요거트, 저어 마시는 요거트 (stirred yogurt), 고형 요거트 (set yogurt) 및 요거트 유사 음료, 쓴 우유 (bitter milk), 버터 우유 (butter milk), 사우어 크림, 프레시 치즈 (fresh cheese)및 치즈로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제품이다.
본 발명에서 설명하는 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유하는 발효유는 예컨대 커드 치즈, 초콜렛, 쥬스, 육제품(肉製品) 및 유아용 분유 제품 등의 기타의 음식품에 넣는 제품 첨가제로서도 역시 사용될 수 있다.
이와 관련하여, 상기 락토바실러스 불가리쿠스는 어떠한 적절한 (예컨대 시판 중인) 락토바실러스 불가리쿠스 균주이어도 좋다. 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 바와 같이, 최종 발효유 제품에서 적당량의 락토바실러스 불가리쿠스를 얻기 위하여 적당량이 배양될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 헬퍼 박테리움 등의 기타 관심있는 박테리아를 추가하여도 좋다. 이러한 박테리아는 발효 도중에 또는 발효 등이 종료된 후에 첨가하여도 좋다. 이러한 추가의 박테리아의 예로서는 락토코쿠스 및 락토바실러스로 이루어진 목록으로부터 선택되는 박테리아를 들 수 있다. 양호한 락토바실러스는 락토바실러스 아시도필러스 균주 LA-5® (Chr. Hansen A/S, Denmark로부터 구입 가능)이다. WO98/54337 (Chr. Hansen, EP0985043 Bl로 허여됨)에 개시되어 있는 바와 같이, 발효 도중에 피루브산염 대사 결핍인 젖산 헬퍼 박테리아를 첨가하여 박테리아의 수명을 증진시키는 것을 비롯하여 다수의 증진을 얻을 수도 있다. 피루브산염 대사 결핍인 균주 DN224 (DSM 11037로 기탁되었다) 및 DN223 (DSM 11036로 기탁되었다)은 적절한 헬퍼 미생물 박테리아의 예로서 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 실시 상태에 있어서, 피루브산염 대사 결핍인 젖산 박테리아 헬퍼 미생물도 역시 본 발명에 설명된 바와 같이 발효시키기 위하여 우유에 첨가된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 젖산 박테리아 헬퍼 미생물은 기탁 번호 DSM 11036로 기탁된 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 균주 DN223 및 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 균주 DN224 (No. DSM 11037로 기탁되었다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아이다. 가장 좋기로는, 젖산 박테리아 헬퍼 미생물은 DN224이다.
한 가지 실시 상태는 배양액 등의 조성물에 관한 것으로서,
i) 105 내지 1012 cfu/g의 BB-12®와,
ii) 105 내지 1012 cfu/g의 CHCC7018와,
iii) 105 내지 1012 cfu/g의 DN224
를 함유한다.
기탁된
미생물 [전문가 용]
균주인 락토코쿠스 락티스 CHCC3912, 락토코쿠스 락티스 CHCC4462, 락토코쿠 스 락티스 CHCC2907 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 CHCC7018은 2008년 4월 23일에 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에 각각 기탁 번호 DSM21406, DSM21407, DSM21421 및 DSM 21408로 기탁되었다. 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
출원인은 상기 기탁 미생물의 시료는 오로지 출원인의 승인을받은 전문가에게만 이용 가능하도록 하여야 한다고 요구하는 바이다.
정의
본 명세서에서 요거트 출발 배양액은 한 가지 이상의 락토바실러스 불가리쿠 스 균주 및 한 가지 이상의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 함유하는 박테리아 배양액이다. 이에 따라, 요거트는 우유를 락토바실러스 불가리쿠스 균주 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주와 함께 배양하고 발효시킨 발효유 제품이다.
본 명세서에서, “우유”라는 용어는 포유류 또는 식물의 유액을 포함한다. 우유의 예로 소의 젖 (bovine milk), 낙타의 젖, 버팔로의 젖, 염소의 젖, 양의 젖 및 두유가 있다. 필요에 따라, 우유는 예컨대 산 (시트르산, 아세트산 또는 젖산 등)을 첨가하여 산성화시키거나, 예컨대 물과 혼합시킨다. 우유는 생유이어도 좋고, 예컨대, 여과, 살균, 저온 살균, 균질화 등으로 가공 처리하여도 좋고, 또는 재구성한 분유이어도 좋다. 본 발명에 따른“소의 젖”의 중요한 예는 저온 살균된 소의 젖이다. 우유는 박테리아와 함께 배양시키기 전, 배양 도중 및/또는 배양 후에 산성화, 혼합 또는 가공하여도 된다는 것이 이해된다.
