JP2008074768A - 宿主特異的プロバイオティクス製品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生まれたときから腸内に棲みついている固有ビフィズス菌株が、外来のビフィズス菌株に比べて宿主内での菌の定着および増殖能が明らかに優れていることから、宿主由来のビフィズス菌株を増殖させ、用いることにより、宿主特異的な定着および増殖能が優れているプロバイオティクス製品を提供する。
Description
1.宿主の消化管から分離された非病原性の微生物を有効成分として含有する、宿主特異的プロバイオティクス製品。
2.分離された非病原性の微生物が、ビフィズス菌である前項1に記載の宿主特異的プロバイオティクス製品。
3.宿主に提供されることを目的として製造される前項1又は2に記載の宿主特異的プロバイオティクス製品。
4.以下の工程を含む、前項2又は3に記載のプロバイオティクス製品の製造方法:
1)宿主の消化管から検体を取得する工程;
2)検体から選択培地を用いてビフィズス菌株を分離する工程;
3)分離したビフィズス菌株が、宿主固有の菌株であることを確認する工程;
4)分離したビフィズス菌株を保存する工程。
5.前記分離したビフィズス菌株が宿主固有の菌株であることを確認する工程が、DNAフィンガープリンティング法又は血清型別法による前項4に記載の宿主特異的プロバイオティクス製品。
6.前記分離したビフィズス菌株を保存する工程4)の後に、さらに以下の工程を含む、前項4又は5に記載の製造方法:
5)分離して保存したビフィズス菌株を、さらに選択培地を用いて培養し、コロニーを単離する工程;
6)単離したコロニーから、培地を用いてビフィズス菌株を増殖させる工程;
7)増殖したビフィズス菌株を凍結乾燥する工程;
8)凍結乾燥したビフィズス菌株を製品加工する工程。
7.宿主の消化管から分離されたビフィズス菌株の情報を登録し、受注により、前記登録されたビフィズス菌株の情報に基づいて宿主特異的プロバイオティクス製品を製造する前項2〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
1)宿主の消化管から検体を取得する工程;
2)検体から選択培地を用いてビフィズス菌株を分離する工程;
3)分離したビフィズス菌株が「宿主固有菌株」であることを確認する工程:
4)宿主固有ビフィズス菌株を保存する工程。
宿主の消化管から検体を取得するとは、宿主の消化管由来の検体を取得することをいい、宿主により提供されたものであっても良い。検体とは、例えば糞便が挙げられる。
次に、上記1)で取得した検体、例えば糞便を、生理食塩液のような溶液に溶解し、希釈する。溶液にて希釈した検体溶液を、ビフィズス菌選択平板培地に塗抹する。検体中のビフィズス菌の菌数が少なく、上記の直接平板塗抹法で菌株の分離が困難な場合は、ビフィズス菌株を分離培養する前に、検体中のビフィズス菌を選択的に増殖させるための液体培地に摂取し増菌させても良い。上記選択平板培地を用いて、適当な温度条件ならびに時間で嫌気培養し、得られたコロニーを取得し、本発明のビフィズス菌を分離する。選択培地は、自体公知のものを使用することができる。具体的には、TOSプロピオン酸寒天培地(ヤクルト薬品工業株式会社製)などを使用することができる。さらに、所望のビフィズス菌株を純化するために、得られたコロニーを適当な溶液で溶解し、希釈して再度選択培地で培養し、コロニーを取得する工程を繰り返してもよい。
宿主由来のビフィズス菌株の種は、コロニーから分離した菌株のDNAを抽出・精製し、該菌種に特異的なDNAを調べることにより確認することができる。DNAの抽出は、自体公知の方法、あるいは今後開発される方法を採用することができる。例えば、市販のDNA抽出キットを用いても良い。簡便には、コロニーから得た菌株を蒸留水に懸濁し、リゾチーム、タンパク分解酵素を用いて菌の細胞壁を破砕し、DNAを抽出することができる。分離した菌株の種に特異的なDNAは、自体公知の方法により調べることができる。具体的には、例えばPCR法などにより確認することができる。PCR産物は、例えば電気泳動によって確認して種を同定することができる。
分離したビフィズス菌株のうち、宿主由来のビフィズス菌株として確認されたものを保存する。保存の方法は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、コロニーから取得した菌株を、グリセリンのような凍結保存用の溶液に懸濁し、保存用のチューブに入れ、保存することができる。菌が生存状態で保存される条件であれば良く、特に限定されないが、例えば凍結乾燥処理して保存することもできる。
5)保存したビフィズス菌株を、さらに選択培地を用いて培養し、コロニーを単離する工程;
6)単離されたコロニーから、培地を用いてビフィズス菌株を増殖させる工程;
7)増殖したビフィズス菌株を凍結乾燥する工程;
