KR101046820B1 - 비피도박테리움 속 균종의 동정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비피도박테리움 속 균종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비피도박테리움 속 균종에 특이적인 염기서열을 가지는 하나 이상의 프라이머와 비피도박테리움에 속 균종에 공통적인 염기서열을 가지는 하나 이상의 프라이머를 이용한 다중 PCR 방법을 통해 검사체 내의 비피도박테리움 속 균종을 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머는 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이 지역의 염기서열을 이용하여 각 균종에 특이적으로 제작한 것으로, 상기 프라이머를 이용하여 검사체 내에 혼재되어 있는 비피도박테리움 속 균주를 신속, 정확하게 동정할 수 있어 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균주를 이용한 건강식품 및 의약품의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비피도박테리움 속 균종의 동정방법{Method for identification of microorganism of Bifidobacterium species}
도 1은 비피도박테리움 속 균종 특이적 프라이머 및 공통적 프라이머의 설계 계획 및 균종별 예상 PCR 증폭 산물의 크기를 나타낸 그림이다.
B1F: 비피도박테리움 애돌레슨티스(B. adolescentis) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
B2F: 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
B3F: 비피도박테리움 브레브(B. breve) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
B4F: 비피도박테리움 슈도롱검(B. pseudolongum) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
B5F: 비피도박테리움 롱검(B. longum) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
B6F: 비피도박테리움 애니멀리스(B. animalis) 및 비피도박테리움 락티스(B. lactis) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
B7R: 비피도박테리움 락티스(B. lactis) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
B8R: 비피도박테리움 인팬티스(B. infantis) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
C9R: 서열번호 9로 기재되는 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움에 공통인 프라이머 부착 위치, 및
C10R: 서열번호 10으로 기재되는 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움에 공통인 프라이머 부착 위치.
도 2는 비피도박테리움 속 표준균주의 염색체 DNA를 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 조합을 사용하여 PCR을 수행한 전기영동 사진이다.
Ado: 비피도박테리움 애돌레슨티스, Ani: 비피도박테리움 애니멀리스,
Bif: 비피도박테리움 비피덤, Bre: 비피도박테리움 브레브,
Min: 비피도박테리움 미니멈, Inf: 비피도박테리움 인팬티스,
Lac: 비피도박테리움 락티스, Lon: 비피도박테리움 롱검,
Psl: 비피도박테리움 슈도롱검,
1-9(1.22 kb): 서열번호 1 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 1.22 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
6-9(0.18 kb): 서열번호 6 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.18 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
2-9(1.04 kb): 서열번호 2 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 1.04 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
3-9(0.85 kb): 서열번호 3 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.85 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
10-8(0.68 kb): 서열번호 10 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.68 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
10-7(0.38 kb): 서열번호 10 및 서열번호 7로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.38 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
5-9(0.31 kb): 서열번호 5 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.31 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과, 및
4-9(0.46 kb): 서열번호 4 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.46 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과.
도 3은 8종의 비피도박테리움 속 표준균주의 염색체 DNA 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
레인 1: 비피도박테리움 애돌레슨티스, 레인 2: 비피도박테리움 롱검,
레인 3: 비피도박테리움 애니멀리스, 레인 4: 비피도박테리움 비피덤,
레인 5: 비피도박테리움 인팬티스, 레인 6: 비피도박테리움 슈도롱검,
레인 7: 비피도박테리움 락티스, 레인 8: 비피도박테리움 브레브,
레인 9: 비피도박테리움 미니멈, 레인 M: 100bp DNA 사이즈 마커.
도 4는 8종의 비피도박테리움 속 표준균주의 세포 현탁액 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
레인 1: 비피도박테리움 애돌레슨티스, 레인 2: 비피도박테리움 애니멀리스,
레인 3: 비피도박테리움 비피덤, 레인 4: 비피도박테리움 브레브,
레인 5: 비피도박테리움 인팬티스, 레인 6: 비피도박테리움 락티스,
레인 7: 비피도박테리움 롱검, 레인 8: 비피도박테리움 슈도롱검,
레인 M: 100bp DNA 사이즈 마커.
도 5는 8종의 비피도박테리움 속 각 표준균주의 농도별 세포 현탁액 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
8: 생균수 1X108 cfu(콜로니 형성 단위), 7: 생균수 1X107 cfu,
6: 생균수 1X106 cfu, 5: 생균수 1X105 cfu,
4: 생균수 1X104 cfu, 3: 생균수 1X103 cfu,
Ado(1.22 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 1.22 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 애돌레슨티스 종특이 PCR 증폭 산물의 생산결과,
Ani(0.18 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 0.18 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 애니멀리스 종특이 PCR 증폭 산물의 생산결과,
Bif(1.04 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 1.04 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 비피덤 종특이 PCR 증폭 산물의 생산결과,
Bre(0.85 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 0.85 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 브레브 종특이 PCR 증폭 산물의 생산결과,
Inf(0.68 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 0.68 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 인팬티스 종특이 PCR 증폭 산물의 생산결과,
Lac(0.56/0.38/0.18 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 0.38 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 락티스 종특이 PCR 증폭 산물, 0.18 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 애니멀리스 종특이 PCR 증폭 산물 및 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻어지는 0.56 kb에 상응하는 크기의 특이 PCR 증폭 산물의 생산결과,
Lon(0.68/0.31 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 0.68 kb에 상응하는 크 기의 비피도박테리움 인팬티스 종특이 PCR 증폭 산물 및 0.31 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 롱검 종특이 PCR 증폭 산물의 생산결과, 및
Psl(0.46 kb): 다중 PCR 반응을 수행하여 얻은 0.46 kb에 상응하는 크기의 비피도박테리움 슈도롱검 종특이 PCR 증폭 산물의 생산결과.
도 6은 비피도박테리움 속 8종의 표준균주 콜로니의 불균등 조합된 혼합물 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
레인 1: 비피도박테리움 애돌레슨티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 슈도롱검 및 비피도박테리움 락티스,
레인 2: 비피도박테리움 인팬티스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 슈도롱검 및 비피도박테리움 락티스,
레인 3: 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 인팬티스, 비피도박테리움 슈도롱검 및 비피도박테리움 애니멀리스,
레인 4: 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레브 및 비피도박테리움 락티스,
레인 5: 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 락티스 및 비피도박테리움 애니멀리스,
레인 6: 비피도박테리움 락티스 및 비피도박테리움 애니멀리스,
레인 7: 비피도박테리움 인팬티스, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리 움 롱검 및 비피도박테리움 락티스.