본 명세서에서, 적절한 패키지에 (적당량의) 발효유를“포장”한다는 용어는, 예컨대 한 사람 또는 일단의 사람들이 섭취할 수 있는 제품을 만들기 위한 발효유의 최종 포장을 의미한다. 따라서, 적절한 패키지는 병 또는 이와 유사한 것일 수 있으며, 적당량은 예컨대 10 ml 내지 5000 ml이지만, 본 발명에 있어서 패키지량은 50 ml 내지 1000 ml인 것이 좋다.
본 명세서에서, “돌연 변이체”라는 용어는 예컨대 유전 공학, 방사선 및/또는 화학적 처리에 의하여 본 발명의 (또는 본 발명에서 사용된) 균주로부터 유래된 균주라고 이해하여야 한다. 돌연 변이체는 기능적으로 등가인 돌연 변이체가 좋다. 본 발명의 균주 중 양호한 돌연 변이체는 우유 배지 내에서 비피도박테리움의 생장을 증대시키는 돌연 변이체, 예컨대 모균주와 실질적으로 동일하거나 증진된 비피도박테리움 생장 촉진 성질을 가진 돌연 변이체이다. 그러한 돌연 변이체가 본 발명의 일부이다. 특히, 상기 용어 “돌연 변이체”는 균주를 에탄 메탄 술포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로구아니딘 (NTG) 등의 화학적 돌연 변이 유발원, 자외선에 의한 처리를 비롯하여 통상 사용되는 돌연 변이화 처리하여 얻은 또는 자발적으로 발생하는 돌연 변이를 이르는 것이다. 돌연 변이체에는 몇 가지 돌연 변이화 처리를 행하여 왔으나 (단일한 처리는 돌연 변이화 단계 후 스크리닝/선택 단계를 거친 것으로 이해되어야 한다), 본 발명에서는 20 이하, 또는 10 이하, 또는 5 이하의 처리를 수행하는 것이 좋다. 본 발명에서 양호한 돌연 변이체에는 모균주에 비하여 그 박테리아 유전자 내의 5% 미만, 또는 1% 미만 또는 심지어 0.1% 미만의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드에 의하여 전환되거나 결손되어 왔다.
본 명세서에서, “변종”이라는 용어는 우유 배지 내에서 피비도박테리움 세포의 생장을 증대시키는 균주 등, 모균주와 기능적으로 등가인 균주라고 이해하야 한다. 상기 변종은 모균주와 동일한 종에 속해야 한다. 예를 들어, CHCC7018의 변종은 우유 배지 내에서 비피도박테리움 세포의 생장을 증대시키는, 예컨대 모균주와 비피도박테리움의 생장을 촉진시키는 성질이 동일하거나 또는 실질적으로 동일하거나, 증진된 균주처럼, CHCC7018와 기능적으로 동등한 스트렙토코쿠스 써모필러 스 균주로서 이해되어야 하고, CHCC3912의 변종은 예컨대 모균주에 대하여 비피도박테리움의 생장을 촉진시키는 성질이 같거나 또는 실질적으로 같거나, 증진된, CHCC3912와 기능적으로 등가인 락토코쿠스 락티스 균주로 이해되어야 한다. 본 발명의 일부인 이러한 변종들은 적절한 스크리닝 기법에 의해 식별될 수 있다.
본 발명에 있어서, 수치 범위에 관한 설명은 달리 명시하지 않는 한, 단지 그 범위에 속하는 각각 별도의 값을 개별적으로 나타내는 약기(略記) 방식일 뿐이고, 각각 별도의 값은 이것이 개별적으로 설명되는 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 설명된 방법들 모두, 달리 명시하거나 문맥상 명백히 반대되는 경우가 아니면, 어떠한 적절한 순서로도 수행될 수 있다. 제시된 임의의 그리고 모든 실시예, 또는 예시어 (예컨대, “등”)의 사용은, 단지 본 발명을 더 분명히 하기 위한 목적일 뿐이며, 달리 특히 요구되지 않은 한 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서 중의 어떠한 언어도, 청구되지 않은 어떤 사항이 본 발명을 실시하는 데 필수적인 것으로 해석되어서는 아니 된다.
