JPS58224685A - ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する新規微生物、その菌体の製造法および該微生物を含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は耐酸性を有するビフィドバクテリウム５０ンガ
ム（Ｂｉｆｉｃｌｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕ
ｍ云ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ−８２０１（Ｂ
ｉｆｉｄ、ｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　Ｍ
−８２０１）（以下「本菌」と記載する）、その製造方
法およびこれらを含む組成物に関する。

本発明の目的は耐酸性を有する点に有用性の高い新規微
生物を提供すること、この新規微生物を分離採取するこ
とおよびこの新規微生物を増殖することからなる新規微
生物の菌体の製造方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は耐酸性を有する新規微生物を
含有する食品用、飼料用ならびに整腸剤組成物を提供す
ることにある。

本明細書における「生残率」は試験開始時の生菌数に対
する保存後の生菌数の百分率であり、また「嫌気性菌培
養用寒天平板培地」はＢＬ寒天平板培地、ＭＧ寒天平板
培地、その他嫌気性菌を培養するために一般に広く使用
されている寒天平板培地である。

ビフィドバクテリウム属に属する微生物は、大または動
物（たとえば、豚、ニワトす、モルモット、ネズミ、マ
ウスなど）の消化管、糞便中に見出され、これらのもの
から多数の菌種あるいは菌株が分離されている。

ビフィドバクテリウム属に属する菌の分類については、
１’９６３年にＲｅｕｔｅｒが人に由来する菌をビフィ
ドバクテリウム（以下「Ｂ。」と略記する）・ビフィダ
ムａ　（Ｂｉｆｉｃｌｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉ
ｃｌｕｍａ）とす、Ｂ、インファンチス（Ｂ。

１ｎｆａ、ｎｔｉｓ）　、Ｂ、パルブローラムａ（Ｂ、
ｐ−ａｒｖｕｌｏｒｕｍ　ａ）とす、Ｂ、　ブレーベａ
（Ｂ、ｂ−ｒｅｖｅ　ａ＞　とｂＸＢ。リベローラム（
Ｂ、ｌｉ−ｂｅｒｏｒｕｍ）　、Ｂ、ラクテンチス（Ｂ
、　　１ａｃｔｅ　−ｔ。

ｎｔｓ）　、Ｂ。アドレツセンチスａ　（Ｂ。αｃｌｏ
ｌ−△ ｅｓｃｅｎｔｉｓ　（Ｚ）　〜ｃｌ−＋　Ｂ、ｏンガム
ａ　　（Ｂ＋ｌｏｎｇｕｍ　（Ｚ）とｂの８菌種に分類
しくＺｅｎｔｒａｌ＝ｂｌａｔｔ　　ｆｉｉｒ　　Ｂａ
ｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ、−）ｐａｒａｓ−ｉｔｅｎｋ
ｕｎｃｌｅ夕１ｎｆｅｃｌｃｔｉｏｎｓ　Ｋｒａｎｋｈ
ｅｉ　−ｔｅｎ　ｕｎｃｌ　Ｈｙｇｉｅｎｅ　：　Ａｂ
ｔ、Ｔ）Ｏｒｉｇｉｎ−ａｌｅｌｌ　９１巻第４８６頁
、１９６３年）、光間は人および動物に由来するすべて
の菌をＢ。

ビフィダムについて２つのタイプ、Ｂ。インファンチス
について２つのタイプ、Ｊ３゜ブレーベについて３つの
タイプ、Ｅ、パルブローラムについて２つのタイプ、Ｂ
。サーモフィルム（Ｊ３．　　ｔｈ、ｅ　−ｒｍｏ　ｐ
ｈｉｌｕｍ）について４つのタイプ、］Ｂ３アドレツセ
ンチスについて４つのタイプ、Ｂ。ロンガムについて４
つのタイプ、Ｂ、シュードロンガム（Ｂ、　ｐｓｅｕｄ
ｏ−１ｏｎｇｕｍ）について４つのタイプ、Ｂ。リベロ
ーラムおよびＢ。ラクテンチスについてそれぞれ１つの
タイプに分類して報告している。

そして国際微生物学会の中におかれている細菌の命名と
分類についての国際委員会のビフィドバクテリウム小委
員会はＢ。ビフィダム、Ｂ。インファンチス、Ｂ、ブレ
ーベ、Ｂ２サーモフィルｌ＼、Ｂ６アドレツセンチス、
Ｂ。ロンガム、Ｂ。シュードロンガム、Ｂ。スイス（Ｂ
、５ｕｉｓ）　、Ｂ。

コリネフオルメ（Ｂ、ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ）ｚ　Ｂ
、アステロイデス（１３゜ａｓｔｅｒｏｉｃｌｅｓ）　
　およびＢ。

インディカム（Ｂ、　　１ｎｃｌｉｃｕ、ｍ）の１１菌
種に分類し、Ｂａｒｇｔ４１’ｓ　Ｍａｎｕａｌ第８版
にもとりあげられている（Ｊ３ｕｃｈａｎａｎ−、ＪＬ
　Ｅ、　ｃｔｎｒｌ　Ｇｉ　−ｂｂｏｎｓ−、Ｎ、　Ｅ
、　　ｉ　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍ（１ｎｕａｌ　　ｏｆ
Ｊ）ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｆ３ａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ、）−８ｔｈｅ　ｄ、（＞、ｌ　　第６６９頁
〜第６７６頁、Ｂａｌｔｉｍｏ−ｒｅｚ　Ｔｈｅ　Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ　ＷｉＬｋｉｎｓ　Ｃｏ。、△ １９７４年）。

Ｖｆｉｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ第６８巻、第２７８頁
１９６ろ年およびｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ　　ｆ’６
．ｒ　　Ｂ−ａｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅｚ　ｐａｒａｓ
ｉｔｅｎｋｕｎｄｅ−、１−ｎｆｅｃｔｉｏｎｓｌｃｒ
ａｎｋｈｅｉｔｅｎ　ｕｎｄ　Ｆｌｙｇｉｅｎｅ：ｈｂ
ｔ、　　ｎ、Ｏｒ　ｉ　ｇ　ｉ　ｎａ　ｌ’ｅｚ’第１
２６巻、第６４頁　１９６９年）により、Ｂ。ルミナー
レ（Ｂ。

ｒ　ｕ、ｍｉ　ｎａ　ｌ　ｅ）および狙　グロボスム（
’１３．　　ｇｌｏ　−ｂｏｓｕｍ）がＳ　０ｒｏｃｉ
ａｎｉ　（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ
　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａ、ｃｔｅｒｉ
ｏｌ−’ｌ）ｕ　Ｓ第２４巻、第６頁、１９７４年）に
より、Ｂ。アンチウム（Ｂ、　ｒｌｅｎｔｉｕｍ）　、
Ｅ、カテヌラーツム（Ｂ、　ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）
およびＢ。アングラ−タム（Ｂ、ａｎｇｕｌａｔｕｍ）
が−Ｉ　Ｚａｎｉ（Ｉｎ、ｔｅｒｎ、ａｔｉｏｎａｌ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　８ｙｓｔｅ　−ｍａｔｉｃ　
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｓ、第２４巻、第２９頁１
９７４年）により、Ｂ。マグナム（，１３，ｍａｇ−ｎ
　ｕｍ　）　　が）　”Ｔ’ｒｏｖａｔｅｌｌｉ　　（
Ａｒｃｈｉｖ　　ｆＭｒＭｉ１ｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｉｅ
ｚ第９８巻、第１８７頁、１９７４年）により、Ｂ。プ
ローラム（Ｂ、７）−ｕｌｌｏｒｕｍ）　　が、Ｇｅｏ
ｒｇ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｂ　−ａ、ｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ−ｓ第８８巻、第４７７頁、１９６４年）
により、Ｂ、エリ、％ＱイＢ、ｅｒｉ−ｋｓｏｎｉ　ｉ
　）がそれぞれ報告されている。

更にｌＬｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ”Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ　　（以下「ＡＴＣＣ」と略記
する）のカタログ　（Ｏａｔａｌｏ、ｑｕｅ　　ｏｆ　
　５ｔｒａｉｎｓ　　Ｌ、　１６ｔｈｅｃ１．、第４５
頁−第４７頁、１９７８年）にぼれば、前記の種の他に
Ｂ、ベルミフオルメ　（Ｂ。

ｖ　ｅ　ｒｍｉ　ｆ　ｏ　ｒｍｅ　）が知られている。

このように、ビフィドバクテリウム属に属する菌種は多
数知られているが、ビフィドバクテリウム属の菌種の分
類の日本における権威者であり、前記国際委員会の委員
である光間の著書（本間道、光間知足共編「ビフィズス
菌」第３５頁〜第６６頁、■ヤクルト本社、１９７８年
７月）によれば、現状では、なお主として糖分解性状に
よって次のように鑑別分類するのが妥当であるとされて
いる。

それによればこの属の種は、Ｂ。ビフィダムａ１１３゜
ビフィダムｂ、Ｂ。インファンチス　サブスピーシーズ
（以下ｌ−８Ｓ、Ｊと略記する）インファンチス（Ｅ、
　　１ｎｆａｎｔｉｓ　５ｕｂｓｐｅｃｉｅｓ　　ｉｎ
　−ｆａｎｔｉｓ）　、Ｂ、インファンチスｓｓ。リベ
ローラム、Ｂ−インファンチスＳＳ。ラクテンチス、Ｊ
３゜ブレーベｓｓ、ブレーベ、Ｂ、プレーへｓｓ、パル
ブローラム、Ｂｏサーモフィルム（Ｂ、ルミナーレと同
−表１）、Ｂ、アルドレツセンチスａｓ：Ｂ、アルドレ
ツセンチスｂ（Ｂ、アンチウムおよび１３゜エリクソニ
と同−表現型）　、Ｂ、アルドレツセンチスｃ　　（Ｂ
、カテヌラーツムと同−表現型）、Ｂ。

アルドレツセンチスｄ　にＢ。アングラ−ツムと同−表
現型）、Ｂ、ロンカムｓｓ。ロンカム（１１Ｂ。

ロンガムＳＳ、ロンカ゛ムｂＸＢ、ロンカムＳＳ、アニ
マリスａ　（１３，ａ、ｎｉｍａｌｉｓ　ｃｙ、）　　
（１３，Ｖグナム、Ｂ。スイスお上びＢ６プローラムと
同−表現型）、Ｂ。ロンガムｓｓ。アニマリスｂＳＢ。

シュードロンカム（Ｂ。グロボスムと同−表現型）　、
Ｂ、アステロイデス（Ｂ。コリネフオルメと同−表現型
）およびＢ・インディカムである。さらに光岡の最近の
著書（光間知足著「腸内菌の阻界」叢文社、１９８０年
８月）によれば１３．ロンガムＳＳ。アニマリスａおよ
びｂは、Ｂｏコロンムの亜種（Ｓ−ｕｂｓｐｅｃ　ｉｅ
ｓ　）ではなく、新たに１３゜アニマリスとして分類さ
れている。

Ｂ、ロンガムに属する公知知、の菌株の菌学的性質につ
いて前記光岡およびＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ第
８版に記載されている事項をまとめれば、第１表のとお
りである。