도 7은 유아분변으로부터 분리한 균주들에 대하여 비피도박테리움 속특이 프라이머쌍 및 비피도박테리움 속 균종 특이적 프라이머 혼합액을 사용한 PCR을 이용하여 프로바이오틱 비피도박테리움 균주를 탐색한 결과를 나타낸 그림이다.
본 발명은 비피도박테리움 속 균종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비피도박테리움 속 균종에 특이적인 프라이머 및 비피도박테리움 속 균종에 공통적인 프라이머를 이용하여 검사체 내의 비피도박테리움 속 균주를 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다.
요구르트에서 분리된 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)의 정장효과가 인정되면서 유산균에 대한 관심이 증대하고 이에 따른 연구가 계속적으로 진행되어 왔지만, 국내에서의 유산균 관련 연구는 아직까지 미미한 상태이다. 오래전부터 유럽의 여러 국가에서 유제품 및 치즈 등으로부터 다양한 유산균주가 분리되었으며, 일본에서 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 개발된 이래 다양한 의약품 및 기능성 식품으로써 유산균이 많이 사용되고 있다. 최근에는 미국에서도 장 정착성 및 내산 성이 우수한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG의 제품화가 성공한 이후 유산균에 대한 연구는 전 세계에서 활발하게 진행되고 있으며 성인병 예방 및 면역 증강에 의한 항암효과 등이 우수한 기능성 프로바이오틱(probiotic) 유산균의 분리와 개발에 대한 관심이 계속적으로 증폭되고 있다. 프로바이오틱 유산균은 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품, 캡슐제제 등에 사용되고 있으며 향후 프로바이오틱 유산균 개발 기술은 기술 집약형 방식으로 전개되어 이들 제품의 규모는 지속적으로 증가할 것으로 예상된다. 국내 상황도 마찬가지여서 대부분의 균주를 수입에 의존하고 있는 발효유 시장만 놓고 볼 때도 2002년 현재 12,000억 원대가 될 것으로 추산되어 고기능성 프로바이오틱 유산균주를 이용한 제품의 시장성은 무한하다고 할 수 있다(McCann et al., J. Food. Pretect., 1996, 59, 41-45).
최근 유산균 중에서도 장내에 서식하는 것으로 알려진 비피더스라고 불리는 비피도박테리움(Bifidobacterium)에 대한 새로운 인식과 중요성이 대두되고 있다. 비피도박테리움은 모유영양아의 장관뿐만 아니라 건강한 성인의 장내 균총에서도 우점 종으로써 분변 미생물중 약 25%를 점유한다. 비피도박테리움은 혐기성균으로 그람 양성의 무포아성의 간균이고, 특유의 V자 혹은 Y자의 형태를 나타내며 생균 적온은 36~38??이다. 이들 균은 3:2의 비율로 acetic acid와 lactic acid를 생성하는 hetero-fermentation을 행하며, 당대사과정에서 gas의 생성이 없는 특징을 지닌다. 특히 다른 유산균들과 달리 인체 내에서 쉽게 흡수되는 L(+)-lactic acid 만을 특이적으로 생성함으로써 유아 산독증 등을 유발시키지 않는다. 또한 비피도 박테리움 균은 체내로 섭취되어 소화관을 통과하는 도중에 장관 내에 정착함으로써 기존에 서식하고 있는 다양한 장내 세균 균총에 상호 영향을 주게 되어 사람의 영양, 노화, 발암, 면역기능, 장관 감염 및 약물효과 등의 효과뿐만 아니라(Mitsuoka, J. Ind. Microbiol., 1990, 6, 263), 장내 부패 세균의 증식을 억제하고 단백질의 분해나 다른 유해세균에 의해 생성되는 nitrosoamine 등의 독성물질을 무독화 시키며 비타민류의 합성, phospatase의 작용에 의한 유당 및 단백질의 소화 증진, Ca의 체내 흡수 촉진, 혈중 cholesterol의 감소효과와 항암작용 등 많은 유익한 작용을 하는 것으로 알려져 비피도박테리움 균의 건강 기대효과가 각광을 받게 되었다(강국희, 1990, 성균관대학교 출판부). 따라서 현재 비피도박테리움을 이용한 yogurt, cheese 등의 유제품 및 생균제제의 시장규모가 급속도로 확대되고 있는 추세이다. 우리나라의 경우에도 비피도박테리움을 포함하는 기능성식품, 건강보조제 혹은 정장제 등이 발매되고 있으며 인공영아의 장내 균총 정상화를 위한 분유 첨가물, 가금류 등 양식용 사료에 첨가하는 생균제제로서 그 이용가치가 높게 평가되고 있다 (Rasic et al., 1983, Ed. Birkahauser).
지금까지 알려진 비피도박테리움에 속하는 균종은 30 여종으로, 이들 중 프로바이오틱 균주로써 상용화되고 있는 균종은 대부분 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 인팬티스(B. infantis) 등에 속하며 최근 비피도박테리움 락티스(B. lactis)가 새로운 균종으로 각광 받고 있다. 또한 비피도박테리움 아돌레슨티스(B. adolescentis)는 그 유래가 인간이라는 점에서, 그리고 비피도박 테리움 애니멀리스(B. animalis)와 비피도박테리움 슈도롱검(B. pseudolongum)은 인간 유래종은 아니지만 각각 비피도박테리움 락티스와 비피도박테리움 롱검과 유사 균종에 속하여 동물용 제제 등에 활용이 가능하다.