실시예1
: 각종
락토코쿠스
락티스
균주들을 이용한
BB
-12
®
의 생장 증진
우유 배지 (9.5% 환원 탈지 분유를 99℃로 30초 가열)를 0.01% BB-12® F-DVS 배양액 및 0.01% 락토코쿠스 F-DVS 배양액에 의하여 최초 BB-12®의 농도가 1x107 CFU에 이르도록 접종하였다. 이 후, 상기 우유를 40℃에서 16 시간 발효시키고, 8℃에서 저장하였다. 각각 1, 14, 28 및 45일 저장 후, BB- 12® 세포 수 분석을 행하였다.
| 비피도박테리움 : |
BB-12® |
B-12® |
BB-12® |
BB-12® |
|
락토코쿠스 : |
없음 |
CHCC4462 |
CHCC3912 |
CHCC2907 (HB-3) |
| BB-12® CFU 접종: |
1.0x107 |
1.0x107 |
1.0x107 |
1.0x107 |
| BB-12® CFU 1일: |
2.0x105 |
3.0x108 |
1.3x109 |
1.0x105 |
| BB-12® CFU 14일: |
5.7x104 |
1.5x109 |
1.2x109 |
3.5x104 |
| BB-12® CFU 8일: |
2.0x104 |
1.2x108 |
6.9x108 |
|
| BB-12® CFU 45일: |
1.0x104 |
1.3x108 |
7.9x108 |
실시예
2: 여러 가지
스트렙토코쿠스
써모필러스
균주들을 이용한
BB
-12
®
의 생장 증진
우유 배지 (9.5% 환원 탈지 분유를 99℃로 30초 가열)를 0.01% BB-12® F-DVS 배양액 및 0.01% 스트렙토코쿠스 써모필러스 F-DVS 배양액에 의하여 최초 BB-12®의 농도가 1x107 CFU에 이르도록 접종하였다. 이 후, 상기 우유를 40℃에서 16시간 발효시키고 8℃에서 저장하였다. 각각 1, 14, 28 및 45일 저장 후, BB- 12® 세포 수 분석을 행하였다.
| 비피도박테리움 : |
BB-12® |
BB-12® |
BB-12® |
BB-12® |
| 스트렙토코쿠스 : |
없음 |
CHCC7018 |
CHCC6592 |
CHCC4895 |
| BB-12® CFU 접종: |
1.0x107 |
1.0x107 |
1.0x107 |
1.0x107 |
| BB-12® CFU 1일: |
2.0x105 |
4.7x107 |
1.4x107 |
8.1x106 |
| BB-12® CFU 14일: |
5.7x104 |
8.5x107 |
1.3x107 |
1.3x106 |
| BB-12® CFU 28일: |
2.0x104 |
8.1x107 |
5.5x106 |
|
| BB-12® CFU 45일: |
1.0x104 |
4.8x107 |
5.4x106 |
실시예
3
:
스트렙토코쿠스
써모필러스
및
락토코쿠스
락티스
균주들을 이용한
BB
-12
®
의 생장 증진
표준 3 리터 요거트법에 따라 요거트 생산을 행하였다. 신선한 우유 (지방분0.5%)가 첨가된 2% 탈지 분유를 92℃에서 20분 가열 처리하였다. 상기 우유를 43℃까지 냉각시키고 배양액 (배양액에 따라 0.016~0.023%)으로 접종하여 pH 4.55까지 발효시켰다. 이 후, 상기 요거트를 교반하여, 25℃로 냉각시키고 5℃에서 저장하였다.
결과:
| 배양액 |
BB-12® 접종* CFU/mL |
BB-12® CFU/mL 1일 |
BB-12® 발효 도중의 생장 ** |
BB-12® CFU/mL 42일 |
BB-12® CFU 42일/접종 |
| 74=CHCC3912가 함유된 새 배양액 |
1.0x107 |
1.6x108 |
16 x |
9.1x107 |
9.1 |
| 68=CHCC4462가 함유된 새 배양액 |
1.0x107 |
1.6x108 |
16 x |
8.1x107 |
8.1 |
| 68 낮은 농도의 접종 |
2.5x106 |
4.7x107 |
9 x |
2.2x107 |
8.8 |
|
ABY -10 |
5.0x106 |
4.0x107 |
8 x |
2.2x107 |
4.4 |
|
BY -700 |
6.0x106 |
4.3x107 |
7 x |
2.1x107 |
3.5 |
* 제품 명세에 따라 계산한 것임.
* 발효 중의 생장은 1일 CFU/ CFU 접종으로 계산함.
데이터는 3 리터 규모의 요거트 생산의 3회 반복한 것에 대한 평균값임.