8)凍結乾燥したビフィズス菌株を製品加工する工程。
上記4)で保存したビフィズス菌株を、生理食塩液のような適当な溶液に溶解し、溶解液を選択培地、例えばビフィズス菌選択培地に塗抹する。選択培地は、上記2)の工程で示す如く、自体公知のものを使用することができる。該選択培地を用いて、適当な温度条件ならびに時間で、嫌気培養し、得られたコロニーを取得する。得られたコロニーをさらに生理食塩液などの溶液で、溶解し、希釈して再度選択培地で培養し、コロニーを取得する工程を繰り返してもよい。
上記選択培地上に単離されたコロニーに含まれるビフィズス菌株を、増殖用培地を用いて培養し、ビフィズス菌株を増殖させる。増殖用培地は、自体公知ものを使用することができる。具体的には、TOSプロピオン酸培地(ヤクルト薬品工業)などを使用することができる。培養は、適当な温度条件ならびに時間、嫌気培養することができる。
上記増殖したビフィズス菌株を集め、適当な容器にて凍結乾燥を行うことができる。該ビフィズス菌株は、適切な安定化剤や分散媒とともに凍結乾燥することができる。安定化剤・分散媒としては、スキムミルク、単糖、多糖類、などから選択して使用することができる。
上記凍結乾燥処理したビフィズス菌株を、製品加工することができる。製品加工は、経口摂取可能な形態であれば良く、特に限定されないが、例えばカプセル錠、錠剤、粉末錠などの製剤とすることができ、特に好適にはカプセル錠の形態とすることができる。
1.宿主から得た糞便検体を搬入し、登録した。
上記の糞便検体200mgを生理食塩液5mlで溶解したもの0.2mlを、ビフィズス菌増菌培養用のTOSプロピオン酸培地(ヤクルト薬品工業)5mlに播種し、37℃で24時間嫌気培養を行った。
培養後の培養液を0.02ml採取し、分離培養用のTOSプロピオン酸培地(ヤクルト薬品工業)5mlに塗抹し、37℃で48時間嫌気培養を行った。
上記選択平板培地を用いて培養後、培地上に形成された単離可能なコロニーのうち、5個を選択した。選択したコロニーの菌株は、さらにビフィズス菌選択平板培地を用いて37℃で48時間嫌気培養を行い、純化を行った。増殖した各コロニー由来の菌株の一部を蒸留水に懸濁し、電子レンジにより菌体を破砕し、DNAテンプレートを作製した。作製されたDNAテンプレートを用いて、採取した菌がビフィズス菌属であることを確認するためのPCR操作を行った。PCR操作に要する時間は、約3時間であった。
上記でビフィズス菌であると確認された菌株のDNAテンプレートを用い、PCR操作により菌種を確定した。PCR操作に要する時間は、約5時間であった。
上記作業によって同定された菌種のうち、最も増殖が優勢である種から任意に1つの菌株を選択した。選択された菌株を、2枚の平板培地に塗抹し、37℃で48時間嫌気培養を行った。培養後、平板AはDNA情報の取得のためのDNA抽出用菌苔として、平板Bは菌株保管用(菌株バンク用)凍結乾燥品作製のための種株菌苔とした。平板Aで得られた菌苔からリゾチーム融解、フェノールクロロホルム処理(18時間)し、DNAを抽出・精製した。精製DNAをテンプレートとし、PCR法によりAmplified Fragment Length Polymorphism[AFLP]-PCRを調べた。本操作に要する時間は、約6時間であった。
上記平板Bで得られた菌苔1gを、20%のスキムミルク溶液(滅菌)2mlを含む試験管に懸濁した。
上記懸濁液を0.5mlずつ計4本の凍結乾燥用アンプルに充填した。
米国ラブコンコ社製真空凍結乾燥機を用いて24時間処理後、アンプルを密封した。
得られた凍結乾燥菌株を保管庫にて保存した。保存温度は、23℃であった。
1.保存アンプルの取出し
発注者の依頼を受け、実施例1に記載の保管庫から保存種菌アンプル(1本)を取出した。保存種菌アンプルは、発注者(宿主)情報及び登録された固有系統株のプロファイリング情報に基づき選択した。
ビフィズス菌選択平板培地(抗生物質:ムピロシンを含む)に、上記取出した種菌を播種し、37℃で48時間嫌気培養により分離培養を行った。その後、前記平板培地上に形成されたコロニー1個を単離した。単離されたコロニーに含まれる菌株をさらに3枚の平板培地に塗抹し、37℃で48時間嫌気培養を行った。培養後、1枚は実施例1に記載の菌株バンク保存用に用いた。
培養後、2枚の平板上の菌株1gを、凍結乾燥用血清瓶(30ml)中の10%のスキムミルク溶液(滅菌)5mlに懸濁した。
専用凍結乾燥機(ヤマト社製フリーズドライヤDC41A)を用いて菌株を凍結乾燥した。
上記凍結乾燥により得られた菌株の乾燥粉末を、アップルペクチン純末と配合した。
配合後、カプセル内にカプセル製造機にて充填した。1日摂取量として、 1カプセル1g中にプロバイオティクスであるビフィズス菌を約20億個含むようにした。
充填を完了したカプセル表層に、腸溶性コーテイングを施した(ツェイン溶液)。