文献 （１）日本細菌学雑誌、第２４巻　第６号第２６１頁〜
第２８０頁、１９６９年。

（２）本間道、光間短足共編「ビフィズス菌」第５２頁
　株式会社ヤクルト本社、１９７８年７郡。

（３）　　、Ｂｕｃｈａｎａｎ、Ｒ，Ｅ、＆　Ｇｉｂｂ
ｓＯｎｓ、ＮＥ編為Ｂｅｒｌｅｙ’ｓ　Ｍａ、ｎｕａｌ
　　ｏｆ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＪ３ａｃｔｅｒ
ｉｏ１ｏｇｙ３１第８版、第６７２頁−第６７６頁、Ｂ
ａｌ　ｔ　ｉｍｏｒｅ勺Ｔ／Ｌｅ　Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉａ
ｍｓ　＆Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｏｏ、、１９７４年。

記号の説明 」−：強陽性 一：陰性 Ｓ：　おくれで反応 ±：陰性またはおくれで弱陽性 ：不定 一：　まれに陽性 注１ （ａ）細胞は長く、弯曲した梶棒状あるいは隆起又は唖
鈴状の桿状であり、二またに分かれることがある。

（ｂ）ダラム染色性は変動する。

（ｃ）　　コロコ×マ凸状ないしクッション状あるいは
金縁、直径２〜５ｍｍ、軟かく湿潤し、光沢または粘性
あり。

（ｄ）グルコースからの最終生産物：酢酸およびＬ（１
）乳酸、ガス酸性せず。

（ｃ）　　ペントースを発酵し、グルコン酸塩を発酵し
ないビフイドバクテリアは、通常この種に分類され、以
前デーネル）（１９５７年および１９系０年）の第５群
に分類されていた。

（ハ　４６５°Ｃおよび２０°Ｃにおいて生育せず。

（ｙ）　　乳児および成人の糞便から分離される。

（ｈ）標準菌株：Ｅ１９４ｂ、ＡＴＯＯＩ　５７０７Ｃ
Ａ％ｅｕｔｅｒｚ　１９７１年） 一方ヒフイ１゛バクテ１炉ンム（・Ｊ６に属する菌は、
人ｙは動物の腸内菌叢を形成するｉ：、要な菌であるこ
とか知られており、従来これらの菌は整腸剤、食品、栄
養剤あるいは飼Ｈに広く利用されている。

しかしなから、ヒフイドバクテリウム属に属する公知の
閑は一般に耐酸性に乏しく、酸性の状態におｉ−＋るこ
の菌の生残率は極めて低い（［１本細菌学雑誌、２９巻
４号、６９１〜６９７頁、１９７４年及び薬剤学、２８
巻、４シじ、３６１〜６６２貞、１９６８年）。そして
この菌を用いて発酵乳を製造し、ｐＨ４，６〜４９てＺ
ＦＩ間保持した場合、この菌の生残率は約−１に減少Ａ
ることも知られ００ ている（、Ｆ、　　Ｍｉｉｌｌｅｒら―Ｍｉｌｃｈｗｉ
ｓｓｅｎ、ｓ　−ｃｈａｆｔｚ　　２３巻、９号、５５
４〜５ｓ８ｉ＜及び１０′？ｊ、６１４〜６１８頁、１
９６８年）。そしてＭ’ｒｊｌｌｅｒらはこの論文の中
でヒフイトバクテリウム菌を含む発酵乳製品において、
製品の７）［（が４６以下であってはならないと述へて
いる。

このことはこの菌かｐＪ−］　４．３以ドにおいて急激
に死滅することを意味している。従って、公知のヒフイ
ドバクテリウム属に属する菌を食品、医薬品、飼料に使
用する場合、酸性の食品の保存中に、又、食品、経１」
投ｌｊ、医薬品又は飼料と寺して用いたときには、人あ
るいは動物の胃の低い７）ＩＩにおいて死滅する欠点か
ある。

このような点からヒフイドバクテリウム・属に属する耐
酸性菌について研究がなされ、Ｂ、ヒフイこれらの変異
株を用いた発酵乳の製造法も知られ用島らか発明した特
許第７０８３９ろ号（特公昭４７−２９９９５号公報）
におけるラクトバチルス・ヒフィダス変異株Ｍ　　７２
０４　＜Ｊ、ａｃｔｏｂ−ａｃｉｌｌｕｓ　ｂｉｆｉｄ
ｕｓ　ｖａｒ、Ｍ−７２０４）（ｆｉＥ自ｍ自室菌寄第
１６２４吋ド寄託株という。）は、耐酸性をイｆする菌
株で壱り、そしてこの菌株は現在の分類によればＪ３．
　ロンカムに属する変異性である。しかし後述するよう
に寄託株と本菌とは菌学的性質か異なり、特に耐酸性に
おいて本菌か格段にずくれている。

以１．０ように多種、多体にわたって人の消化管に存在
するヒフイドバクテリウム・属の細菌のうち、年令を問
わず人の腸管内に広く存在することか知られ＜Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｊｏｕ、ｒｎ、ａｌ　　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａ−１Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、、　　ろ０弥、１７９９〜
１８１０頁、１９７７年）、その出現頻度が最も高い（
Ｃａ、ｎｃｅｒ　Ｊ’ｔｅ、ｑｅａ、ｒｃｈ　＋　５５
　巻、３４０．７〜て耐酸性をｒＴする菌株を取得する
ことは食品、飼料あるいは医薬品産業１―特に利用価値
の高いもの未 であるか、才だ満足すべき菌株は知られていない。