이러한 비피도박테리움 균종들은 산업적으로 그 중요성에도 불구하고 아직까지 확립된 동정 방법이 없으며, 따라서 산업적으로 사용되는 비피도박테리움의 분류 및 동정도 불명확한 경우가 많다. 현재까지 비피도박테리움 균주의 분류와 동정에 사용되어온 방법은 현미경적 소견 이외에 주로 당 발효 능력 유무를 확인하는 정도이다. 이러한 방법은 많은 불확실한 결과를 가져왔으며 또한 충분한 양의 균체를 확보해야 하고 시간도 많이 소요되는 단점이 있으므로, 보다 정확하고 신속하며 편리한 방법이 요구되었다. 상기와 같은 문제점을 보완하기 위해 최근 들어 여러 균주의 종 동정에 있어서 분자생물학적 동정 및 특성 분석법을 이용하기 시작하였으며(Tenover et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33(9), 2233-2239, 1995), 최근에는 PCR 및 다양한 전기영동방법 등이 보고 되고 있다(Walter et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67(6), 2578-2585). 이 중 현재 많이 연구되고 있는 것은 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA) 분석법으로, 상기 방법은 10개 내외의 염기서열로 구성된 임의의 프라이머(random primer)를 사용한 일종의 유전자지문분석(fingerprinting) 기법이다(Cusick et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 66(5), 2227-2231). RAPD를 이용해서 얻은 유전자 지문형(fingerprint pattern)은 게놈 유전자(genomic DNA)에 따라 고유하게 나타남으로써 미생물의 분리, 동정 및 특성 분석이 가능하다(Kaufman et al., Appl. Environ. Microbiol., 1997, 65(4), 1268-1273). 그러나 아직까지는 PCR 조건에 따른 재현성 문제와 속, 종 및 그 이하의 균주 간 비교를 위해 적합한 프라이머의 확립이 부족하여 이에 대한 연구가 진행 중이다(Wang et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62(4), 1241-1247). 최근에는 종특이 프라이머를 이용한 PCR 기법(species specific PCR, 이하 "SS-PCR"이라 약칭함)을 사용하고 있는데, 상기 방법은 게놈 유전자의 특정 부위가 종간 염기서열에 있어서 차이가 있다는 점을 이용하여 종특이적인 프라이머를 사용한 유전자 증폭을 통하여 특정 종에서만 특이적인 PCR 산물을 생산하게 하는 원리이다(Matsuki et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65(10), 4506-4512). SS-PCR의 주요 대상 유전자로 많이 연구된 것은 16S, 23S rRNA 및 16S-23S rRNA 사이 지역(ISR, InterSpacial Region)으로 이들에 관한 염기서열 정보는 다양한 웹기반의 데이타베이스들에 공개되어 있다(Naimi et al., Microbiol., 1997, 143(6), 823-834). 이들 염기서열 내의 변이 지역을 프라이머 대상 부위로 이용하여 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus)를 포함한 유산균 속내의 종 분류가 가능함이 다수 보고 되었다(Angeletti et al., J. Clin. Microbiol., 2001, 39(2), 794-797; Walter et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(1), 297-303). 또한, 장내환경 등 여러 균주가 혼재된 상태에서 원하는 종들의 SS-PCR 프라이머를 혼합하여 사용함으로써 원하는 균주들의 존재 유무를 신속, 정확하게 확인하거나 균주들을 분류, 동정하는 다중 PCR(multiplex PCR) 기법들도 최근 많이 보고되고 있다(Lee, et al., FEMS Microbiol. Letters., 2000, 193, 243-47).
이러한 PCR 방법들은 비피도박테리움의 속 분류 및 종 동정에도 도입되었으며(Mautsuki et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68(11), 5445-5451; Mautsuki et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65(10), 4506-4512), 최근에는 다중 PCR 방법을 통한 3-4종의 동정이 가능함이 보고 되었다(Mullie, et al., FEMS Microbiol. Letters., 2003, 222, 129-136). 그러나 현재까지 알려진 16S rRNA와 23S rRNA 등을 기반으로 하는 다양한 다중 PCR 방법을 사용하여도 16S rRNA에서의 종특이적 변이 지역의 제한성 및 23S rRNA 지역에 관한 정보의 부족과 염기서열 길이의 한계 등으로 단일 PCR 반응을 통한 다수의 비피도박테리움 종의 분류 및 동정은 불가능한 실정이다(Song, et al., FEMS Microbiol. Letters., 2000, 187, 167-173).
이에, 본 발명자들은 종특이적 프라이머를 이용한 PCR 기법을 사용하여 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균주를 정확하고 간편하게 동정하기 위해 연구하던 중, 다양한 균종의 염기서열 데이터를 바탕으로 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역을 포함하는 염기서열들을 사용하여 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균종 공통적 서열 및 균종 특이적 서열을 확보하였으며 이를 이용하여 180bp에서 1220bp에 이르는 다양한 크기의 PCR 산물이 생성될 수 있도록 다중 PCR 프라이머 세트를 제작하였다. 이 프라이머 세트를 사용할 경우 단일 PCR 반응을 통하여 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균종을 간편하고 정확하게 동정할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 PCR 방법을 통해 검사체 내의 비피도박테리움 속 균종을 검출하고 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 PCR 방법을 통해 검사체 내의 비피도박테리움 속 균종을 검출하고 동정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공한다.
본 발명의 프라이머는 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역 유전자를 이용하여 제작한 것으로, 상기 유전자의 특정 부분의 염기 서열 또는 이것과 상보적인 염기 서열이다. 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 속 균종 특이적인 프라이머이며, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 속 균종에 공통적인 프라이머이다.
서열번호 1로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 애돌레슨티스(B. adolescentis) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 정방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 애돌레슨티스 속 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:13160574, 13160575 및 173865 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 2로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 정방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 비피덤 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:244838, 808105 및 808106 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 3으로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 브레브(B. breve) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 정방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 브레브 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:13276117, 173867, 19774205, 19774206, 19774207, 19774208, 19774209, 27549489, 27549490, 30349720, 4730882, 498796 및 499053 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 4로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 슈도롱검(B. pseudolongum) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 정방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 슈도롱검 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:173872, 173878, 27818752, 27818753, 27818756, 4730872 및 4730869 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 5로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 롱검(B. longum) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 정방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 롱검 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:13276118, 173875, 173879, 25247101 및 498637 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 6로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 애니멀리스(B. animalis) 및 비피도박테리움 락티스(B. lactis) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 정방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 애니멀리스 및 비피도박테리움 락티스 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:15823597, 15823598, 15823599, 287930, 4730860 및 6683664 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 7로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 락티스(B. lactis) 균종의 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열에 해당하는 역방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 락티스 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열(GI:1429247, 28274766, 497262 및 558496 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 8로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 인팬티스(B. infantis) 및 비피도박테리움 롱검(B. longum)균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 역방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비피도박테리움 인팬티스 및 비피도박테리움 롱검 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:1302621, 143920, 6572113, 6572114, 799165, 799167 및 799170 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 9로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 역방향의 프라이머로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 기재한 8종의 프로바이오틱(probiotic) 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 제조하였다.
