KR102334331B1 - 비피도박테리움 균주 검출용 실시간 pcr 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

비피도박테리움 균주 검출용 실시간 pcr 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주의 검출용 조성물, 키트, 이를 이용한 검출방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

비피도박테리움 균주 검출용 실시간 PCR 프라이머 및 이의 용도{REAL TIME PCR PRIMERS FOR DETECTION OF BIFIDOBACTERIUM SPECIES, AND USE THEREOF}
본 발명은 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주의 검출용 조성물, 키트, 이를 이용한 검출방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
비피도박테리움(Bifidobacterium)은 혐기성균으로 그람 양성의 무포아성의 간균이고, 특유의 V자 혹은 Y자의 형태를 나타내는 균주이다. 비피도박테리움은 모유영양아의 장관뿐만 건강한 성인의 장내 균총에서도 우점 종으로써 분변 미생물 중 약 25%를 점유한다. 사람의 위장관 또는 분변에는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)를 비롯한 다양한 유산균이 있으며, 종종 단일 형태나 다른 락토바실러스와 혼합된 형태로 프로바이오틱 제품에 사용된다.
프로바이오틱스는 숙주에게 건강상 이로움을 주는 살아있는 미생물로 사람에게는 면역 체계 강화, 혈액 내 콜레스테롤 감소, 장내 균총 균형화, 항암작용 등의 효능을 나타내는 것으로 보고되었다. 최근 몇 년 동안 건강에 대한 관심이 증가하면서 건강 증진에 도움이 되는 프로바이오틱 시장이 급속도로 확장되었고, 프로바이오틱 시장이 확장됨에 따라 프로바이오틱 제품의 기능성과 안정성과 관련하여 소비자들의 우려가 증가되고 있다. 따라서 소비자들에게 안전한 프로바이오틱 제품을 제공하기 위해 라벨에 표기된 유산균의 정보를 정확하게 제공하여 소비자들에게 신뢰성을 부여하는 것은 매우 중요한 일이다. 그러나 프로바이오틱 제품에 실제로 함유된 유산균은 라벨에 표시된 성분과 일치하지 않는 경우가 빈번하다고 보고되고 있다. 라벨과 일치하지 않는 균주가 함유될 경우 균주에 따른 프로바이오틱 효능의 차이로 인해 소비자에게는 잘못된 정보를 제공할 뿐만 아니라, 기업 측에서는 이로 인한 손실이 생길 수 있다.
유산균 동정 또는 프로바이오틱 제품의 미생물 군집을 확인하기 위해 기존에는 미생물의 표현형 특성을 이용한 생화학 방법이 주로 사용되었다. 그러나 이러한 방법들은 시간이 많이 소모되고 유산균들의 발효 패턴에 따라 잘못된 결과가 나타나는 등의 단점이 있었다. 이를 개선하기 위해 분자유전학 분석법이 개발되어 왔고, 가장 유용하게 사용되는 기법이 16S rRNA 유전자를 사용하는 메타지놈 시퀀싱(metagenome sequencing), PCR-DGGE, 16S rRNA 유전자 시퀀싱(gene sequencing)이다.
미생물의 16S rRNA gene은 동일한 종간의 서열이 상당히 보존되어 있어 계통 발생 연구에 유용하게 사용되는 유전자이다. 그러나 비피도박테리움의 경우 16S rRNA 유전자 서열이 매우 비슷하여 16S rRNA 유전자를 이용한 기법이나 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 이용해서는 일부 비피도박테리움을 종 수준까지 동정할 수 없다.
이에, 비피도박테리움을 종 또는 아종 수준까지 정확하게 구별하는 것은 기존의 생화학 방법, 16S rRNA 유전자를 이용한 종래의 방법으로는 어렵다는 한계점이 존재하여, 정확하게 비피도박테리움 조성의 검출 및 동정할 수 있는 기술의 개발이 요구되는 실정이다.
한국등록특허 제10-1046820호
본 발명의 목적은 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 포함하는 비피도박테리움 속 균주 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 포함하는 비피도박테리움 속 균주 검출용 바이오 칩(chip)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 대상 시료내 비피도박테리움을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 비피도박테리움 속 균주 포함 시료의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1 내지 44의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주 검출용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 쌍; 서열번호 11의 염기서열 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 제 6 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 제 7 프라이머 쌍; 서열번호 15의 염기서열 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 제 8 프라이머 쌍; 서열번호 17의 염기서열 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 제 9 프라이머 쌍; 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 제 10 프라이머 쌍; 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 제 11 프라이머 쌍; 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 제 12 프라이머 쌍; 서열번호 25의 염기서열 및 서열번호 26의 염기서열을 포함하는 제 13 프라이머 쌍; 서열번호 27의 염기서열 및 서열번호 28의 염기서열을 포함하는 제 14 프라이머 쌍; 서열번호 29의 염기서열 및 서열번호 30의 염기서열을 포함하는 제 15 프라이머 쌍; 서열번호 31의 염기서열 및 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 제 16 프라이머 쌍; 서열번호 33의 염기서열 및 서열번호 34의 염기서열을 포함하는 제 17 프라이머 쌍; 서열번호 35의 염기서열 및 서열번호 36의 염기서열을 포함하는 제 18 프라이머 쌍; 서열번호 37의 염기서열 및 서열번호 38의 염기서열을 포함하는 제 19 프라이머 쌍; 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 제 20 프라이머 쌍; 서열번호 41의 염기서열 및 서열번호 42의 염기서열을 포함하는 제 21 프라이머 쌍; 서열번호 43의 염기서열 및 서열번호 44의 염기서열을 포함하는 제 22 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 “프라이머 쌍”은 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 합쳐 동시에 지칭하는 용어이고, “프라이머 세트”는 상기 제1프라이머 쌍 내지 제22프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상으로 구성된 다수의 프라이머 쌍 묶음을 지칭하는 용어로 사용하였다.