本発明者らは、ヒフイドバクテリウム・ロンカムに属す
る閑であって、強い耐酸性を泊する閑を分Ｓずへく検索
を行ない、健康な乳児糞便からヒフイドバクテリウム、
・ロンカムに属し、耐酸性を有する有用性ある菌株を見
出した。

次に本発明について、４普１１］に記・成する。

（１）耐酸性菌株の取得 本発明者らは前記のような耐酸性を有する菌株を自然界
から取得すべく、ビフィドバクテリウム属に属する菌種
が多数存在する健康な乳児の糞便から次の方法により菌
株の分離を行なった。

乳児糞便を滅菌生理食塩水で適宜希釈し、ＭＧ寒天培地
（Ｍｏｄｉｆｉｅｒｌ　Ｇａｒｃｈｅ’ｓ　Ａｇａｒの
略、赤口ら、食品衛生学雑誌、２３巻、１号、６９〜４
４頁、１９８２年）の平板に塗抹し、６７°Ｃで嫌気培
養した。そして得られたコロニーの中でビフィドバクテ
リウム属特有の形態を示し、かつ塗抹標本の顕微鏡観察
によりダラム陽性であり、棒状、こん棒状又は分岐状の
閉形を示す菌を釣菌しＭＧ寒天平板培地に画線塗抹し、
前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋にｍ離され
た菌株を得た。この菌株をｐＨ４，５〜５５に調整した
ＭＧ寒天平板培地で嫌気培養し、得られたコロニーを更
にペニシリンＧカリウム（明治製菓製）０５〜１．０単
位／ｍｌ含有ＭＧ寒天平板培地で嫌気培養し２０余の菌
株を得た。次いでこれらの菌株を上記２種のＭ、Ｇ寒天
平板培地で嫌気培養を反復し、最も生育のすぐれた１菌
株を分離した。

（２）菌学的性質 この分離した菌株の菌学的性質は、次のとおりである。

２−１）生理学的性質 ａ）ガスを産生せず ｂ）１５°Ｃで発育せず Ｃ）運動性なし ｄ）好気的条件で発育せず ｅ）ブドウ糖からの主な発酵生成物 乳酸及び酢酸 ｆ）糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、グルコース、フラクトース
、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクト
ース、メリビオース、メレチトースは陽性、 ラムノース、リボース、セロビオース、トレハロース、
グリコーゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール
、イノシトール、エスクリン、サリシン、アミグダリン
、グルコン酸塩は陰性、 ラフィノース及びデキストリンは遅れて陽性、マンノー
ス、スターチ及びα−メチルグルコシドは遅れて弱陽性
、 ｇ）インドール産生せず ｈ）硫化水素産生せず ｉ）硝酸塩を還元せず ｊ）カタラーゼ陰性 ｋ）ペニシリン含有ＭＧ寒天平板培地（ペニシリンＧカ
リウム０５〜１．０単位／ｍｌ）で発育（後述する（６
）の試験参照）。

ｌ）耐酸性（後述する（４）の試験参照）菌体を滅菌し
た緩衝液に懸濁してｐＩ（を４，６に調整し、５°Ｃで
７日間保持した時、少なくとも１％の生残率を示す。

２−２）形態学的性質 ａ）閉形（光学顕微鏡による観察） ＢＩＴ、寒天平板培地（光間短足；臨床検査、１８巻、
１１６３〜１１７２頁、１９７４年）を用い、３７°Ｃ
で４８時間常法により嫌気培養した本菌は、０．５〜０
．８Ｘ１．７〜４．０μ、桿状、こん棒状又は分岐状の
繭形を有する。

ｂ）コロニーの形態 前記２−２）のａ）と同一の条件で培養した本閑のコロ
ニーの形態（光間短足著「腸内菌の世界Ｊ、１１０頁、
叢文社、１９８０年８月）は次のとおりである。

形　状：円形（ｃｉｒｃｕｌａｒ） 隆　起：凸円状（ｃｏｎｖｅｘ） 周　縁：円滑（ｅｎｔｉｒｅ） 大きさく直径）＝１〜３　ｍｍ 色　調：褐色で不透明 表　面：円滑で光沢あり 以上の菌学的性質かｄ本菌は糖の発酵性のうちＡＴＯＣ
のカタログ記載の菌株（以下ＡＴＯＣ株と記載する）と
はリボース及びラフィノースについて異っているが、分
類学上公知のＢ。ロンガムに属する菌学的性質を示し、
かつ耐酸性において公知の４７００株と異っている。さ
らにこの性質は２０代にわたって継代培養しても維持さ
れていたので、本菌独特の性質とみることができ、本菌
は公知の菌株にはないすぐれた耐酸性を有する新菌株と
認められる。

本発明者らはこの菌株をＢ。ロンガム　Ｍ−８２０１と
命名し、昭和５７年５月６１日に工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託し、微工研菌寄第６５４８号なる受託
番号を得た。

（ロ）ペニシリンＧカリウムに対する感受性の比較１’
ｌ＋ 本菌、前記寄託株、Ａ’ｌ”０Ｃ１５７０７及びＡＴ（
３０１５７０８の４種のＢ。ロンガムに属する菌株につ
いて、ペニシリンＧカリウムに対する感受性を次の方法
により試験した。上記４菌株をブリラグスリバーブロー
ス（光間短足り臨床検査、１８巻、１１６３〜１１７２
頁、１９７４年）に５％（Ｖ／Ｖ　）　　接種し、６７
°ｃで２４時間培養した培養液を被検菌液とした。次に
ＭＧ寒天培地を用いて調製したペニシリンＧカリウムを
含む平板に前記被検菌液の１白金耳を、画線塗抹し、６
７°Ｃで常法により嫌気培養した。２〜５日培養後、コ
ロニーの形成の有無を観察し、各菌株のペニシリンＧカ
リウムに対する感受性の比較を行なった。