서열번호 10으로 기재되는 프라이머는 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 정방향의 프라이며로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 기재한 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 제조하였다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 비피도박테리움 속 균종 특이적 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 비피도박테리움 속 균종 공통적 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 다중 PCR(multiplex PCR) 방법을 통해 비피도박테리움 속 균종을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 비피도박테리움 속 균종을 동정하는 방법은
1) 검사체 및 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 비피도박테리움 속 균종 특이적 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 비피도박테리움 속 균종 공통적 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용하여 다중 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
2) 단계 1을 통한 PCR 산물의 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1에 있어서, 검사체는 비피도박테리움 속 균주를 포함하고 있는 시료의 일부를 직접 검사체로 사용할 수도 있으며, 적당한 배지에 배양하여 수득된 콜로니 자체를 사용하거나 콜로니로부터 분리된 염색체 DNA를 사용할 수 있다. 시료는 비피도박테리움 속 균주를 함유하는 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품 및 캡슐제제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 염색체 DNA는 공지의 DNA 추출법에 의해 콜로니로부터 분리될 수 있으며, PCR 반응의 주형으로 사용할 때에는 약 0.01 ㎍ 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, PCR 반응 주형으로 사용하기 위해서 균주의 콜로니는 1X105 cfu 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하며 (도 5 참조), 시료를 직접 검사체로 사용할 경우 상기와 동일한 콜로니 이상을 포함하도 록 적절하게 희석한 현탁액으로부터 간단한 처리를 통해 얻은 균체를 사용할 수도 있다. 또한, 검사체로 사용하는 균주의 염색체 DNA 또는 균주의 콜로니는 단독으로 사용하거나 이들의 혼합으로 사용할 수 있다. PCR 반응은 통상적인 방법에 따라 실시한다.
상기 단계 2에 있어서, PCR 산물의 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 측정하는 것은 통상적인 방법, 예를 들어 젤 전기영동법을 통해 수행할 수 있다. 본 발명에서 제조한 프라이머는 비피도박테리움 속 균종마다 각각 다른 크기의 PCR 증폭산물을 형성하도록 제조된 것이기 때문에 PCR 반응을 통해 증폭된 산물의 크기를 비교하면 검사체 내에 포함되어 있는 다양한 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균주를 동시에 동정할 수 있다.
즉, 서열번호 1 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 비피도박테리움 애돌레슨티스, 서열번호 2 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 비피도박테리움 비피덤, 서열번호 3 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 비피도박테리움 브레브, 서열번호 4 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머쌍을 이용하여 비피도박테리움 슈도롱검, 서열번호 5 및 서열번호 9 또는 서열번호 8 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 비피도박테리움 롱검, 서열번호 6 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 비피도박테리움 애니멀리스, 서열번호 6 및 서열번호 9 또는 서열번호 7 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 비피도박테리움 락티스, 그리고 서열번호 8 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 비피도박테리움 인팬티스를 동정할 수 있다. 또한, 상기 각 균주에 해당하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하는 다중 PCR(multiplex PCR) 반응을 수행함으로써 비피도박테리움 애돌레슨티스, 비피도박테리움 애니멀리스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 인팬티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 롱검 및 비피도박테리움 슈도롱검으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균종을 동시에 동정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 단일한 종의 비피도박테리움 속 균주 염색체 DNA 혹은 세포 현탁액과 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 각 균주 특이적으로 증폭된 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었다(도 3 및 도 4 참조). 또한, 여러 종의 균주가 혼합된 비피도박테리움 세포 혼합 현탁액과 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 균주가 혼합되어 있어도 각 균종 특이적으로 증폭된 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었다(도 6 참조).
본 발명의 비피도박테리움 속 균종의 동정방법은 여러 종류의 비피도박테리움이 혼재되어 있더라도 단일 PCR 반응을 통해 종의 분포 및 동정을 신속하고 정확하게 수행할 수 있어 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균종을 이용한 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강 보조식품, 정장약품 및 캡슐제제의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 비피도박테리움 속 균종 탐지용 프라이머의 제조
비피도박테리움 속 균종을 탐지하기 위한 PCR 방법을 수행하는데 사용되는 프라이머를 작성하기 위해 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 및 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역 유전자에 대한 대량의 서열정보를 이용하여 녹는점(Tm) 값이 50??를 넘도록 길이를 조절하고 헤어핀(haipin)구조나 다이머(self-dimer)가 생성되지 않는 범위로 각 종에 따른 특이적인 염기서열 및 공통 염기서열을 탐색하여 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, 비피도박테리움 애돌레슨티스(B. adolescentis) 16S rRNA 유전자의 염기 서열(GI:13160574, 13160575 및 173865 등)을 이용하여 서열번호 1로 기재되는 프라이머를 제작하고, 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum) 16S rRNA 유전자의 염기서열(GI:244838, 808105 및 808106 등)을 이용하여 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 제작하였다. 비피도박테리움 브레브(B. breve) 16S rRNA 유전자의 염기서열(각각 GI:13276117, 173867, 19774205, 19774206, 19774207, 19774208, 19774209, 27549489, 27549490, 30349720, 4730882, 498796 및 499053 등)을 이용하여 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 제조하였다. 비피도박테리움 슈도롱검(B. pseudolongum) 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:173872, 173878, 27818752, 27818753, 27818756, 4730872 및 4730869 등)을 이용하여 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 제작하고, 비피도박테리움 롱검(B. longum) 16S rRNA 유전자의 염기서열(GI:13276118, 173875, 173879, 25247101 및 498637 등)을 이용하여 서열번호 5로 기재되는 프라이머를 제작하였다. 비피도박테리움 애니멀리스(B. animalis) 및 비피도박테리움 락티스(B. lactis) 16S rRNA 유전자의 염기서열(GI:15823597, 15823598, 15823599, 287930, 4730860 및 6683664 등)을 이용하여 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를, 비피도박테리움 락티스(B. lactis) 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역 유전자의 염기서열(GI:1429247, 28274766, 497262 및 558496 등)을 이용하여 서열번호 7로 기재되는 프라이머를 제작하였고, 비피도박테리움 인팬티스(B. infantis) 및 비피도박테리움 롱검(B. longum) 23S rRNA 유전자의 염기서열(GI:1302621, 143920, 6572113, 6572114, 799165, 799167 및 799170 등)을 이용하여 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 제작하였다.