(68 ‘낮은 농도의 접종’은 단지 2회만 반복).
대조 배양액 ABY-10 및 BY-700 (Chr. Hansen A/S, Hørsholm, DK)은 발효유 제품 내의 BB-12® 세포 수에 관하여 가장 양호한 배양액으로 알려져 있다.
배양액 조성:
“68”: BB-12®, CHCC7018, 락토바실러스 불가리쿠스 및 CHCC4462 (락토코쿠스 락티스 CHCC4462)를 함유하는 배양액.
“74”: BB-12®, CHCC7018, 락토바실러스 불가리쿠스 및 CHCC3912 (락토코쿠스 락티스 CHCC3912)를 함유하는 배양액.
결론:
CHCC7018, CHCC4462 및 CHCC3912은 단독으로 그리고 배합된 상태로 이용될 경우, 발효 도중에 발효유 제품 내에서 비피도박테리움 BB-12®의 생장을 적어도 108 cfu/g까지 증진시킨다.
본 발명자들에게 알려진 본 발명을 수행하기 위한 최선의 방법을 비롯하여 본 명세서에는 본 발명의 양호한 실시 상태들이 기재되어 있다. 이들 양호한 실시 상태의 여러 가지 변경 사항들은 전술한 본 발명의 설명을 읽어보면 이 기술 분야의 숙련된 자들에게 자명하게 될 것이다. 본 발명자들은 숙련된 기술자들이 적절하게 그러한 변경 상태들을 채용하기를 기대하며, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 상세하게 설명된 것보다 달리 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법령이 허용하는 바와 같이 본 발명에 첨부된 특허 청구범위의 주제의 모든 변경,수정 사항들 및 균등 사항들을 포함한다. 더욱이, 본 발명은, 달리 명시되지 않거나 명백히 달리 반대되지 않는 한, 전술한 요소들의 가능한 변경 사항들 중의 조합이 포함된다.
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본 명세서에 인용된 참고 문헌들은 모두 그 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함된다.
Claims (30)
- i) 우유를
a) 비피도박테리움 균주에 속하는 박테리아와,
b) 비피도박테리움 균주의 생장을 상승시키는 락토코쿠스 락티스 균주 및 비피도박테리움 균주의 생장을 상승시키는 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주에 속하는 박테리아로 접종하는 단계와,
ii) 상기 우유를 발효시키는 단계와,
iii) 임의로 상기 발효유에 추가의 미생물 및/또는 첨가제를 더 첨가하는 단계와,
iv) 임의로 상기 발효유 제품을 포장하는 단계
를 포함하는 발효유 제품의 제조 방법. - 제1항에 있어서, 단계 b)의 박테리아는 CHCC4462 (DSM21407), CHCC3912 (DSM21406), CHCC7018 (DSM21408) 및 이들 균주 중의 임의의 균주의 돌연 변이체 또는 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 균주에 속하는 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 우유를 락토바실러스 불가리쿠스 , 스트렙토코쿠스 써모필러스 , 락토코쿠스 락티스 및 락토바실러스 아시도필러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 종에 속하는 박테리아로 접종하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 i)은 우유를
a) 비피도박테리움 균주와,
b) 락토바실러스 불가리쿠스 균주와,
c) CHCC4462, CHCC4462의 돌연 변이체, CHCC4462의 변종, CHCC3912, CHCC3912의 돌연 변이체 및 CHCC3912의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 락토코쿠스 락티스 균주 및/또는 CHCC7018, CHCC7018의 돌연 변이체 및 CHCC7018의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인스트렙토코쿠스 써모필러스 균주
를 함유하는 배양액으로 접종하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가의 스트렙토코쿠스 써모필 러스 균주, 좋기로는 ST-BODY-3 (Chr. Hansen A/S, Hørsholm, DK) 및 ST8833 (DSM17876)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 균주 등의 조직화 균주 (texturizing strain)로 우유를 접종하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 어돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테리움 아니말리 스 ( Bifidobacterium animalis ), 비피도박테리움 아스테로이즈 ( Bifidobacterium asteroids), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum ), 비피도박테리움 브레베 ( Bifidobacterium breve ), 비피도박테리움 카테눌라텀 ( Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis ), 비피도박테 리움 락티스 ( Bifidobacterium lactis ), 비피도박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum) 및 비피도박테리움 수도카테눌라텀 ( Bifidobacterium pseudocatenulatum )으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 종에 속하는 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스인 것인 방법.