ペニシリンＧカリウムの培地中の濃度とコロニー形成の
有無を第２表に示す。

第２表 （注）十：　　コロニーを形成する （ト）：わずかにコロニーを形成する ｍ：　コロニーを全く形成しない 第２表から明らかなように本菌は、他の６菌株よりペニ
シリンＧカリウムに対する感受性が低く０５〜１．０単
位／　ｍｌの濃度でも発育ｉｉＪ能であった。

５ｕｔｔｅｒ及びＦｉｎ、ｅｇｏ　ｌ　ｄ、　（Ａ？＋
、ｔ　ｉｍｉ　ｃ　ｒｏ　ｂｉａｌＡｇｅｎｔｓ　　ａ
ｎｄＯｈ、ｅｍｏｔｈｅｒａ７）’ｌ／ｚ　１０巻−４
号）７６６〜７５２頁、１９７６年）はビフィドバクテ
リウム属のペニシリンＧに対する感受性は、０．５単位
／づ以下と報告しており、本菌はビフィドバクテリウム
属の中でもペニシリンＧカリウムに対して低い感受性を
示す菌株である。

（４）耐酸性の比較 本菌、前記寄託株、ＡＴＯ！０１５７０７、ＡＴＣＯ１
５７０８の４種の１３、ロンガムに属する菌株について
、耐酸性を次の方法により試験した。

４−１）　　ミルクカルチャー一における生残性試験前
記ブリラグスリバーブロースを用いて調整した前記４菌
株の前培養液を酵１サエギス０．２５％（ＷＯＷ）を添
加した１０％（ＷＯＷ）還元脱脂乳培地に１０％（Ｖ／
Ｖ）接種して６７°Ｃて６〜８時間培養し、さらに同培
地で２〜４代継代培養し、ｐＩＪ４．８のミルクカルチ
ャーを調製した。

このミルクカルチャーを急冷して５°Ｃで保存した場合
の生菌数の変化と生残率を第６表に示す。

ビフィドバクテリウム菌の生菌数は、ミルクカルチャー
を光間（臨床検査、１８巻、１１６３〜１１７２頁、１
９７４年）の希釈液で段階的に希釈した後、ＭＧ寒天培
地の試験管を用いた高層寒天培養法（赤口ら；食品衛生
学雑誌、２６巻、１号、６９〜４４頁、１９８２年）で
測定した。

第６表から明らかなように本菌は他の６菌株よりミルク
カルチャーにおける生残性が極めて高く７日間の保存で
５０％以−ヒの生残率を示した。

４−２）低ｐＩ−１緩衝液における生残性試験前記４菌
株のミルクカルチャーを滅菌生理食塩水で１／１０に希
釈し、これを各７）Ｈの緩衝液に１／６０の割合で添加
、混合し、最終的に４．０．４゜６．４゜６．５゜０，
６．０の５段階の７）Ｈになるように調整して５°Ｃに
保存した。緩衝液はｐｒ１４．０〜５．０の場合１／１
００モルの酢酸−水酸化す）　ｌ）ラムの酢酸緩衝液を
使用し、ｐＨ，６，ＣＪの場合、１／１００モルのリン
酸２ナトリウム−リン酸１カリウムのリン酸緩衝液を使
用した。

前記ｐ■■緩衝液中の前記４菌株の生菌数の変化と生残
率を第４表に示す。生菌数は前記４−１）項記４曳の方
法で測定した。

結果を第４表に示ず。

第４表から明らかなように、水閘はいずれのｐ（目こお
いても他の６菌株より生残性が高く、特にｐＨ４，０〜
５．０の低い７）、［（領域においてその差が顕著であ
る。

即ち水閘を５°Ｃで７日間保存した場合、７））Ｊ、　
５．０において２４．６％、７）Ｈ，４，６において１
１．８％、ｐＨ４，３において１．２％、ｐ）１４．０
において０．６％の生残率を示すのに対して、他の６菌
株は７）Ｈ２Ｏにおいてさえも生残率がいずれも１％未
満である。

水閘の試験結果は、前記Ｍｕｌｌｅｒらの報告と股 比較しても格ｆにすぐれそい）る。即ち　Ｎｕｌｌ−ｅ
ｒらの報告では７＋、ｔｌ　４．６〜４９で７日間保存
したときのビフィドバクテリウム菌の生残率が約１％で
あるのに対して、水閘のそれはｐ、Ｈ５，０で２４．３
、ｐＪ■４．６で１１８％である。

このように水閘は低いｐＩ−ｉ領域においてずぐれた耐
酸性を有し、この性質は従来公知の菌株及び文献にも認
められないすぐれたものである。

前記の結果と同様の傾向は、前記液体培地ブリラグスリ
バーブロースで培養した各菌株の菌体についても認めら
れた。

４−６）ヨーグルトにおける生残性試験１２％（Ｗ／Ｗ
）　ノ還元脱脂乳を９０’Ｃて１０分間殺菌した後、４
５°Ｃに冷却し、１０％（ｗ、、’ｗ）還元脱脂乳で調
整したストレプトコッカス・サーモフィルス（８ｔｒｅ
ｐｔｏｃ、ｏｃｃｕ、ｓ　’Ｊ）ｈ、ｅｒｍｏｐｈ、−
１１ｕｓ）とラクトバチルス・プル方すクスの混合カル
チャー６％（Ｖ／Ｖ）および水閘のミルクカルチャー２
％（Ｖ７Ｖ）を接種し、４０”ｃテ５１１５間発酵し、
のち直ちに冷却し、ヨーグルトを製造した。そしてこの
ヨーグルトを５°Ｃて１０日間保持し、田−グルト中の
水閘の生残菌数を測定した。