또한, 상기에서 제작한 종특이적인 프라이머와 함께 PCR을 수행하기 위한 나머지 프라이머로 상기 8가지 종의 염기서열에 존재하는 공통적인 서열을 탐지하는 비피도박테리움 속 균종 공통적 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 프라이머와 쌍으로 PCR 반응을 하기 위한 역방향의 프라이머로 상기에 기재한 8종의 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 제작하였고, 정방향의 프라이머로 상기 8종의 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제작하였다.
상기에서 제조한 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머가 부착되는 위치 및 PCR 증폭 시 예상되는 증폭 산물의 크기를 도 1에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이 비피도박테리움 락티스(0.38 kb)는 비피도박테리움 롱검(0.31 kb) 및 비피도박테리움 슈도롱검(0.46kb)과 증폭되는 산물의 크기가 비슷하기 때문에 이를 구분하기 위해 비피도박테리움 락티스를 증폭할 수 있는 또 다른 프라이머로 비피도박테리움 애니멀리스를 증폭하는 프라이머와 동일한 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 제작하였고, 비피도박테리움 롱검을 증폭할 수 있는 또 다른 프라이머로 비피도박테리움 인팬티스를 증폭하는 프라이머와 동일한 서열번호 7로 기재되는 프라이머를 제작하였다.
<실시예 2> 비피도박테리움 속 균종 탐지용 프라이머를 이용한 비피도박테리움 속 표준균주의 탐지
종특이 및 종공통 프라이머를 이용한 PCR 증폭산물이 종별 특이성을 가지는지 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 각각의 종특이 프라이머 및 종공통 프라이머 쌍을 이용하여 8종의 비피도박테리움 표준균주의 염색체로부터 얻어진 DNA를 주형으로 한 종특이 중합효소 연쇄반응(species-specific PCR, SS-PCR) 분석을 실시하였다. 구체적으로, 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균종의 표준균주인 비피도박테리움 애돌레슨티스 ATCC 15703, 비피도박테리움 애니멀리스 ATCC 25527, 비피도박테리움 비피덤 ATCC 29521, 비피도박테리움 브레브 ATCC 15700, 비피도박테리움 인팬티스 ATCC 15698, 비피도박테리움 락티스 DSM 10140, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707, 비피도박테리움 슈도롱검 ATCC 25526 및 비피도박테리움 미니멈 ATCC 27538 등 총 9균주로부터 염색체 DNA를 분리하였다(Varmanen et al., Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, 1831-1836). 상기에서 분리한 각 균주의 염색체 DNA 0.2 ㎍과 종특이 및 종공통 프라이머를 각각 125 p㏖ 혼합하여 PCR 반응액을 제조하였다. 각 반응액은 96??에서 5분간 가열하여 이중 가닥의 염색체 DNA를 풀고, 63??에서 1분간 단일 가닥의 DNA와 프라이머를 결합시킨 후 72??에서 2분간 중합반응을 시키는 1차 반응 후, 94??에서 30초, 63??에서 20초, 72??에서 40초로 중합반응을 총 35회 수행한 뒤 마지막으로 72??에서 7분간 최종 연장시키는 순서로 PCR 반응을 진행하였다. 상기 반응은 각 균주를 증폭하기 위한 프라이머 쌍 이외에도 나머지 균주를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로도 동일하게 PCR 반응을 수행하여 각 균주 특이적으로 PCR 증폭 산물이 나오는지를 확인하고자 하였다. 최종 생성된 PCR 반응물 20 ㎕를 취하여 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색하여 증폭된 PCR 산물의 밴드 양상을 관찰하였다. 상기에서 비피도박테리움 종을 구별하기 위해 사용한 PCR 프라이머쌍 및 반응 후 수득된 PCR 산물의 크기는 표 1에 나타내었으며 실제 9종의 표준균주에 대하여 8종 각 균종 특이 단일 프라이머 쌍을 이용한 PCR 결과는 도 2와 같다.
그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 상기 도 1에 기재된 반응 후 수득될 PCR 산물의 크기와 동일하게 각 균주의 DNA로부터 증폭된 PCR 산물을 얻을 수 있었으며(표 1) 다른 균종 특이적 프라이머를 사용한 PCR에서는 증폭된 PCR 산물을 얻을 수 없어(도 2), 본 발명에서 제조한 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기 재되는 비피도박테리움 속 균종 특이적 프라이머 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 비피도박테리움 속 균종 공통적 프라이머가 프로바이오틱 비피도박테리움 균종을 탐색하는데 유용한 프라이머임을 알 수 있었다.
