KR100775641B1 - 다중효소중합반응 방법을 이용한 기능성 식품으로부터유산균 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중효소중합반응 방법을 이용한 기능성 식품으로부터 유산균 검출방법에 관한 것으로, 본 발명의 특이 프라이머를 이용하여 락토바실러스 속 2종과 비피도박테리움 속 2종의 4가지 다른 젖산균을 한 번의 반응으로 구분해 낼 수 있어서 단일 또는 이중 PCR과 비교해 볼 때, 시간과 비용을 줄일 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 프라이머를 이용하여 검사체 내에 혼재되어 있는 락토바실러스 속 균종과 비피도박테리움 속 균종을 동시에 신속, 정확하게 동정할 수 있으므로, 건강식품 및 의약품의 원료개발 및 프로바이오틱 제품의 표기시스템의 신뢰도를 모니터하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.

다중효소중합반응, 유산균, 프라이머, 프로바이오틱

Description

다중효소중합반응 방법을 이용한 기능성 식품으로부터 유산균 검출방법{Rapid identification of the lactic acid bacteria in probiotic products using multiplex PCR}

도 1은 PCR 프라이머의 설계 위치와 각 PCR 증폭산물의 예상 사이즈를 도시하고 있다.

도 2는 표준균주와 제품에 대해 최적화된 프라이머 혼합액을 사용하여 다중효소중합반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진도를 나타낸 것이다.

본 발명은 다중효소중합반응 방법을 이용한 기능성 식품으로부터 유산균 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 락토바실러스 속 균종인 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스와 비피도박테리움 속 균종인 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤에 각각 특이적인 프라이머를 이용하여 다중효소중합반응법을 통해 프로바이오틱 제품 내의 유산균을 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다.

프로바이오틱(생균제)은 기본적인 영양분을 제공할 뿐 아니라 인간의 건강에 도 매우 유용하다고 알려져 있다. 생균제에 관련된 미생물들의 장기능 개선과 면역 증강 및 항돌연변이, 항암 활성 등이 보고되고 있으며(Drisko JA, Altern Med Rev. 8, 143-155., 2003) 이러한 이유로 인하여 프로바이오틱 제품은 오늘날 널리 이용되고 있다. 락토바실러스(Lactobacillus)와 비피도박테리움(bifidobacterium)은 프로바이오틱 제품 중에서 가장 많이 이용되는 유산균으로서 이 중에서도 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 국내시장에서 상업적으로 가장 많이 이용되고 있고 있는 주요 균주이다.

유산균의 동정방법에 있어서 표현형적 특성과 생화학적 특성을 이용한 방법들은 그 기준이 모호하고 복잡하여 오늘날에는 널리 쓰이지 않고 있으며 최근에는 rRNA를 이용한 계통발생학적 분석 방법을 많이 사용하고 있다. 16S rRNA 또는 23S rRNA 지역의 염기서열을 이용하여 제작한 프로브와 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머를 이용한 방법들은 매우 성공적으로 유산균을 동정할 수 있다고 보고되고 있으나 한편으로는 16S rRNA에서 제작되는 프로브와 프라이머들은 미생물의 종간의 관계가 매우 가까울 경우, 각 미생물 종들의 16S rRNA 염기서열이 유사하기 때문에 미생물 동정을 위한 특이적인 유전자로는 적당하지 않다고 보고된 바 있다. 16S rRNA와 비교하여 미생물의 16S rRNA와 23S rRNA 사이 지역 유전자는 비교적 더 큰 다형성 부분이 존재하므로 매우 유사한 종의 동정에 필요한 특이적인 프라이머를 제작하는데 유용하게 쓰일 수 있다. 그리고 다중효소중합반응 방법은 각각의 다른 목적 유전자에 각기 다른 프라이머 쌍을 사용하므로 매우 유용하고 한 번의 반응으로 다수의 미생물을 빠르게 동정할 수 있다는 장점이 있다.