生菌数の測定は、ヨーグルトを前記光間の希釈液で段階
的に希釈し、ビフィドバクテリウム菌選択培地であるＭ
、　Ｇ　’Ｌ　、Ｐ寒天培地（前日ら；食品衛生学雑誌
、２３巻、１号、３９〜４４頁、１９８２年）を使用し
た高層寒天培養法によった。

又比較のため水閘の代りにＡＴＣＣ１５７０８を用いて
同様に試験した。そして生菌数の変化及び生残率を、ヨ
ーグルトのｐＨ及び乳酸酸度の参考値とともに第５表に
示す。

尚、前記寄託株及びＡｉ’００１５７０７を用いた試験
も行なったが、ＡＴＣＣ１５７０８とほぼ同等の結果を
示したので、これらの菌株の結果は第５表に記載しなか
った。

第５表から明らかなように水閘を使用して製造したヨー
グルトを５°Ｃて１０日間保存した場合、ヨーグルト中
には製造直後の６２％の水閘が生存している。一方ＡＴ
ＯＣ１５７０８を使用して製造したヨーグルトでは、１
％以下の生残率であり水閘の生残率が極めて高い。

このように酸性の食品、低７）ｌ（緩衝液及び、ミルク
カルチャーにおいて、水閘の生残率と他のＢ。

ロンガムに属する菌のそれとの間には格段の相違が認め
られ、水閘はすぐれた耐酸性を有することが判明した。

以上のことがら水閘は本質的に耐酸性を備えており、培
養物又はその加工物の保存中の生菌数の低下が少なく、
広いｐＨ域の飲食物への加工が可能である。更に水閘を
凍結及び凍結乾燥したときの生残率もすぐれていること
が試験により確認されているので水閘の用途は極めて広
範である。

たとえば、古くから知られている人又は動物の医薬品と
しての整腸剤に利用できることは勿論、粉末状の食品、
飼料あるいは液状又は半固状の飼料、食品に添加あるい
は混在させることもできる。

このように水閘は従来公知の菌株には認められないすぐ
れた性質を有しており、産業上極めて有用である。

実施例１ 肉エキス５０ｇ、酵母エキス１００Ｊ７％ペプト”１０
０ハ乳糖２００　ｇＮ　Ｋ２　Ｆ−１，Ｐ　Ｏ，＋　５
０１　。

ＫＩｈＰＯ４１０，ｑ１シスチン４　、ｑ及び水９５１
からなる培地（ｐｔｉ　６．５）　１０　ｌを１２１°
Ｃで１５分間滅菌し、ろ７°Ｃに冷却した。一方、予め
同一組成の培地により３７°Ｃて１６時間前培養した水
閘のシードカルチャー５ＱＱｍＡを前記の培地１０１に
接種し、６７°Ｃで１６時間培養した。

さらに９０°Ｃで６０分殺菌した同一組成培地２００ｔ
に前記培養液全量（１０，５１）を接種し、３７℃で１
６時間培養した。培養後の生菌数は２．５×１０９／−
であった。

次いでシャープレス型遠心分離機（１ｂ、０００ｒｐｍ
）により菌体を集め、培地と同量の９０°Ｃで６０分間
殺菌の生理食塩水に再懸濁し、前記と同様遠心分離して
再度集菌した。得られた菌体を脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ
）　、蔗糖１％（Ｗ／Ｗ）、グルタミン酸ソーダ１％（
Ｗ／Ｗ）からなる溶液（９０°Ｃ１６０分殺菌）２０１
に懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、１．４　Ｘ　１０
】１／　ｇ　の水閘を含有する粉末約２．２ｋｑを得た
。

実施例２ 酵Ｉサエギス０２％（ｗ／ｗ）、脱脂粉乳１０％（〜Ｖ
／〜へりからなる９０″Ｃ３０分殺菌後の培地１　、Ｏ
Ｑ　Ｑ　ｍＨ，Ｈ本菌を接種し、６７°ｃで６時間培養
した。一方、１０％（ＷＩＷ＞還元脱脂乳培地１５０　
ｏ−、ｅヲｑ　ｏ°Ｃｒ３０分間殺菌し、ストレフｉ・
コツカス・サーモフィルス＜５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃ　−
ｃｕｓ　　ｔｈ、ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバ
チルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｂｕｌｇａｒ　−ｉ　ｃ　ｔイｓ　）　の混合カルチャ
ー５０づを接種し、４２゛Ｃで４時間培養した。　１１ ０れとは別に乳脂肪６．１％（Ｗ／Ｗ）　、ｆｎ（指名
固形分９％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０１を６０′Ｃに
加湿し、１５０　ｋｑ／ｃｄの圧力で均質し、９０’Ｃ
で１０分間殺菌し、４０”Ｃに冷却した。この殺菌した
牛乳に前培養した前記の本菌カルチャー１０００−及び
ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス
・フ゛ルカリタスの混合カルチャー１５００ゴを接種し
、５０〇−容の容器に充てんし、密封し、４０“′Ｃで
４時間培養し、直ちに冷却した。得られた発酵乳は乳酸
酸度０８５％、ｐＩ−１４，４０であり、本菌８２×１
０６／ｒｎ１１ストレプトコッカス・サーモフィルス３
７Ｘ１０７／ｒ’ＬＡ’、ラクトバチルス・ブルガリク
ス３１　Ｘ　１０７／′ｒｎノを含有していた。この発
酵乳を１０°Ｃて１０日間深存したときの水閘の菌数は
２１　Ｘ　１０６／／ｍｌてあり生残率は２６％であっ
た。