검출 미생물 프라이머 증폭산물의 크기
(kb)
정방향 역방향
비피도박테리움 애돌레슨티스 서열번호 1 서열번호 9 1.22
비피도박테리움 애니멀리스 서열번호 6 서열번호 9 0.18
비피도박테리움 비피덤 서열번호 2 서열번호 9 1.04
비피도박테리움 브레브 서열번호 3 서열번호 9 0.85
비피도박테리움 인팬티스 서열번호 10 서열번호 8 0.68
비피도박테리움 락티스 서열번호 6 서열번호 9 0.18
서열번호 10 서열번호 7 0.38
비피도박테리움 롱검 서열번호 5 서열번호 9 0.31
서열번호 10 서열번호 8 0.65
비피도박테리움 슈도롱검 서열번호 4 서열번호 9 0.46

<실시예 3> 프라이머 혼합액을 이용한 비피도박테리움 속 표준균주의 탐지
프로바이오틱 비피도박테리움 속 균주의 동정을 신속하고 효율적으로 수행하기 위하여 단일 균주에 대해 본 발명의 서열번호 1 내지는 서열번호 10으로 기재되는 프라이머들을 모두 일정한 비율로 혼합하여 PCR 반응을 수행하는 다중 PCR(Multiplex PCR) 방법을 수행하였다. 본 발명에서 다중 PCR이라 함은 단일 혹은 다수의 균주에 대해 다종의 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 것을 뜻한다. PCR 방법은 상기 실시예 2에서 수행한 것과 동일하며, PCR을 수행하기 위한 프라이머는 한 균주의 염색체 DNA에 대해 모든 균주를 탐색하기 위한 프라이머(표 1)를 동일한 비율로 혼합하여 다중 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 다중 PCR을 수행한 후의 PCR 산물은 도 1에 기재된 예상 PCR 산물 크기와 동일하였다(도 3). 상기 결과로부터 본 발명에서 제작한 종특이 다중 프라이머 혼합액을 사용한 PCR 반응은 프로바이오틱 비피도박테리움 표준균주 모두에 대해 종특이 PCR 증폭산물을 특이적으로 생산하므로, 본 발명의 종특이 프라이머는 종특이 다중 PCR 수행에 있어 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4> 균주의 세포 현탁액으로부터 비피도박테리움 속 균주의 탐지
다중 PCR 방법을 이용하여 비피도박테리움 속 균종을 간편하게 검색하기 위해서는 균주의 염색체 DNA를 추출하는 것이 번거롭기 때문에 배양한 균주의 콜로니(bacterial colony)로부터 직접 PCR 반응이 가능하여야 한다. 이를 확인하기 위해 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움 속 표준균주의 콜로니를 각각 멸균수에 혼탁 시킨 현탁액을 PCR 반응을 위한 검사체로 사용하고, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머의 혼합액을 이용하여 다중 PCR을 수행하였다.
그 결과, 각 균주의 콜로니를 멸균수에 혼합한 현탁액(탁도가 600nm 파장에서 1.0) 1 ㎕를 주형으로 한 PCR 산물은 각 균주에서 분리한 0.15 ㎍의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물의 결과와 거의 동일하게 나왔으며, 단일 균주의 콜로니를 사용한 PCR에서는 8종의 표준균주 모두 1X105 cfu 이상의 농도에서 각 종별 특이밴 드를 생산해 내었다(도 5). 결과적으로 600 nm 파장에서 0.8-1.0의 탁도인 균주의 현탁액을 PCR 반응의 총 부피에 대해 1/10로 사용하였을 경우에 8종 표준균주 모두에서 도 4와 동일한 증폭산물을 생산함을 알 수 있었다.
<실시예 5> 혼합 균주 콜로니로부터 다중 PCR을 이용한 비피도박테리움 속 균주의 탐지
상기 실시예 4에서 균주의 콜로니를 PCR 반응의 주형으로 사용하여도 염색체 DNA를 주형으로 한 다중 PCR과 동일한 결과를 보임을 확인하였기 때문에, 균주의 콜로니를 PCR 반응의 검사체로 사용할 때에 균주의 콜로니를 혼합하여 다중 PCR을 수행하여도 균주 특이적으로 PCR 증폭되는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움 표준균주들의 콜로니들을 2, 3, 4종 또는 6종까지 불균등한 비율로 혼탁 시킨 세포 현탁액(OD600nm=1.0)을 PCR 반응의 주형으로 하여 전체 PCR 반응액의 1/10로 첨가한 후 다중 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 상기 실시예 2에서 기재된 바와 동일하게 수행하였다.
그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 여러 종류의 비피도박테리움 균주가 혼합되어 있어도 도 1에 기재된 예상 PCR 증폭 산물과 동일하게 각 종별 특이 밴드를 재현성 있게 증폭함을 알 수 있었다(도 6). 따라서 본 발명의 프라이머들은 균주를 혼합하여 수행하는 다중 PCR 방법에도 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6> 다중 PCR을 이용한 비피도박테리움 균종 동정의 정확도 검사
상기 실시예 1 내지 실시예 5를 통해 다중 프라이머를 이용한 PCR 반응을 이용하여 8종의 비피도박테리움 표준균주들을 모두 정확하게 특이적으로 탐지하는 것이 가능함을 확인하였다. 다음으로 이러한 다중 PCR을 통해 증폭된 PCR 산물이 실제 탐색하고자 하는 균종의 염색체 DNA를 증폭한 것인지 확인함으로써 균주 동정의 정확도를 검사하고자하였다. 구체적으로, KCTC(Korean collection for type cultures)로부터 분양받은 비피도박테리움 속의 여러 종에 속하는 총 41개의 분양주(표 2)의 콜로니들로부터 제조한 각 세포 현탁액에 대하여 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재된 프라이머의 혼합액을 이용한 다중 PCR을 실시하여 비피도박테리움 속 균종 동정의 정확도를 측정하였다.
다중 PCR에 의한 균주 동정 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 비피도박테리움 애돌레슨티스 ATCC 15705, 비피도박테리움 애돌레슨티스 DSM 20087, 비피도박테리움 애니멀리스 ATCC 27536, 비피도박테리움 애니멀리스 ATCC 27673, 비피도박테리움 인팬티스 ATCC 25962 및 비피도박테리움 써이스 대표균주(B. suis ATCC 27533)의 6 균주에서 분양균주명과 다른 결과를 보여 평균 85.4%의 정확도를 보였다. 그러나 상기의 6주 중 비피도박테리움 애니멀리스 2주 (ATCC 27536, ATCC 27673)는 최근 연구에서 16S 및 23S rRNA 유전자를 이용한 분자생물학적 동정결과 비피도박테리움 락티스로 판정되었으며(Bentura et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68(12), 707-712), 비피도박테리움 써이스는 현 분류체계에서 비피도박테리움 롱검 변이종(B. longum biovar. suis)으로 개편되었고 16S rRNA 유전자(GI: 173875)를 이용한 블라스트2(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq) 유사도 검사결과도 4주의 B. longum의 유전자들(GI: 25247101, 13276118, 498637, 173875)과 평균 97%의 동일성을 나타내어 유전계통학상 동일종으로 판단할 수 있었다. 따라서 상기 3주의 동정 결과 오류 문제를 배제다면 본 발명의 다중 PCR 방법에 의한 비피도박테리움 종 동정의 정확도는 92.7% (38/41)에 이르게 된다. PCR 동정 결과가 차이를 보이는 나머지 3주 역시 표시 균주명이 비교적 오래된 동정법 및 동정기준을 이용함에서 야기되는 것으로 사료된다. 이에 반하여 다중 PCR 방법은 8종의 비피도박테리움 종들 간 정확한 유전자의 차이에 근거한 방법으로써 비교적 높은 유사도를 보이는 비피도박테리움 인팬티스와 비피도박테리움 롱검 및 비피도박테리움 슈도롱검, 그리고 비피도박테리움 락티스와 비피도박테리움 애니멀리스 및 비피도박테리움 애돌레슨티스 등의 유사균주 내역뿐만 아니라 균주의 배양상태 및 사멸 여부에 상관없이 항상 동일한 결과를 나타내는 동정 방법이므로 이 방법을 사용할 경우 기존의 동정법보다 휠씬 신속하고 정확하며 재현성 있는 결과를 제공함을 알 수 있었다.