프라이머 쌍의 설계는 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따른다. 그 외에 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.
상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 물질에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 물질의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.
상기 혼성화는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 상기 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 상기 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 제어될 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다.
상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 구체적으로는 단일쇄일 수 있으며,디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있고, 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 표적 원료에 존재하는 특정 유전자에 혼성화될 수 있으며, 시료 내에 목적하는 원료가 존재하는 경우 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 증폭되므로 상기 증폭된 산물(amplicon)을 통해 상기 원료의 존부를 판단할 수 있다.
상기 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 상기 프라이머 서열은 검출 가능한 신호를 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
상기 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
상기 비피도박테리움 속 균주 검출용 조성물은 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time Polymerase chain reaction; 실시간 PCR)으로 비피도박테리움의 종 또는 아종 수준까지 검출할 수 있다.
본 발명에서 “실시간 중합효소 연쇄반응(Real time Polymerase chain reaction; 실시간 PCR)”은 특이 프라이머와 형광물질이 연결된 프로브를 이용하여 PCR 증폭 시 프로브로부터 형광체가 해리되어 형광 발색의 양을 측정하는 원리이다. 실시간 PCR 법은 정성 PCR 법과 같이 도입 유전자의 특정 DNA를 검출하는 점은 동일하나, 식물의 내재유전자를 바탕으로 검출 유전자의 비를 측정하기 ‹š문에 정량적으로 도입 유전자의 양을 분석할 수 있는 장점이 있다. 실질적으로 실시간 PCR법은 유전자변형 농산물의 혼입률 및 식품 가공품의 유전자변형체의 정량 검정에 이용될 수 있다.
상기 실시간 PCR에 필요한 구성요소는 프라이머, 프로브 외에 템플릿, 역전사 효소(Reverse transcriptase), DNA 합성효소(DNA polymerase), dNTPs mixture이 필요하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 물질 외에도 반응 첨가물로서 Mg2+, 비이온계 계면활성제로 트윈(Tween)-20 또는 옥틸 페녹시폴리에톡실에탄올(Nonidet P-40)을 첨가할 수 있으며, 다이메틸설폭사이트(dimethylsulfoxide)(DMSO), 폴리에틸렌글리콜(PEG6000(5~15%)), 글리세롤(glycerol(5~20%)), 포름아마이드(formamide(5%)), 보바인세럼알부민(BSA; bovine serum albumin) 중 어느 하나 이상이 첨가될 수 있다.
구체적으로, 상기 실시간 PCR 방법을 이용한 비피도박테리움 검출용 조성물의 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 쌍; 서열번호 11의 염기서열 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 제 6 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 제 7 프라이머 쌍; 서열번호 15의 염기서열 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 제 8 프라이머 쌍; 서열번호 17의 염기서열 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 제 9 프라이머 쌍; 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 제 10 프라이머 쌍; 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 제 11 프라이머 쌍; 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 제 12 프라이머 쌍; 서열번호 25의 염기서열 및 서열번호 26의 염기서열을 포함하는 제 13 프라이머 쌍; 서열번호 27의 염기서열 및 서열번호 28의 염기서열을 포함하는 제 14 프라이머 쌍; 서열번호 29의 염기서열 및 서열번호 30의 염기서열을 포함하는 제 15 프라이머 쌍; 서열번호 31의 염기서열 및 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 제 16 프라이머 쌍; 서열번호 33의 염기서열 및 서열번호 34의 염기서열을 포함하는 제 17 프라이머 쌍; 서열번호 35의 염기서열 및 서열번호 36의 염기서열을 포함하는 제 18 프라이머 쌍; 서열번호 37의 염기서열 및 서열번호 38의 염기서열을 포함하는 제 19 프라이머 쌍; 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 제 20 프라이머 쌍; 서열번호 41의 염기서열 및 서열번호 42의 염기서열을 포함하는 제 21 프라이머 쌍; 서열번호 43의 염기서열 및 서열번호 44의 염기서열을 포함하는 제 22 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 프라이머 쌍이 포함되거나, 2종 이상의 복수 개의 프라이머 쌍이 포함된 형태로 구성될 수 있다.
본 발명에서, “비피도박테리움(Bifidobacterium)”은 유산균의 일종으로 주로 대장에 서식하는 균주로서 대장균증식 억제, 장운동과 배변활동 강화 등에 효능이 있는 균주로 알려져 있다. 특히 모유를 먹는 아기의 장 대부분을 차지하는 균주이며, 나이가 들면서 줄어드는 균주이다. 대표 균주로는 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 애니멀리스 락티스 등이 있다. 예컨대, 비피도박테리움 비피덤은 모유로 자란 대장에 주로 서식하며, 항생물질을 생성하여 유해균사멸 능력이 우수한 균주이며, 비피도 롱검은 장 내 유해균 억제 효과가 큰 균으로 설사, 장염, 과민성 대장증후군 개선에 도움이 되는 균주이다.