実施例３ 乾燥殺菌した澱粉１４ｋｇ及び乳糖６ｋｇに、実施例１
で得た水閘を含有する粉末２０ｇを加えて均一に混合し
、１０８／ｇの水閘を含有する粉末の整腸剤約２０に９
を得た。

実施例４ トマトピユーレ８００ハ蔗糖２０ｇｚ食塩１ｇ１グルタ
ミン酸ソーダ０．８　（Ｉ　Ｎ香料０．５ｇ（いずれも
市販品）を水１６０ｇと混合し、殺菌冷却し、更にこの
混合液に実施例２と同様の方法で調整した本ｍ２０ｇと
常法により調整したラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃａｓｅｉ　）のカルチャー５
０ｇとを添加して均一に混合し、ビフィズス生菌入り乳
酸菌飲料約１　ｋｙを製造し、１００ｆｎｌ容ガラスビ
ン１ｏ本に分注して密封した。

この乳酸菌飲料は製造直後のｐＨが４．６０であり水閘
１４８Ｘ１０６／／ｍ、ラクトバチルス・カゼイを５２
Ｘ１０６／ｍ含有し、１０”Ｃで１０日間保存したのち
の本菌の菌数は５９　Ｘ　１０’／ｄ、生残率１２％で
あった。

実施例５ 市販のコーンミール６９に９、大豆粕２１に９、ボウム
１ｋｇ、炭酸カルシウムＩ：１５に９、飼料用混合無機
塩（オリエンタル酵母工業製）０．５ｋｇ、飼料用混合
ビタミン（オリエンタル酵母工業製）１ｋｇからなる子
豚用配合飼料１００１（９に実施例１で得た水閘を含有
する粉末１０ｇを添加して均一に混合し、子豚育生用の
粉末飼料約１００　ｋｔ；ｔを得た。

この飼料には１ｇ当り、製造直後１．４Ｘ１０７の水閘
が含まれ、室温で６カ）”Ｊ　ＩＩ＋保存後では１ｇ当
りろ０Ｘ１０５の水閘が含まれていた。

特許出願人森永乳業株式会社 代理人弁理士津１）昭 ・′：ｊ 手　ｔｌ　　＠　　ＴＦ、ＩＦ　　（方Ｅ）□・昭和５
７年ＩＯ月１９日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 Ｉ　事件の表示 昭和５７年特許１１ＦＮｌ’ｊ１０６１８２号２　発明
の名称 ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する新規微生物、
その菌体の製造法および該微生物を含む組成物 ３　Ｎｍをする者 事件との関係　特許出願人 東京都湊区芝五丁目３３番１号 （６１２）森永乳業株式会社 代褒者　門　＃　　貢 ４代理人 ５　Ｍ正命令の日付　昭和５７年　９月　９日６　補正
の対繊　明　細　冑／’？’？ｆ’！γノ、＼７　補正
の内容 明細」１ページ、第２０ページないし第２３ページ、第
３８ページ、＠４１ページ、第４４ページおよび第４９
ページを別紙のとおりに補正します。

（ただし第１ページ以外は内容に変更なし。）明　　　
細　　　書 １、発明の名称 ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する新規も 微生物、その菌体の製造法および該微生物を含会す→組
成物 ２、特許請求の範囲 （１）菌体を滅菌した紛衝液に懸濁し、ｐＨを４．６に
８１整して５゛Ｃで７日間保持した時、少くとも１％の
生存率を有する耐酸性を示すビフィドバクテリウム・ロ
ンガム。

（２＞　　前記のビフィドバクテリウム・ロンガムが下
記の菌学的性質を示すことを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の菌株。

＜ａ＞　　Ｍ体を滅菌した緩衝液に懸濁し、７）Ｈを４
．６に調整して５°Ｃで７日間保持した時、少第２表 （注）十：　　コロニーを形成する （ト）：わずかにコロニーを形成する ー：　コロニーを全く形成しない 第２表から明らかなように水閘は、池の６ｍ株よりペー
ジリンＧカリウムに対する感受性が低く　　　　　州０
５〜１．０単位／ｍｌの濃度でも発育可能であった。　
　　　ヤ５ｕｔｔｅｒ及（Ｆ　Ｆｉｎｅｇｏｌｄ　（Ａ
ｎｔｉｍｉａｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓ　　ａｎｄ　Ｏ
ｈｇｍｏｔｈ、ｅｒａｐｙ、１０巻、４号、７３６〜７
５２頁、１９７６年）はビフィドバクテリウム属のペニ
シリンＧに対する感受性は、ざ ） （