上記カプセルの内30カプセル(30日分)を1包ずつ分包紙に充填後、製品用アルミラミジップに乾燥剤とともに密閉し、包装箱に収める(残り4カプセルは自社検定用として保管する)。
自社検定用4カプセルの内、1カプセルにつき異物及び雑菌混入有無を確認した。異物有無確認試験は、目視及び実体顕微鏡の観察により行った。雑菌混入確認は、カプセル懸濁液を普通平板培地及びデキストロース寒天培地に塗抹し、37℃及び23℃ にて2日及び7日間培養した。培養後に平板上の細菌コロニー及び真菌類コロニーの形成の有無を確認して行った。
上記試験によって安全性が確認された製品を出荷する。
まずはじめに、被検菌が、Bifidobacterium属に属するものか否かを確認するためのPCRを行う。16SrDNAのBifidobacterium属の属特異的配列を標的としたプライマーを用いてPCRを行った。PCRはDNAサーマルサイクラー(日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ(株)製)を用いる。プライマーは、配列表の配列番号1および2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをセットで使用した。
forward: lm26 5'-GAT TCT GGC TCA GGA TGA ACG-3'(配列番号1)
reverse: lm3 5'-CGG GTG CTIa CCC ACT TTC ATG-3'(配列番号2)
(Ia:イノシンであり、A,G,T,C全てのヌクレオチドに適合する。)
精製水(ミリQ) 66.5μl
10×Ex Taq Buffer 10μl
dNTP mix 8μl
プライマー(各20μM) 5.0μl
鋳型DNA溶液(1.0μg/ml) 10μl
Ex Taq (TaKaRa) (2.5U/100μl) 0.5μl
計100μl
94℃で反応させ、次に94℃で30秒、61℃で30秒および72℃で1.5分を25サイクル行い、さらに72℃でしばらく置いた後、4℃に冷却した。
PCR産物は、1.8%アガロースゲルを用いて10分間電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルを臭化エチジウム溶液(1μg/ml)で10分間染色した後、蒸留水中で10分間攪拌し、残った臭化エチジウムを洗浄する。泳動後の観察は、UVトランスルミネーター(Model 2270;和研薬製)を用いて可視化して行った。
その結果を図1に示した。図1における各種Bifidobacterium属は、以下のとおりである。
レーン2:B. longum JCM 1217
レーン3:B. adolescentis JCM1275
レーン4:B. longum JCM 1210
レーン5:B. breve JCM 1192
レーン6:B. animalis JCM 1190
レーン7:L. paracasei subsp. paracasei JCM 8130
レーン8:L. johnsonii JCM 2012
レーン9:L. delbrueckii subsp. lactis JCM 1248
レーン10:L. casei subsp. casei JCM 1134
レーン11:L. rhamnosus JCM 1136
レーン12:L. paracasei subsp. tolerans JCM 1171
レーン13:L. reuteri JCM 1112
レーン14:L. delbrueckii subsp. delbrueckii JCM 1012
レーン15:L. acidophilus JCM 1132
レーン16:L. gasseri JCM 1131
レーン17:L. helveticus JCM 1120
レーン18:L. delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002
上述のPCR法によりBifidobacterium属と同定された菌株について、更にBifidobacterium属の種を同定するために、マルチプレックスPCRで行った。B. bifidumについては配列表の配列番号3および4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、B. longumについては配列表の配列番号5および6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、各々セットで使用した。
forward: BiBIF-1 5'-CCA CAT GAT CGC ATG TGA TTG-3'(配列番号3)
reverse: BiBIF-2 5'-CCG AAG GCT TGC TCC CAA A-3'(配列番号4)
forward: BiLON-1 5'-TTC CAG TTG ATG GCA TGG TC-3'(配列番号5)