그러나, 기존의 방법들은 락토바실러스 속 균종 간이나 비피도박테리움 속 균종 간의 동정에 한정되었다.

따라서 본 발명의 목적은 프로바이오틱 제품에 있는 유산균을 검출함에 있어, 시간과 비용을 줄일 수 있고 높은 종 특이성을 보이는 실험 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 16S rRNA, 23S rRNA 및 16S-23S rRNA 사이 지역의 염기서열 부분에서 제작된 4가지의 종 특이적인 프라이머를 이용하여 다중효소중합반응 분석 방법을 설정하여 6가지의 기능성 제품에서 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤을 동정하고, DNA 시퀀싱을 통해 표준균주의 염기서열과 상기 프로바이오틱 제품의 PCR 증폭산물의 염기서열을 비교하여 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤을 동정하기 위한 프라이머 제작단계; 표준균주를 이용한 상기 프라이머의 다중효소중합반응의 민감도 측정단계; 다중효소중합반응을 이용하여 프로바이오틱에서 분리한 균주의 동정단계; 및, 상기 프로바이오틱 제품의 PCR 증폭산물의 염기서열 분석단계로 구성된다.

본 발명은 서열목록 서열번호 1 내지 8의 서열을 프라이머로 이용하여 다중효소중합반응을 실시하여 동정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 기능성 식품으로부터 유산균의 검출방법을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명의 검출방법을 통해 동정할 수 있는 유산균은 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤 중 어느 하나이다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 특이 프라이머를 이용한 기능성 식품 내 유산균의 검출

기능성 식품 내에 혼재하는 유산균을 신속 정확하게 동정하기 위해 특이 프라이머를 제작하고 이를 이용하여 다중효소중합반응을 실시하였다.

실험예 1: 프라이머의 특이도 검사

락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤을 동정하기 위한 새로운 종 특이적인 프라이머를 제작하였다.

락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 비피덤을 동정하기 위해서는, 락토바실러스 애시도필러스 (accession No. AY773947)와 락토바실러스 람노서스 (accession No. AF243146)의 16S rRNA 염기서열 부분과 비피도박테리움 비피덤(accession No. U09831)의 16S rRNA - 23S rRNA 사이 지역의 염 기서열 부분에서 새로운 종 특이적인 프라이머 쌍을 제작하였다(표 1). 비피도박테리움 롱검에 종 특이적인 프라이머 쌍은 기존에 제작된 것을 이용하였다(Matsuki et al.). PCR 프라이머가 제작된 위치와 염기서열, PCR 산물(amplicons) 사이즈는 도 1과 표 2에 나타내었다. 도 1에서 ISR은 사이 지역을 뜻하며, 화살표는 프라이머의 방향을 나타낸다. 또한, 각 약자들은 다음을 나타낸다.

RhamF과 RhamR : 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균종 특이 프라이머

BifF와 BifR : 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 균종 특이 프라이머

SSYF와 SSY2R : 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균종 특이 프라이머

BiflongF와 BiflongR : 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균종 특이 프라이머

4쌍의 종 특이적인 프라이머 쌍들을 표 1에 기재된 22가지 종류의 미생물 균주에서 추출된 DNA를 이용하여 PCR을 수행하여 특이성을 확인하였다. 상기 균주들은 KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받아 사용하였다. 모든 균주들과 샘플들은 MRS 배지(하디 다이아그노스틱스, 미국)에 접종하여 37℃에서 혐기적 상태로 (AnaeroPack®·Anaero, 미쮸비시 가스 케미컬 코퍼레이션, 일본) 배양하였다.