구체적으로, 상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스(Bifidobacterium animalis subsp. animalis); 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis); 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스(Bifidobacterium longum subsp. suis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검(Bifidobacterium longum subsp. longum); 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum); 비피도박테리움 갈리컴(Bifidobacterium gallicum); 비피도박테리움 테르마시도필룸(Bifidobacterium thermacidophilum); 비피도박테리움 테르모필룸(Bifidobacterium thermophilum); 비피도박테리움 코리네포르메(Bifidobacterium coryneforme); 비피도박테리움 아스테로이드(Bifidobacterium asteroides); 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis); 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum); 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi); 비피도박테리움 갈리나룸(Bifidobacterium gallinarum); 비피도박테리움 스카르도비(Bifidobacterium scardovii); 비피도박테리움 슈도카테눌라튬(Bifidobacterium pseudocatenulatum); 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum); 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium); 비피도박테리움 츠루미엔스(Bifidobacterium tsurumiense); 및 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum);로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스의 유전자를 검출하기 위한 제1프라이머 쌍; 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스의 유전자를 검출하기 위한 제2프라이머 쌍; 비피도박테리움 브레브의 유전자를 검출하기 위한 제3프라이머 쌍; 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스의 유전자를 검출하기 위한 제4프라이머 쌍; 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스의 유전자를 검출하기 위한 제5프라이머 쌍; 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검의 유전자를 검출하기 위한 제6프라이머 쌍; 비피도박테리움 비피덤의 유전자를 검출하기 위한 제7프라이머 쌍; 비피도박테리움 갈리컴의 유전자를 검출하기 위한 제8프라이머 쌍; 비피도박테리움 테르마시도필룸의 유전자를 검출하기 위한 제9프라이머 쌍; 비피도박테리움 테르모필룸의 유전자를 검출하기 위한 제10프라이머 쌍; 비피도박테리움 코리네포르메의 유전자를 검출하기 위한 제11프라이머 쌍; 비피도박테리움 아스테로이드의 유전자를 검출하기 위한 제12프라이머 쌍; 비피도박테리움 아돌레센티스의 유전자를 검출하기 위한 제13프라이머 쌍; 비피도박테리움 슈도롱검의 유전자를 검출하기 위한 제14프라이머 쌍; 비피도박테리움 쿠니쿨리의 유전자를 검출하기 위한 제15프라이머 쌍; 비피도박테리움 갈리나룸의 유전자를 검출하기 위한 제16프라이머 쌍; 비피도박테리움 스카르도비의 유전자를 검출하기 위한 제17프라이머 쌍; 비피도박테리움 슈도카테눌라튬의 유전자를 검출하기 위한 제18프라이머 쌍; 비피도박테리움 안굴라툼의 유전자를 검출하기 위한 제19프라이머 쌍; 비피도박테리움 덴티움의 유전자를 검출하기 위한 제20프라이머 쌍; 비피도박테리움 츠루미엔스의 유전자를 검출하기 위한 제21 프라이머 쌍; 및 비피도박테리움 카테눌라텀의 유전자를 검출하기 위한 제22프라이머 쌍을 포함하는 실시간 PCR 프리믹스(premix) 조성물을 제조하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 본 발명의 각 프라이머 쌍들이 비피도박테리움 속 균주에 대해 매우 높은 특이도를 나타냄을 확인하였으며 (표 4), 여러 균주가 혼합된 프로바이오틱스 제품에 적용하였을 때에도 비피도박테리움 속 균주의 종 및 아종 수준까지 선별해낼 수 있음을 확인하였는 바(표 5), 비피도박테리움 속 균주 검출에 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 조성물을 포함하는 비피도박테리움 속 균주 검출용 키트를 제공한다.
상기 검출용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.
상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다.
본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 비피도박테리움 속 균주를 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 검출용 키트는 실시간 PCR 키트일 수 있다. 구체적으로, 실시간 PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 실시간 PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 검출용 조성물을 포함하는, 비피도박테리움 속 균주 검출용 바이오 칩(chip)에 관한 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 “바이오 칩(chip)”은 DNA 칩이라고도 불리우며, 매우 작은 DNA 조각들이 고체 표면에 집적된 것으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 투명 또는 반투명한 재질로 이루어진 기판에 시료용액과 시약을 수용할 수 있는 챔버 및 채널을 포함한 형태일 수 있다.
바이오 칩은 두께가 얇고 투명하며 히터블록과의 접촉면적이 넓기 때문에 PCR 시간을 크게 단축할 수 있고, 동시에 최소한 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다. 또한, 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있으며, 동시에 많은 수의 유전자를 검색할 수 있으며, 많은 양의 유전자의 발현 정도를 동시에 측정하거나 게놈의 다양한 부분의 유전자형을 파악하기 위해 사용할 수 있다.
바이오 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA)칩과 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide)으로 분류될 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500bp 이상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 10 내지 50개, 구체적으로는 10 내지 30개, 더욱 구체적으로는 15 내지 20개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 접착될 수 있고, 칩 내에 포함되는 용액에 포함될 수 있으나, 상기 형태에 한정되지 않으며 필요에 따라 적절히 변형할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 대상 시료에 상기 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 비피도박테리움 속 균주 검출 방법을 제공한다.
상기 검출방법에 사용하는 대상 시료는 비피도박테리움 속 균주가 발견될 수 있는 모든 물질, 바람직하게는 다양한 프로바이오틱 식품에서 수득할 수 있다. 구체적으로, 상기 대상 시료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 DNA 추출방법을 통해 수득할 수 있으며, 예컨대 알카라인 추출법, 열수추출법, 컬럼 추출법 및 페놀/클로로포름 추출법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출방법은 대상 시료 내 존재하는 비피도박테리움의 DNA를 검출할 수 있는 특정 방법들을 의미하는 것으로, DNA 서열 분석 방법; 프로브 하이브리드화 방법; 구조 특이적인 절단 분석; 효소 미스매치 절단 방법(enzyme mismatch cleavage method); 중합효소 연쇄 반응(PCR); 측쇄 하이브리드화 방법; 롤링 서클 복제(rolling circle replication); 핵산서열기반 증폭(Nucleic acid sequence based amplification, NASBA); 분자 비콘 기술(molecular beacon technology); E-센서 기술(미국 특허 제6,248,229호 등); 사이클링 프로브 기술(cycling probe technology); 데이드 베링(Dade Behring) 시그날 증폭 방법; 리가제 연쇄 반응; 및 샌드위치 하이브리드화 방법 또는 서던 블로팅(southern blotting)을 이용하는 것 일 수 있다.
상기 검출방법은 상기 조성물을 이용하여 특정 DNA를 증폭시킨 후, 특정 DNA의 증폭 반응을 확인하는 단계를 통해 수행될 수 있으며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 검출방법의 반응산물이 전기 영동 등을 통하여 예상되는 DNA 산물의 크기와 일치하는지를 확인함으로써 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 검출방법은 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 “중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 것으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.