reverse: BiLON-2 5'-GGG AAG CCG TAT CTC TAC GA-3'(配列番号6)
精製水(ミリQ) 70.25μl
10×Ex Taq Buffer 10μl
dNTP mix 8μl
プライマー(各20μM) 1.25μl
鋳型DNA溶液(1.0μg/ml) 10μl
Ex Taq (TaKaRa)(2.5U/100μl) 0.5μl
計100μl
94℃で5分間反応させ、次に94℃で20秒、58℃で20秒および72℃で30秒を26サイクル行い、さらに72℃で5分反応させた後、4℃に冷却した。
PCR産物は、上述と同様に行った。
その結果を図2に示した。図2における各種Bifidobacterium属は、図1と同様である。
表1に示す各検体について、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 法によりDNAパターンを調べた。RAPD−PCR法とは、通常のPCR条件とは異なる反応条件、合成プライマーの塩基配列や長さ等を任意に変えたPCRで、複数の部位から得られる増幅された多様なPCR産物となるDNAの多型を検出する方法である。
RAPD−PCR法のために以下の3種類(配列番号7〜9)のプライマーを用いPCRを行った。
Hpy1: 5'-CCGCAGCCAA-3'(配列番号7)
COC : 5'-AGCAGCGTGG-3'(配列番号8)
P2 : 5'-GGTGACGCAG-3'(配列番号9)
精製水(ミリQ) 66.5μl
10×Ex Taq Buffer 10μl
dNTP mix 8μl
プライマー(各10μM) 10μl
鋳型DNA溶液(10ng/ml) 5μl
Ex Taq (TaKaRa)(2.5U/100μl) 0.5μl
計100μl
94℃で3分間反応させ、次に94℃で1分、36℃で1分および72℃で1分を30サイクル行い、さらに72℃で5分反応させた。
PCR産物は、2.0%アガロースゲルを用いて35分間電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルを臭化エチジウム溶液(1μg/ml)で10分間染色した後、蒸留水中で10分間攪拌し、残った臭化エチジウムを洗浄する。泳動後の観察は、UVトランスルミネーター(Model 2270;和研薬製)を用いて可視化して行った。
その結果を図3に示した。これにより、成人または小児の腸から検出されたビフィズス菌と、ヨーグルト製品から検出されるビフィズス菌のDNAパターンが異なることが明らかとなった。
Claims (7)
- 宿主の消化管から分離された非病原性の微生物を有効成分として含有する、宿主特異的プロバイオティクス製品。
- 分離された非病原性の微生物が、ビフィズス菌である請求項1に記載の宿主特異的プロバイオティクス製品。
- 宿主に提供されることを目的として製造される請求項1又は2に記載の宿主特異的プロバイオティクス製品。
- 以下の工程を含む、請求項2又は3に記載のプロバイオティクス製品の製造方法:
1)宿主の消化管から検体を取得する工程;
2)検体から選択培地を用いてビフィズス菌株を分離する工程;
3)分離したビフィズス菌株が、宿主固有の菌株であることを確認する工程;
4)分離したビフィズス菌株を保存する工程。 - 前記分離したビフィズス菌株が宿主固有の菌株であることを確認する工程が、DNAフィンガープリンティング法又は血清型別法による請求項4に記載の宿主特異的プロバイオティクス製品。
- 前記分離したビフィズス菌株を保存する工程4)の後に、さらに以下の工程を含む、請求項4又は5に記載の製造方法:
5)分離して保存したビフィズス菌株を、さらに選択培地を用いて培養し、コロニーを単離する工程;
6)単離したコロニーから、培地を用いてビフィズス菌株を増殖させる工程;
7)増殖したビフィズス菌株を凍結乾燥する工程;
8)凍結乾燥したビフィズス菌株を製品加工する工程。 - 宿主の消化管から分離されたビフィズス菌株の情報を登録し、受注により、前記登録されたビフィズス菌株の情報に基づいて宿主特異的プロバイオティクス製品を製造する請求項2〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
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JP2010239874A (ja) * | 2009-04-01 | 2010-10-28 | Tokyo Univ Of Agriculture | ビタミンb12定量用の乳酸菌及び該乳酸菌を用いたビタミンb12の定量方法 |
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-
2006
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