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、ｐ−１−１を４
   ．３に調整して５°Ｃで７日間保持した時、少くとも１
   ％の生存率を有する耐酸性を示すビフィドバクテリウム
   ・ロンガム。 （２）前記のビフィドバクテリウム・ロンカムが下記の
   菌学的性質を示すことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項に記載の菌株。 （ａ）菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、７）Ｈを４６に
   調整して５°Ｃで７日間保持した時、少くとも１％の生
   残率を有する耐酸性。 （／Ｊ）ＢＬ寒寒天版板培地用い、６７°Ｃで４８時間
   嫌気培養したときの菌の形態： ■　大きさ：０．５〜０．８Ｘ１．７〜４．０μ嫉 ■　形　状：桿状あるいは分校状 （ｃ）ＢＬＬ天平板培地を用い、６７°Ｃで４８時間嫌
   気培養したときのコロニーの形態：■　形状二円形 ■　隆起：凸円状 ■　周縁：円滑 （４）　　大きさく直径戸１〜３ｍｍ ■　色調：褐色で不透明 ■　表面二円滑で光沢あり （ハ　運動性なし ω）好気的条件で発育せず （ｈ）　　ブドウ糖からの主発酵生成物：乳酸および酢
   酸 （ｉ）糖からの酸生成： アラビノース、キシロース、グルコース、フラクトース
   、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクト
   ース、メリビオースおよびメレチトースは陽性、 ラムノース、リボース、セロビオース、トレハロース、
   グリコーゲン、イヌリン、マンニトール、ツルロール、
   イノシト〒ノＬ／、エスクリン、サリシン、・（ アミグダリンおよびグルコン酸塩は陰性、ラフィノース
   およびデキストリンは遅れて陽性、マンノース、スター
   チおよびα−メチルグルコシ（〕）インドール：産生せ
   ず、 （ｋ）　　硫化水素：産生せず、 （１）　　硝酸塩を還元せず、 ６７１）　　カタラーゼ：陰性、 （？７）ペニシリンを含むＭＧ寒天平板培地（ペニシリ
   ンＧカリウム：Ｑ、５〜１．０単位／ｒｎｌ＞で発育す
   る。 （６）前記のビフィドバクテリウム・ロンガムがビフィ
   ドバクテリウム・ロンガムＭ−８２０１または第２項に
   記載の薪菌株。 （４）人の糞便を生理食塩水で希釈し、嫌気性菌培養用
   寒天平板培地で、３７°Ｃにおいて嫌気的に培養するこ
   と、得られたコロニーの中がらビフィドバクテリウム属
   特有の形態を示し、グラ収 ム陽性であって、棒状、こん棒状または分綾訣の画形を
   示すコロニーを釣菌すること、得られた菌を上記嫌気性
   菌培養用寒天平板培地で、６７°Ｃにおいてさらに嫌気
   的に培養すること、および得られた菌をｐＨ４，５〜５
   ．５であって、」二記嫌気性菌培養用寒天平板培地で培
   養し、さらに０５〜１．０単位／−のペニシリンＧカリ
   ウムを含む上記の嫌気性菌培養用寒天平板培地で培養し
   、生育の良い菌株中より下記の菌学的性質を有する菌株
   を分離採取する口とを特徴とする菌体を滅菌した緩衝液
   に懸濁し、ｐＨを４．６に調整して、５°Ｃで７日間保
   持した時、少くとも１％の生残率を有する耐酸性を示す
   ビフィドバクテリウム・ロンガムの製造方法。 （５）前記の菌学的性質が下記のものであることを特徴
   とする特許ｄ青水の範囲第４項に記載の方法。 （（Ｚ）　　菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、７）Ｈを
   ４．３に調整して５°Ｃで７日間保持した時、少くとも
   １％の生残率を有する耐酸性、 （ｂ）ＢＩ４天平板培地ヲ用イ、３７°ｃ−ｃ４６時間
   嫌気培養したときの菌の形態： ■　大きさ二０．５〜０．８Ｘ１．’７〜４．０μ坂 ■　形　状：桿状あるいは分綾状 （ｃ）ＢＬ寒天平板培地を用い、６７°Ｃで４８時間嫌
   気培養したときのコロニーの形態：■　形状二円形 ■　隆起：凸円状 ■　周縁：円滑 ■　大きさく直径）：１〜３ｍｍ （９色調：褐色で不透明 ■　表面：円滑で光沢あり （ｄ）　　ガス：産生せず （ｅ）１５°Ｃで発育せず （ハ　運動性なし Ｃｑ）　　好気的条件で発育せず （ｈ）ブドウ糖からの主発酵生成物：乳酸および酢酸 （ｚ）　　糖からの酸生成： アラビノース、キシロース、グルコース、フラクト−ス
   、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクト
   ース、メリビオースｉよびメレチトースは陽性、 ラムノース、リボース、七ロビオース、トレハロース、
   グリコーゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール
   、イノシトール、ヱスクリン、サリシン、アミグダリン
   およびグルコン酸塩は陰性、 ラフィノースおよびデキストリンは遅れて陽性、マンノ
   ース、スターチおよびα−メチルグルコシドは遅れて弱
   陽性、 （ｊ）　　インドール：産生せず、 （／（、）　　硫化水素：産生ぜず、 （１）　　硝酸塩を還元せず、 ６→　カタラーゼ：陰性、 （ｎ、）ペニシリンを含むＭＧ寒天平板培地（ペニシリ
   ンＧカリウム：Ｑ、５〜１．０単位／−１）で発育する
   。 （６）菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、ｐｌｌを４．６
   に調整して、５°Ｃで７日間保持した時、少くとも１％
   の生残率を有する耐酸性を示すビフィドバクテリウム・
   ロンガムを生育培地に培養して、菌体を増殖させること
   を特徴とする前記ビフィドバクテリウム・ロンカムの製
   造方法。 （力　前記のヒフイドバクテリウム・ロンカムかに記載
   の方法。 （８）菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、ｐｌｌを４６に
   調整して、５°Ｃで７　Ｅ１間保持した時、少くとも１
   ％の生残率を有する耐酸性を示すビフィドバクテリウム
   ・ロンガムの生菌菌体を含有することを特徴とする組成
   物。 （９）前記のビフィドバクテリウム・ロンガムがビフィ
   ドバクテリウム・ロンガムＭ−８２０１（１０）前記の
   組成物が食品としての用途を有することを特徴とする特
   許請求の範囲第８項または第９項に記載の組成物。 （１１）前記の組成物が飼料としての用途を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第８項または第９項に記載
   の組成物。 （１２）前記の組成物が整腸剤としての用途を有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第８項または第９項に記
   載の組成物。