상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다. 또한, 상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 이의 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 1종 또는 복수의 비피도박테리움을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 구축하였으며, 상기 프라이머 세트의 특이성 및 민감도가 높아 매우 낮은 수준의 타겟 DNA 농도에서도 효과적으로 타겟 DNA를 증폭할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 a) 대상 시료에 제1항의 조성물을 처리하는 단계; 및 b) 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스(Bifidobacterium animalis subsp. animalis); 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis); 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스(Bifidobacterium longum subsp. suis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검(Bifidobacterium longum subsp. longum); 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum); 비피도박테리움 갈리컴(Bifidobacterium gallicum); 비피도박테리움 테르마시도필룸(Bifidobacterium thermacidophilum); 비피도박테리움 테르모필룸(Bifidobacterium thermophilum); 비피도박테리움 코리네포르메(Bifidobacterium coryneforme); 비피도박테리움 아스테로이드(Bifidobacterium asteroides); 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis); 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum); 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi); 비피도박테리움 갈리나룸(Bifidobacterium gallinarum); 비피도박테리움 스카르도비(Bifidobacterium scardovii); 비피도박테리움 슈도카테눌라튬(Bifidobacterium pseudocatenulatum); 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum); 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium); 비피도박테리움 츠루미엔스(Bifidobacterium tsurumiense); 및 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum);로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 비피도박테리움 속 균주 포함 시료의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 “시료”는 비피도박테리움 속 균주의 포함 여부를 확인하고자 하는 대상이 되는 물질을 말한다. 구체적으로 프로바이오틱스 제제, 화장품, 식품, 영양제, 음료, 첨가제, 각종 식이에 포함되는 물질 등을 대상으로 할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니며 비피도박테리움 속 균주의 포함 여부를 확인하고자 하는 것이라면 모두 대상 시료가 될 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 특별한 제한 없이 당업계에 공지된 방법에 의해 수행되는 모든 유전자 스크리닝 방법을 통해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 제1프라이머 쌍 내지 제22프라이머 쌍을 포함하는 비피도박테리움 속 검출용 조성물을 이용하여, 대상 시료 내 존재하는 비피도박테리움 속 종(species) 및 아종(subspecies)의 수준까지 정확히 판별할 수 있다.
상기 검출용 조성물은 프로바이오틱스 제품을 포함한 다양한 식료품 및 샘플에서의 비피도박테리움 검출 및 동정에 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 22종의 비피도박테리움(Bifidobacterium)을 검출하기 위한 실시간 PCR 에세이 플레이트(real-time PCR assay plate)를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 비피도박테리움 표준 균주와 프로바이오틱 제품의 준비
41종의 비피도박테리움 표준 균주는 한국생물자원센터(KCTC) 및 국립 농업과학원 미생물 은행(KACC), 한국 미생물 보존센터(KCCM)으로부터 분양받았다 (표 1).
번호 비피도박테리움 종(Species) 균주 번호
1 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스(Bifidobacterium animalis subsp. animalis) KACC 16637
2 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) KACC 16638
3 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) KACC 16639
4 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) KCTC 3419
5 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis) KCTC 3249
6 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스(Bifidobacterium longum subsp. suis) KACC 16649
7 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검(Bifidobacterium longum subsp. longum) KCCM 11953
8 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC 3418
9 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC 3440
10 비피도박테리움 갈리컴(Bifidobacterium gallicum) KACC 16645
11 비피도박테리움 테르마시도필룸 서브스페시스 테르마시도필룸(Bifidobacterium thermacidophilum subsp. thermacidophilum) KACC 16653
12 비피도박테리움 테르마시도필룸(Bifidobacterium thermacidophilum) KACC 16674
13 비피도박테리움 테르모필룸(Bifidobacterium thermophilum) KACC 20600
14 비피도박테리움 코리네포르메(Bifidobacterium coryneforme) KACC 16642
15 비피도박테리움 아스테로이드(Bifidobacterium asteroides) KACC 16635
16 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) KACC 16634
17 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum) KACC 16667
18 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum) KACC 16666
19 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi) KACC 16643
20 비피도박테리움 갈리나룸(Bifidobacterium gallinarum) KACC 16646
21 비피도박테리움 스카르도비(Bifidobacterium scardovii) KACC 16672
22 비피도박테리움 슈도카테눌라튬(Bifidobacterium pseudocatenulatum) KCTC 3223
23 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum) KCTC 3236
24 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium) KACC 16644
25 비피도박테리움 츠루미엔스(Bifidobacterium tsurumiense) KACC 16654
26 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum) KACC 16640
27 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum) KACC 16648
28 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) KCTC 3163
29 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCTC 3237
30 락토바실러스 카쎄이(Lactobacillus casei) KACC 12413
31 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii) KACC 12420
32 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KACC 12419
33 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus) KACC 12418
34 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) KACC 11441
35 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) KACC 12427
36 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KACC 11451
37 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) KCTC 3594
38 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) KCTC 3600
39 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis) KACC 19376
40 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) KCTC 13225
41 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) KCTC 3206
분양 받은 표준 균주는 모두 MRS 액체 배지에서 37℃, 48시간 동안 혐기적 조건으로 배양하였다. 제품 모니터링을 위한 프로바이오틱 제품은 마켓으로부터 구입하였다.
실시예 2. DNA 추출 방법
모든 비피도박테리움 표준 균주의 DNA 추출을 위해 MRS 액체배지에서 37℃, 48시간 동안 혐기적 조건으로 배양하였다. 배양 후 13,600 g에서 5분 동안 원심분리 하였고, 상층액을 제거한 뒤 펠렛을 이용하여 유전체 DNA를 추출하였다. 유전체 DNA와 프로바이오틱 제품의 DNA는 DNeasy®& Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 모든 DNA는 분광광도계를 이용하여 농도와 순도를 측정하였으며, 1% 아가로스 겔에서 150 V로 전기영동하였고, 브로민화 에티듐(Ethidium Bromide, EtBr)으로 염색한 뒤 UV-일루미네이터를 이용하여 DNA를 확인하였다.