PCR 반응에서 주형으로 사용하기 위한 게놈 유전자는 다음과 같이 추출하였 다. MRS 배지에서 키운 미생물 배양액으로부터 DNeasy^® Tissue Kit(퀴아젠, 독일)를 사용하여 미생물의 게놈 유전자를 추출하였다. 그리고 Jeanne Driskoet 등의 방법(Digestive Diseases and Sciences 50, 1113-1117)을 변형하여 프로바이오틱 샘플에서 직접 미생물의 게놈 유전자를 추출하였다. 1g의 프로바이오틱 샘플을 1㎖의 TE 완충액(10mM Tris·HCl, 1mM EDTA[pH 8.0])에 녹인 후 각 샘플의 567㎕를 취하여 10% SDS 30㎕와 20㎍/㎕ 프로티나아제 K 3㎕를 순차적으로 넣어 준 후 골고루 잘 섞어 준 다음 55℃에서 2시간 정도 처리하였다. 여기에 600㎕의 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)를 넣고 혼합한 후, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 이것의 상층액을 2㎖ 새 튜브에 옮겨 담고 같은 양의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)을 넣어주고 잘 섞어 준 다음 이것을 다시 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 이 상층액을 다시 1.5㎖ 튜브에 옮겨 담고 여기에 3M 소듐 아세테이트 40㎕과 100% 에틸 알코올 800㎕을 처리하여 DNA를 침전시킨 다음 -80℃에서 1시간 동안 방치시켰다. 그리고 나서 14,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. DNA 침전물을 70% 에탄올 1㎖로 씻어 준 다음 건조시켜 에탄올이 남아 있지 않게 한다. 이것을 50㎕의 순수한 3차 증류수에 녹였다. 자외선 분광 광도계를 이용하여 260nm와 280nm에서의 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 계산하고, DNA의 수율과 순도를 측정하였다.

상기에서 추출한 게놈 유전자는 PCR 증폭에 주형으로 사용하였다. 각 반응액은 25㎕로 0.5U Taq 폴리머라아제(다카라, 일본)과 2mM MgCl, 각 0.2mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 그리고 표 4에 나온 농도의 주형 DNA와 프라이머 쌍을 포함하고 있다. 각 반응액은 주형 DNA를 95℃에서 5분간 가열하여 열변성시키는 1차 반응 후, 95℃에서 30초간 이중 가닥의 염색체 DNA를 풀고, 63℃에서 30초간 단일 가닥의 DNA와 프라이머를 결합시킨 후 72℃에서 30초간 중합반응을 총 30회 수행한 뒤 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 연장시키는 순서로 PCR 반응을 진행하였다. 증폭 산물은 2% 아가로우즈 젤(agarose gel)에 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색하여 증폭된 PCR 산물의 밴드 양상을 관찰하였다.

본 발명에서 사용된 미생물 균주와 균종 특이적인 다중효소중합반응 프라이머 제작에 사용된 16S rRNA, 16S-23S rRNA 사이 지역, 23S rRNA의 뉴클레오티드 염기서열 번호

표준균주	균주번호	Accession No.
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Lactobacillus fermentum Lactobacillus reuteri Lactobacillus salivarius subsp. salicinius Lactobacillus acidophilus Lactobacillus gasseri Lactobacillus casei Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus plantarum Lactobacillus johnsonii Lactobacillus brevis Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus sakei Bifidobacterium longum Bifidobacterium longum Bifidobacterium breve Bifidobacterium pseudocatenulatum Bifidobacterium catenulatum Bifidobacterium infantis Bifidobacterium animalis Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium adolescentis	KCTC 3510 KCTC 3112 KCTC 3594 KCTC 3600 KCTC 3164 KCTC 3163 KCTC 3109 KCTC 3237 KCTC 3104 KCTC 3801 KCTC 3498 KCTC 3635 KCTC 3598 KCTC 3128 KCTC 3421 KCTC 3220 KCTC 3223 KCTC 3358 KCTC 3249 KCTC 3126 KCTC 3418 KCTC 3216	AB126872, AB237507 AF302116, AF182720 L23507, AF182723 M59054, AB102859 AY773947, AB092634 AF519171, AF182721 AB239468, AF182729 AF243146, AF182730 AB104855, AB092637 AB236694, AF074860 AF090328, AB102858 AY050171, AB102856 M58739, U97137 M84781, U09792 U10152, U09832 AB006658, DQ167806 AB125917 M58732, U09522 AB125903, M84783, U09792 AB027536, AY225132 M84777, U09831, U09517 M58729, DQ108596