비피도박테리움 분양주에 대한 다중 PCR 동정 결과
분양 균주 명 PCR 결과 분리원
종
(species)		 아종
(subspecies)		 균주*
(strain)		 동정 결과*
B. adolesentis ATCC 15703T B. adolescentis Intestine of adult
B. adolesentis ATCC 15707 - Intestine of adult
B. adolesentis DSM 20087 - Bovine rumen
B. angulatum ATCC 27535T - Human feces
B. angulatum ATCC 27670 - Sewage
B. animalis ATCC 27536 B. lactis Chcken feces
B. animalis ATCC 25527T B. animalis Rat feces
B. animalis ATCC 27672 B. animalis Rat feces
B. animalis ATCC 27673 B. lactis Sewage
B. bifidum ATCC 29521T B. bifidum Stool of infant
B. bifidum ATCC15696 B. bifidum Intestine of infant
B. bifidum DSM 20082 B. bifidum Adult intestine
B. bifidum NCDO 1452 B. bifidum Nursing stools
B. boum ATCC 27917T - Rumen of cattle
B. breve ATCC 15700T B. breve Intestine of infant
B. breve ATCC 15701 B. breve Intestine of infant
B. breve ATCC 15698 B. breve Intestine of infant
B. catenulatum ATCC 27539T - Human feces
B. catenulatum ATCC 27675 - Human feces
B. catenulatum ATCC 27677 - Sewage
B. choerinum ATCC 27686T - Piglet feces
B. dentium ATCC 27534T - Dental caries
B. dentium ATCC 27679 - Human vagina
B. dentium ATCC 15424 - Ural fluid of adult
B. infantis ATCC 25962 - Intestine of infant
B. infantis ATCC 15697T B. infantis Intestine of infant
B. infantis ATCC 15702 B. infantis Feces of infant
B. infantis ATCC 17930 B. infantis Baby feces
B. lactis DSM 10140T B. lactis Fermented milk
B. longum ATCC 15707T B. longum Intestine of adult
B. longum ATCC 15708 B. longum Intestine of infant
B. longum DSM 20097 B. longum Calf feces
B. magnum ATCC 27540T - Rabbit feces
B. minimum ATCC 27538T - Sewage
B. pseudocatenulatum ATCC27919T - Feces of infant
B. pseudocatenulatum DSM 20439 - Sewage
B. pseudolongum globosom ATCC 25865 B. pseudolongum Bovine rumen
B. pseudolongum pseudolongum ATCC 25526T B. pseudolongum Swine feces
B. pseudolongum pseudolongum DSM 20094 B. pseudolongum Chicken feces
B. subtile ATCC 27537T - Sewage
B. suis ATCC 27533T B. longum Pig feces
상기에서 T는 표준균주를 의미하고, - 는 다중 PCR 결과 PCR 증폭 산물이 없음을 의미한다.
<실시예 7> 동정된 비피도박테리움 속 균주의 확인 실험
상기 실시예 6에서 다중 PCR을 수행한 결과 어떠한 증폭 산물도 생산해 내지 않은 18개의 균주들에 대한 결과(표 2)가 PCR 진행 여부와 상관없는 결과인지 확인하기 위하여, 프로바이오틱 비피도박테리움 속에 공통적인 프라이머쌍을 사용한 PCR을 진행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 6의 41개의 비피도박테리움 속 균주들이 비피도박테리움에 속하는 지를 확인하기 위해 비피도박테리움 공통인 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 가지는 속특이 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 프라이머 및 표 2에 기재된 41개의 균주를 이용하여 상기 실시예와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 41개의 비피도박테리움 속 이외에도 다른 속인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC 6051), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei ATCC 343), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum ATCC 14917), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri ATCC 23272), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis ATCC 19433) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium ATCC 19434)를 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 상기 41개의 모든 균주에서 비피도박테리움 특이적인 PCR 증폭산물을 생산해 내었으며, 대조군인 바실러스, 락토바실러스 및 엔테로코커스 등은 PCR 증폭산물을 생산하지 않았다. 따라서 다중 PCR을 이용한 프로바이오틱 비피도박테 리움 균주 동정법은 비피도박테리움 속 균주만을 특이적으로 검출함을 알 수 있었다.
<실시예 8> 비피도박테리움 함유 균제품으로부터 비피도박테리움 균주의 동정
본 발명의 다중 PCR을 이용하여 시판되는 비피도박테리움 함유 제품으로부터 비피도박테리움 속 균주를 동정할 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 15 종류의 프로바이오틱 비피도박테리움 균주를 함유한 제품으로부터 균주를 분리한 후 이 균주에 대해 다중 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 각 분리주들은 분리원 제품을 Mitsuoka 수로 적절히 희석(105-107)한 후 단계별 희석액 1㎖을 10㎖의 BL 한천 배지와 혼합하여 분주한 후 동일 배지로 도말하고 37??에서 2일간 혐기배양 하여 콜로니들을 얻었으며(Mitsuoka et al., Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Abt. I. Orig., 1976. A234, 219-233), 분리원별로 10개체 이상의 콜로니들을 선별하고 각각의 세포 현탁액을 만들어 PCR 반응의 검사체로 사용하였다. PCR 수행 방법은 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 혼합액을 이용하여 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일하게 진행하였다. 또한 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균종 공통의 프라이머인 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 이용한 PCR을 상기 실시예 7과 같이 수행하여 이들 균주들이 비피도박테리움 속에 속하는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 15종의 균제품으로부터 분리된 15균주 중 7주 만이 8종의 비피도박테리움에 속하는 균종으로 동정되었으며, 여기에는 비피도박테리움 락티스 3주, 비피도박테리움 롱검 2주, 그리고 비피도박테리움 비피덤과 비피도박테리움 인팬티스 각각 1주씩이 포함되었다(표 3). 동정 결과가 나타나지 않은 균주에 대한 확인을 위하여 15주에 대한 비피도박테리움 속특이 PCR을 수행한 결과 미동정 균주들은 모두 비피도박테리움에 속하지 않는 것으로 나타나, 이들은 오염주 혹은 기재와 다른 균속에 속하는 균주일 것으로 판단할 수 있었다.