실시예 3. 비피도박테리움 종 특이 프라이머 디자인
비피도박테리움의 종 또는 아종 수준까지 검출할 수 있는 특이 프라이머를 개발하기 위해 193개의 비피도박테리움 전장유전체 염기서열을 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI)로부터 다운 받았다. 모든 전장유전체 염기서열은 범유전체 분석을 통해 검증 한 다음 특이 유전자 선별을 진행 하였다. USEARCH 프로그램으로 비교유전체 분석을 수행하여 비피도박테리움의 각 종과 아종에 대한 특이 유전자는 동일한 종 또는 아종에는 모두 존재하면서 다른 종 또는 아종에는 존재하지 않는 유전자를 선별하였다. 선별된 후보 유전자는 NCBI의 BLAST를 통해 타겟으로 하는 종 또는 아종을 제외한 나머지 모든 박테리아에 존재하지 않는 유전자임을 확인 하였다. 확인된 최종 유전자로부터 종 또는 아종 특이 프라이머를 디자인 하였다.
세트번호 타겟 종(species) 프라이머 시퀀스 (5'-3') 서열번호
1 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스(Bifidobacterium animalis subsp. animalis) Animalis-F CAG ACC TCG CCG ATG AGC TA 1
Animalis-R ATA TCC GGC TTG ATC ACC TG 2
2 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) Lactis-F ACC TCA CCA ATC CGC TGT TC 3
Lactis-R GAT CCG CAT GGT GGA ACT CT 4
3 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) Breve-F TCA TCA CGG CAA GGT CAA GA 5
Breve-R GGC CAG AAC AGC TGG AAC AA 6
4 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis) Infantis-F ATG ATG CGC TGC CAC TGT TA 7
Infantis-R CGG TGA GCG TCA ATG TAT CT 8
5 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스(Bifidobacterium longum subsp. suis) Suis-F CAA GCC GGA TAT CGT CTT CG 9
Suis-R GAG GAT CGT GCC ATG CTG TC 10
6 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검(Bifidobacterium longum subsp. longum) Longum-F GTG TGG ATT ACC TGC CTA CC 11
Longum-R GTC GCC AAC CTT GAC CAC TT 12
7 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) Bifidum-F CTG GCA GCC GTG ACA CTA CT 13
Bifidum-R TGA ACT GGC CGT TAC GGT CT 14
8 비피도박테리움 갈리컴(Bifidobacterium gallicum) Gallicum-F TCA CCA TCA CCA CCT CAC 15
Gallicum-R GTT CCA TTG TTC CCA TCC C 16
9 비피도박테리움 테르마시도필룸(Bifidobacterium thermacidophilum) Thermacidophilum-F CGT TAG AAC AGC GCC AAC AG 17
Thermacidophilum-R GCC GGC ATA TTC ATC GAG TC 18
10 비피도박테리움 테르모필룸(Bifidobacterium thermophilum) Thermophilum-F CCG ATG CCG ATA CAG TTC AA 19
Thermophilum-R TGT CAT CCG ACG CTT CAA GA 20
11 비피도박테리움 코리네포르메(Bifidobacterium coryneforme) Coryneforme-F TAA ATT CGT CCC CGC TTT GC 21
Coryneforme-R TCC TCA TCC TCC TCC ATA ACC 22
12 비피도박테리움 아스테로이드(Bifidobacterium asteroides) Asteroides-F GCC GTG GTC ACC ACA CTA TC 23
Asteroides-R GCG CAC TAT GTC ATT GTC TG 24
13 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) Adolescentis-F GCT GAT ATC TGC GCT GTA CC 25
Adolescentis-R AAA CCA CCC AGT AGT CCT CC 26
14 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum) Pseudolongum-F TCG ACA TCC TCG GCC ATA TC 27
Pseudolongum-R TCG CGG CAC TGT CTG TAT TG 28
15 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi) Cuniculi-F TGA AGG AAA CAC CGC CAA TC 29
Cuniculi-R ACC TCC CTC TGA GCC TTG AC 30
16 비피도박테리움 갈리나룸(Bifidobacterium gallinarum) Gallinarum-F CGA CGA AAC ATT ACG CAT CC 31
Gallinarum-R ATG AAA TCC ACT TCG CCA CC 32
17 비피도박테리움 스카르도비(Bifidobacterium scardovii) Scardovii-F CGC AGG CAC TCG CTG TAC TA 33
Scardovii-R GGC GTA ACG TCT CAG TAT CA 34
18 비피도박테리움 슈도카테눌라튬(Bifidobacterium pseudocatenulatum) Pseudocatenulatum-F ACC TAC GAT TTC TCC CTC TCC 35
Pseudocatenulatum-R CTC CAG CAA AGC CAA CGA AC 36
19 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum) Angulatum-F TGC GGA TAC CAT CGA AGA AC 37
Angulatum-R TTC GCG ACA TCC ATT GAC TG 38
20 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium) Dentium-F GCG ACC GCT TCC ATC ATT AT 39
Dentium-R GGA GAT GCC GTC CTT AGA TT 40
21 비피도박테리움 츠루미엔스(Bifidobacterium tsurumiense) Tsurumiense-F TGC GGT TCA ACC AAG CTT AC 41
Tsurumiense-R TCG TCG TCA CCA GAT TCT TC 42
22 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum) Catenulatum-F CGC CAA CGC AGT AGT GCA TA 43
Catenulatum-R TAG GCC ACC TGG ATT CGA TA 44
실험예 1. 실시간(Real-time) PCR의 특이도 확인
각 개발된 종 특이 프라이머의 특이도를 확인하기 위해 실시간(Real-time) PCR을 수행하였다. 시료 분석을 위해 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 22개의 프라이머 쌍을 분배하여 테스트하였다.