- 전술한 청구항에 있어서, 비피도박테리움 균주는 CHCC5445 (BB-12®, DSM15954), CHCC7158 (DSM17280) 및 BB-46TM 및 이들 균주 중의 임의의 균주의 돌연 변이체/변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 전술한 청구항에 있어서, 비피도박테리움 균주는 CHCC5445 (BB-12®, DSM15954), CHCC7158 (DSM17280) 및 BB-46TM 및 이들 균주 중의 임의의 균주의 돌연 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 전술한 청구항에 있어서, 비피도박테리움 균주는 BB-12® 이거나 실질적으로 동일한 성질, 예컨대, 프로바이오틱 성질을 가지는 그의 돌연 변이체인 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 발효유 제품은 발효유 그램당 최소 108 cfu의 비피도박테리아를 함유하는 것인 방법
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 발효유 제품은 +6℃에서 28일 저장 후 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유하는 것인 방법
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 i)의 우유는 105 내지 3xlO7 cfu/g의 비피도박테리움 및/또는 104 내지 3.5xlO6 cfu/g의 스트렙토코쿠스 써모필러스 또는 락토코쿠스 락티스 박테리아로 접종되는 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 균주 (예컨대, 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 DN224; 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 DN223 및 이들 중의 돌연 변이체 또는 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 균주) 등의 한 가지 이상의 박테리아 균주로 우유를 더 접종하는 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 발효유 제품은 10 ml 내지 5000 ml, 또는 25 ml 내지 3000 ml, 또는 50 ml 내지 1000 ml의 제품을 함유하는 밀봉 패키지로 포장되는 것인 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 방법에 의하여 얻을 수 있는 발효유 제품.
- 제16항에 있어서, 제품은 +6℃에서 28일 저장 후 적어도 108 cfu/g의 비피도박테리아를 함유하는 것인 발효유 제품.
- CHCC7018, CHCC4462, CHCC3912 및 이들 균주 중의 임의의 균주의 돌연 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 균주에 속하는 박테리아를 함유하는 발효유 제품.
- CHCC7018, CHCC3912 및 이들 균주 중의 임의의 균주의 돌연 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 균주에 속하는 박테리아를 함유하는 발효유 제품.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 103, 좋기로는 적어도 105 cfu/g의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 함유하는 것인 발효유 제품.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 105, 좋기로는 최소 107 cfu/g의 비피도박테리아 및/또는 적어도 105, 좋기로는 107 cfu/g의 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 균주를 더 함유하는 것인 발효유 제품.
- 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 발효유 제품은 요거트인 것인 발효유 제품.
- a) CHCC5445 (BB-12®) 등의 비피도박테리움 균주에 속하는 박테리아와,
b) 락토코쿠스 락티스 균주, 좋기로는 비피도박테리움 균주의 생장을 상승시키는 CHCC4462, CHCC3912 또는 이들 균주 중의 임의의 균주의 돌연 변이체 등의 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 균주 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주, 좋기로는 비피도박테리움 균주의 생장을 상승시키는 균주 (CHCC7018 또는 그들의 돌연 변이체 등)에 속하는 박테리아
를 함유하는 배양액 등의 조성물. - 전술한 항에 있어서,
i) BB-12® 또는 그들의 돌연 변이체로부터 선택되는 것인 105 내지 1012 cfu/g의 균주와,
ii) CHCC7018 또는 그들의 돌연 변이체 105 내지 1012 cfu/g 및/또는 CHCC4462, CHCC3912 및 이들 중의 돌연 변이체로부터 선택되는 것인 105 내지 1012 cfu/g 의 균주를 함유하는 것인 조성물. - 전술한 항에 있어서, 105 내지 1012 cfu/g 의 DN224 또는 DN223 또는 그들의 돌연 변이체/변종을 더 함유하는 것인 배양액.
- ST7018, ST7018의 돌연 변이체 및 ST7018의 변종, CHCC4462, CHCC4462의 돌연 변이체, CHCC4462의 변종, CHCC3912, CHCC3912의 돌연 변이체 및 CHCC3912의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 균주.
- ST7018, ST7018의 돌연 변이체 및 ST7018의 변종, CHCC3912, CHCC3912의 돌연 변이체 및 CHCC3912의 변종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 균주.
- ST7018, ST7018의 돌연 변이체, CHCC3912 및 CHCC3912의 돌연 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 균주.
- ST7018, CHCC3912 및 비피도박테리움 생장 촉진 성질이 있는 이들의 돌연 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 균주.
- 단리된 형태의 전술한 항 기재의 균주.
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