균제품으로부터 비피도박테리움 균주 동정 결과
비피도박테리움 함유 균제품 종특이 다중 PCR Bifidobacterium 속특이 PCR
제품명 표시 균주 명 동정 결과 Bifidobacterium 판정 결과
A Bifidobacterium sp. B. longum +
B Bifidobacterium sp. - -
C Bifidobacterium sp. - -
D Bifidobacterium sp. - -
E Bifidobacterium sp. B. lactis +
F Bifidobacterium sp. - -
G Bifidobacterium sp. - -
H Bifidobacterium sp. - -
I Bifidobacterium sp. B. infantis +
J Bifidobacterium sp. B. longum +
K Bifidobacterium sp. B. lactis +
L Bifidobacterium sp. - -
M Bifidobacterium sp. B. bifidum +
N Bifidobacterium sp. - -
O Bifidobacterium sp. B. lactis +

상기 종특이 다중 PCR의 동정결과에서 - 는 다중 PCR 결과 PCR 증폭 산물이 없음을 의미한다.
상기 Bifidobacterium 속특이 PCR의 Bifidobacterium 판정결과에서 +는 Bifidobacterium 특이 PCR 산물을 생산해 낸 것을, - 는 PCR 증폭 산물이 없음을 나타낸다.
<실시예 9> 유아분변으로부터 프로바이오틱 비피도박테리움 균주의 탐색
본 발명의 다중 PCR을 이용하여 다양한 분리원으로부터 비피도박테리움 존재 여부의 판별 및 비피도박테리움 속 균주 동정이 가능한지 확인하고자 우선적으로 분변시료로부터 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움 균주의 탐색을 진행하였다. 구체적으로, 39명의 유아로부터 얻은 분변 시료를 비피도박테리움 선별 배지에서 배양하여 얻어진 콜로니들에 대해 비피도박테리움 종특이 다중 프라이머 혼합액 및 비피도박테리움 속특이 프라이머쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. 균주의 분리는 각 유아로부터 채취한 분변 시료 1g씩을 취하여 Mitsuoka 수로 희석한 후 상기 실시예 8에 기재된 것과 동일하게 진행하였으며, 다만 비피도박테리움을 특이적으로 선별하기 위하여 TP(Transgalacto-oligosaccharide-propionate; Ji et al., Koran. J. Food. Sci., 1994, 25, 526-531) 한천 배지를 사용하였다. PCR 수행 방법은 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 혼합액 또는 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 이용하여 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 39명의 유아 분변으로부터 총 419 균주를 얻었으며, 이 중 비피도박테리움 특이 PCR 산물을 생산해 낸 균주는 총 117주로 전체 분리주의 27.9%를 차 지했다. 또한 117주의 비피도박테리움 중 16주 만이 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움에 속하는 균주로 판명되었으며, 이에는 비피도박테리움 비피덤 4주, 비피도박테리움 브레브 6주 및 비피도박테리움 롱검 6주가 포함되어 있다(도 7). 따라서 본 발명의 프라이머 혼합액을 이용한 다중 PCR 방법으로 분변시료 등의 분리원으로부터 8종의 프로바이오틱 비피도박테리움에 속하는 균주들의 간편하고 신속한 탐색이 가능함을 확인할 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 속 균종에 특이적인 프라이머를 이용한 다중 PCR 방법은 비피도박테리움 속 균종을 간편하고 신속, 정확하게 동정할 수 있으므로, 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균주를 이용한 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강 보조식품, 정장약품 및 캡슐제제의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> ILDONG PHARMACEUTICAL CO., LTD <120> Method for identification of microorganism of probiotic Bifidobacterium species <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. adolescentis-specific forward primer <400> 1 atcggctgga gcttgct 17 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. bifidum-specific forward primer <400> 2 tgaggtaacg gtcaccaagg ct 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. breve-specific forward primer <400> 3 tagggagcaa ggcactttgt gt 22 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. pseudolongum-specific forward primer <400> 4 ccctttttcc gggtcctgt 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. longum-specific forward primer <400> 5 cggtcgtaga gatacggctt 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. animalis and B. lactis-specific forward primer <400> 6 gcatgttgcc agcgggtga 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. lactis-specific reverse primer <400> 7 ccacaccaca caatccaata cg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B. infantis and B. longum-specific reverse primer <400> 8 agcaacacac accatgaagg tg 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial conserved reverse primer <400> 9 atccgaactg agaccggtt 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial conserved forward primer <400> 10 atcgcagtct gcaactcga 19 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacteria-specific forward primer <400> 11 ctcctggaaa cgggtgg 17 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacteria-specific reverse primer <400> 12 ggtgttcttc ccgatatcta ca 22

Claims (6)

  1. 서열번호 1내지 8의 비피도박테리움 속 균종 특이적 프라이머와 서열번호 9 및 10의 비피도박테리움 속 균종 공통적 프라이머로 구성된 비피도박테리움 균종 동정용 프라이머 집합체.
  2. 삭제
  3. 비피도박테리움 속 균종을 동정함에 있어서, 검사체를 주형으로 하고 제 1항의 프라이머 집합체를 이용하여 다중 PCR을 수행하여 비피도박테리움 애돌레슨티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 애니멀리스, 비피도박테리움 락티스 및 비피도박테리움 인팬티스중 하나 이상을 동시에 동정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 검사체는 프로바이오틱 비피도박테리움 속 균주를 포함하고 있는 시료로부터 배양한 균주의 콜로니 또는 균주로부터 분리한 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 동정방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
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