실시간 PCR을 수행하기 위한 반응액 조성은 2X Thunderbird SYBR®qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japan)와 종 특이 프라이머, 비피도박테리움 표준 균주 DNA이다. 실시간 PCR은 7500 Real-time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 장비를 사용하였고, 반응 조건은 95°C에서 2분 동안 변성한 후 95°C에서 5초, 60°C에서 30초 반응을 30회 반복 수행하였다. 멜트 커브(Melt curve) 데이터를 얻기 위해 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 30초, 60°C에서 15초 반응을 수행하였다. 실시간 PCR의 정확성을 평가하기 위해, 20~0.002 ng로 연속 희석(serial dilution) 한 각 비피도박테리움 표준 균주 DNA와 종 특이 프라이머를 사용하여 표준곡선(standard curve)을 그렸다. 22개 비피도박테리움 표준 균주 DNA를 사용하여 내재 프라이머로는 균주의 유무를 확인하였고, 종 특이 프라이머는 특이도를 각각 확인하였다. 실시간 PCR 실험 결과는 7500 software V2.3을 이용하여 확인하였다.
이에 앞서, 상기 실시간 PCR의 조건이 적절한 것인지 여부를 확인하기 위해 PCR의 효율성을 확인하였다. 연속적으로 희석(serial dilution)한 22종의 비피도박테리움 DNA의 형광 증폭 곡선 결과를 바탕으로 표준 그래프를 작성하였고, 모든 그래프의 경사(slope), R2 효율(efficiency)값은 표 3에 나타내었다.
종 경사도(Slope) R2 효율(Efficiency) (%)
비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스 KACC 16637 -3.537 0.998 91.735
비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 KACC 16638 -3.564 0.998 90.788
비피도박테리움 브레브 KACC 16639 -3.448 0.998 94.987
비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스 KCTC 3249 -3.312 0.998 100.424
비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스 KACC 16649 -3.391 0.999 97.192
비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검 KCCM 11953 -3.275 0.997 102.001
비피도박테리움 비피덤 KCTC 3418 -3.438 0.998 95.359
비피도박테리움 갈리컴 KACC 16645 -3.586 0.998 90.827
비피도박테리움 테르마시도필룸 서브스페시스 테르마시도필룸 KACC 16653 -3.11 1 109.673
비피도박테리움 테르모필룸 KACC 20600 -3.104 0.998 109.994
비피도박테리움 코리네포르메 KACC 16642 -3.576 1 90.406
비피도박테리움 아스테로이드 KACC 16635 -3.499 0.999 93.102
비피도박테리움 아돌레센티스 KACC 16634 -3.547 0.999 91.387
비피도박테리움 슈도롱검 서브스페시스 슈도롱검KACC 16667 -3.354 0.997 98.667
비피도박테리움 쿠니쿨리 KACC 16643 -3.569 0.999 90.623
비피도박테리움 갈리나룸 KACC 16646 -3.585 0.996 90.088
비피도박테리움 스카르도비 KACC 16672 -3.57 0.996 90.581
비피도박테리움 슈도카테눌라튬 KCTC 3223 -3.552 1 91.205
비피도박테리움 안굴라툼 KCTC 3236 -3.375 0.999 97.82
비피도박테리움 덴티움 KACC16644 -3.316 0.998 100.265
비피도박테리움 츠루미엔스 KACC 16654 -3.247 0.998 103.207
비피도박테리움 카테눌라텀 KACC 16640 -3.52 0.999 92.367
CODEX 가이드라인에 따르면 경사(slope) 값은 -3.1~-3.6, R2 값은 0.98 이상일 때 실시간 PCR의 효율성이 우수하다고 제시하였다. 상기 표 3에 나타난 결과와 CODEX 가이드라인 수치를 비교하였을 때, 모든 값이 가이드라인 안에 들어옴으로써 상기 실시간 PCR 조건은 우수한 효율을 갖는 것을 확인하였다.
또한, 상기 실시간 PCR 조건에서 각 종별 특이 프라이머의 특이도를 확인하였다. 22종의 비피도박테리움 표준 균주 DNA를 대상으로 종 특이 프라이머 쌍을 모두 반응시켰을 때, 타겟 종에만 증폭되고 타겟을 제외한 나머지 종에는 어떤 증폭도 일어나지 않는 것을 모두 확인함으로써 본 발명의 22개 종 특이 프라이머 쌍은 각 종별로 현저한 특이도를 가진다는 사실을 확인하였다.
프라이머 탐지된 균주 특이도 (Ct)
Animalis-F,R 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스 KACC 16637 15.88
Lactis-F,R 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 KACC 16638 13.3
Breve-F,R 비피도박테리움 브레브 KACC 16639 14.58
Breve-F,R 비피도박테리움 브레브 KCTC 3419 14.26
Infantis-F,R 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스 KCTC 3249 14.21
Suis-F,R 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스 KACC 16649 12.3
Longum-F,R 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검 KCCM 11953 13.51
Bifidum-F,R 비피도박테리움 비피덤 KCTC 3418 13.6
Bifidum-F,R 비피도박테리움 비피덤 KCTC 3440 13.9
Gallicum-F,R 비피도박테리움 갈리컴 KACC 16645 14.73
Thermacidophilum-F,R 비피도박테리움 테르마시도필룸 서브스페시스 테르마시도필룸 KACC 16653 14.82
Porcinum-F,R 비피도박테리움 테르마시도필룸 서브스페시스 포르시눔 KACC 16674 14.31
Thermophilum-F,R 비피도박테리움 테르모필룸 KACC 20600 15.42
Coryneforme-F,R 비피도박테리움 코리네포르메 KACC 16642 13.9
Asteroides-F,R 비피도박테리움 아스테로이드 KACC 16635 15.94
Adolescentis-F,R 비피도박테리움 아돌레센티스 KACC 16634 15.16
Pseudolongum-F,R 비피도박테리움 슈도롱검 서브스페시스 슈도롱검 KACC 16667 15.52
Globosum-F,R 비피도박테리움 슈도롱검 서브스페시스 글루보섬 KACC 16666 14.94
Cuniculi-F,R 비피도박테리움 쿠니쿨리 KACC 16643 13.4
Gallinarum-F,R 비피도박테리움 갈리나룸 KACC 16646 11.41
Scardovii-F,R 비피도박테리움 스카르도비 KACC 16672 15.69
Pseudocatenulatum-F,R 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 KCTC 3223 12.92
Angulatum-F,R 비피도박테리움 안굴라툼 KCTC 3236 15.3
Dentium-F,R 비피도박테리움 덴티움 KACC16644 14.73
Tsurumiense-F,R 비피도박테리움 츠루미엔스 KACC 16654 13.86
Catenulatum-F,R 비피도박테리움 카테눌라텀 KACC 16640 13.82
Kashiwanohense-F,R 비피도박테리움 카테눌라텀 서브스페시스 카쉬와노헨스 KACC 16648 14.92
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 모든 종 특이 프라이머의 Ct 값 범위는 9.0~16.0 값 사이로 비피도박테리움 표준 균주 DNA가 특이적으로 증폭된 것을 확인하였다. Ct 값이란, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수이다.
실험예 2. 프로바이오틱 제품 적용 실험
개발된 실시간 PCR 법을 이용하여 프로바이오틱 제품의 비피도박테리움 동정을 위한 적용 실험을 수행하였다. 총 33개의 프로바이오틱 제품에 대해 확인하였으며, 실시간 PCR 결과 검출된 종 또는 아종과 제품 라벨과 비교하였다. 프로바이오틱 제품은 A로 지정하였고, 유제품은 B로 지정하였다.
제품 표시된 라벨 검출된 종 또는 아종
A1 B. 롱검 B. 롱검 서브스페시스 롱검
A2 B. 비피덤, B. 롱검 B. 비피덤, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A3 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
A4 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
A5 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
A6 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
A7 B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A8 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤
A9 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤
A10 B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검 B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A11 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브
A12 B. 브레브, B. 롱검, B. 롱검 서브스페시스 인판티스 B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시스 인판티스
A13 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 브레브, B. 롱검 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A14 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브
A15 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브
A16 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브
A17 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A18 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A19 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A20 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시프 인판티스
A21 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검
A22 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시스 인판티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시프 인판티스
A23 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시스 인판티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시프 인판티스
A24 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시스 인판티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시프 인판티스
A25 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검, B. 롱검 서브스페시스 인판티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시프 인판티스
A26 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검, B. 롱검 서브스페시스 인판티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 비피덤, B. 브레브, B. 롱검 서브스페시스 롱검, B. 롱검 서브스페시프 인판티스
B1 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
B2 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
B3 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
B4 비피더스, 젖산 박테리아 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
B5 비피더스, 젖산 박테리아 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스, B. 롱검 서브스페시스 롱검
B6 젖산 박테리아 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
B7 젖산 박테리아 B. 애니멀리스 서브스페시스 락티스
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 프로바이오틱 제품에 기재된 비피도박테리움 균 종을 모두 검출할 뿐 아니라, 검출되지 않은 균주의 종 및 아종 수준까지도 정확하게 검출되었음을 확인하였다.
본 발명은 비피도박테리움 종 또는 아종 수준에서 빠르고 정확하게 동정할 수 있도록 비교 유전체학을 이용하여 종 특이 프라이머 쌍, 프라이머 세트 및 이들을 포함하는 비피도박테리움 검출용 조성물을 제공하고, 이들을 이용하여 비피도박테리움을 검출할 수 있는 키트, 바이오 칩 및 검출방법을 제공한다. 또한 상기 조성물을 이용한 검출방법을 프로바이오틱 제품 모니터링에 적용하여 제품의 라벨에 보고된 비피도박테리움의 존재와 보고되지 않은 비피도박테리움의 존재 여부도 결정할 수 있는 능력을 확인하였다. 이 방법은 프로바이오틱 제품뿐만 아니라 식품이나 환경 샘플로부터 다양한 비피도박테리움을 한 번에 검출할 수 있는 연구에도 적용가능한 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> REAL TIME PCR PRIMERS FOR DETECTION OF BIFIDOBACTERIUM SPECIES, AND USE THEREOF <130> 20PP30323 <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Animalis-F <400> 1 cagacctcgc cgatgagcta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Animalis-R <400> 2 atatccggct tgatcacctg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactis-F <400> 3 acctcaccaa tccgctgttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactis-R <400> 4 gatccgcatg gtggaactct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Breve-F <400> 5 tcatcacggc aaggtcaaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Breve-R <400> 6 ggccagaaca gctggaacaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Infantis-F <400> 7 atgatgcgct gccactgtta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Infantis-R <400> 8 cggtgagcgt caatgtatct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Suis-F <400> 9 caagccggat atcgtcttcg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Suis-R <400> 10 gaggatcgtg ccatgctgtc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Longum-F <400> 11 gtgtggatta cctgcctacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Longum-R <400> 12 gtcgccaacc ttgaccactt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidum-F <400> 13 ctggcagccg tgacactact 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidum-R <400> 14 tgaactggcc gttacggtct 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallicum-F <400> 15 tcaccatcac cacctcac 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallicum-R <400> 16 gttccattgt tcccatccc 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thermacidophilum-F <400> 17 cgttagaaca gcgccaac 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thermacidophilum-R <400> 18 gccggcatat tcatcgagtc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thermophilum-F <400> 19 ccgatgccga tacagttcaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thermophilum-R <400> 20 tgtcatccga cgcttcaaga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coryneforme-F <400> 21 taaattcgtc cccgctttgc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coryneforme-R <400> 22 tcctcatcct cctccataac c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asteroides-F <400> 23 gccgtggtca ccacactatc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asteroides-R <400> 24 gcgcactatg tcattgtctg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adolescentis-F <400> 25 gctgatatct gcgctgtacc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adolescentis-R <400> 26 aaaccaccca gtagtcctcc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudolongum-F <400> 27 tcgacatcct cggccatatc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudolongum-R <400> 28 tcgcggcact gtctgtattg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cuniculi-F <400> 29 tgaaggaaac accgccaatc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cuniculi-R <400> 30 acctccctct gagccttgac 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallinarum-F <400> 31 cgacgaaaca ttacgcatcc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallinarum-R <400> 32 atgaaatcca cttcgccacc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scardovii-F <400> 33 cgcaggcact cgctgtacta 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scardovii-R <400> 34 ggcgtaacgt ctcagtatca 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudocatenulatum-F <400> 35 acctacgatt tctccctctc c 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudocatenulatum-R <400> 36 ctccagcaaa gccaacgaac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angulatum-F <400> 37 tgcggatacc atcgaagaac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angulatum-R <400> 38 ttcgcgacat ccattgactg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dentium-F <400> 39 gcgaccgctt ccatcattat 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dentium-R <400> 40 ggagatgccg tccttagatt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tsurumiense-F <400> 41 tgcggttcaa ccaagcttac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tsurumiense-R <400> 42 tcgtcgtcac cagattcttc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catenulatum-F <400> 43 cgccaacgca gtagtgcata 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catenulatum-R <400> 44 taggccacct ggattcgata 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머쌍; 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머쌍; 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머쌍; 서열번호 11의 염기서열 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 제 6 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 제 7 프라이머 쌍; 서열번호 15의 염기서열 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 제 8 프라이머 쌍; 서열번호 17의 염기서열 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 제 9 프라이머 쌍; 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 제 10 프라이머 쌍; 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 제 11 프라이머 쌍; 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 제 12 프라이머 쌍; 서열번호 25의 염기서열 및 서열번호 26의 염기서열을 포함하는 제 13 프라이머 쌍; 서열번호 27의 염기서열 및 서열번호 28의 염기서열을 포함하는 제 14 프라이머 쌍; 서열번호 29의 염기서열 및 서열번호 30의 염기서열을 포함하는 제 15 프라이머 쌍; 서열번호 31의 염기서열 및 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 제 16 프라이머 쌍; 서열번호 33의 염기서열 및 서열번호 34의 염기서열을 포함하는 제 17 프라이머 쌍; 서열번호 35의 염기서열 및 서열번호 36의 염기서열을 포함하는 제 18 프라이머 쌍; 서열번호 37의 염기서열 및 서열번호 38의 염기서열을 포함하는 제 19 프라이머 쌍; 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 제 20 프라이머 쌍; 서열번호 41의 염기서열 및 서열번호 42의 염기서열을 포함하는 제 21 프라이머 쌍; 및
    서열번호 43의 염기서열 및 서열번호 44의 염기서열을 포함하는 제 22 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스(Bifidobacterium animalis subsp. animalis); 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis); 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스(Bifidobacterium longum subsp. suis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검(Bifidobacterium longum subsp. longum); 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum); 비피도박테리움 갈리컴(Bifidobacterium gallicum); 비피도박테리움 테르마시도필룸(Bifidobacterium thermacidophilum); 비피도박테리움 테르모필룸(Bifidobacterium thermophilum); 비피도박테리움 코리네포르메(Bifidobacterium coryneforme); 비피도박테리움 아스테로이드(Bifidobacterium asteroides); 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis); 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum); 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi); 비피도박테리움 갈리나룸(Bifidobacterium gallinarum); 비피도박테리움 스카르도비(Bifidobacterium scardovii); 비피도박테리움 슈도카테눌라튬(Bifidobacterium pseudocatenulatum); 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum); 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium); 비피도박테리움 츠루미엔스(Bifidobacterium tsurumiense); 및 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum);으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 비피도박테리움 속 균주 검출용 조성물.
  3. 제1항의 조성물을 포함하는 비피도박테리움 속 균주 검출용 키트.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는, 비피도박테리움 속 균주 검출용 바이오 칩(chip).
  5. 대상 시료에 제1항의 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 비피도박테리움 속 균주 검출방법.
  6. 제5항에 있어서,
    실시간 중합효소 연쇄반응(Real time Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;를 추가로 포함하는, 비피도박테리움 속 균주 검출방법.
  7. a) 대상 시료에 제1항의 조성물을 처리하는 단계; 및
    b) 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 애니멀리스(Bifidobacterium animalis subsp. animalis); 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis); 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 써이스(Bifidobacterium longum subsp. suis); 비피도박테리움 롱검 서브스페시스 롱검(Bifidobacterium longum subsp. longum); 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum); 비피도박테리움 갈리컴(Bifidobacterium gallicum); 비피도박테리움 테르마시도필룸(Bifidobacterium thermacidophilum); 비피도박테리움 테르모필룸(Bifidobacterium thermophilum); 비피도박테리움 코리네포르메(Bifidobacterium coryneforme); 비피도박테리움 아스테로이드(Bifidobacterium asteroides); 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis); 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum); 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi); 비피도박테리움 갈리나룸(Bifidobacterium gallinarum); 비피도박테리움 스카르도비(Bifidobacterium scardovii); 비피도박테리움 슈도카테눌라튬(Bifidobacterium pseudocatenulatum); 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum); 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium); 비피도박테리움 츠루미엔스(Bifidobacterium tsurumiense); 및 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum);로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 비피도박테리움 속 균주 포함 시료의 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계;를 추가로 포함하는, 비피도박테리움 속 균주 포함 시료의 스크리닝 방법.
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