본 발명의 유산균 검출용 프라이머

프라이머	프라이머서열(5'-3')	길이(bp)
RhamF	GTCGAACGAGTTCTGATTATTG	22
RhamR	GAACCATGCGGTTCTTGGAT	20
BifF	ATTTGAGCCACTGTCTGGTG	20
BifR	CATCCGGGAACGTCGGGAAA	20
SSYF	CCAACAGATTCACTTCGGTGATG	23
SSY2R	CCTCTTCTGCACTCAAGAAAAA	22
BiflongF	TTCCAGTTGATCGCATGGTC	20
BiflongR	GGGAAGCCGTATCTCTACGA	20

미생물 균주와 젖산균을 동정하는데 사용한 프라이머 쌍들의 균종 특이성

균종	프라이머쌍의 특이성
	SSYF/SSY2R (614bp)	RhamF/RhamR (158bp)	BiflongF/BiflongR (831bp)	BifF/BifR (431bp)
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Lactobacillus fermentum Lactobacillus reuteri Lactobacillus salivarius subsp. salicinius Lactobacillus acidophilus Lactobacillus gasseri Lactobacillus casei Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus plantarum Lactobacillus johnsonii Lactobacillus brevis Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus sakei Bifidobacterium longum (KCTC 3128) Bifidobacterium longum (KCTC 3421) Bifidobacterium breve Bifidobacterium pseudocatenulatum Bifidobacterium catenulatum Bifidobacterium infantis Bifidobacterium animalis Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium adolescentis	- - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - -	- - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - -	- - - - - - - - - - - - - + + - - - - - - -	- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + -

표 3에 나타난 바와 같이, 모든 프라이머들이 타겟으로 한 균종에서 예상한 사이즈의 단일 밴드를 나타내었다. 따라서 이 프라이머 쌍들은 다중효소중합연쇄반응을 사용하여 프로바이오틱 제품의 유산균들을 동정하기에 적합한 것으로 확인되었다.

실험예 2: 표준균주를 통한 다중효소중합반응의 민감도 측정

다중효소중합반응 기법의 최적화를 위하여 프라이머 쌍의 농도를 최적화하였다. 다중효소중합반응에서 한 개 이상의 프라이머 쌍이 존재할 때는 예상하지 못한 PCR 반응물이 생성될 수 있을 뿐 아니라 민감도도 낮아진다. 다중효소중합반응에서 모든 프라이머 쌍들은 각 타겟에 대해 비슷한 강도의 PCR 증폭 산물을 생산해야 하므로 먼저 10μM의 같은 농도의 프라이머를 가지고 다중효소중합반응을 수행하였다. 이때 증폭산물들의 강도가 고르지 못하면 각 프라이머들의 농도비를 조절하여 주었다. 즉, 밴드의 강도가 약하면 프라이머 농도를 증가시켜 주고, 밴드의 강도가 강한 것은 프라이머 양을 감소시켜주는 방법으로 다중효소중합반응의 최적조건을 잡았다. 4가지 표준균주의 DNA 혼합물을 가지고 PCR을 수행하여 얻은 PCR 증폭산물은 도 2의 레인 1에 나타나 있으며 다중효소중합반응에 사용된 프라이머들의 최적화된 농도조건은 표 4에 나타내었다. 도 2에서 레인 M : 100bp DNA 사이즈 마커, 레인 1 : 표준균주, 레인 2 : 제품 1 D, 레인 3 : 제품 2 D, 레인 4 : 제품 3 D, 레인 5 : 제품 4 D, 레인 6 : 제품 5 D, 레인 7 : 제품 6 D, 레인 8 : 제품 1 M, 레인 9 : 제품 2 M, 레인 10 : 제품 3 M, 레인 11 : 제품 4 M, 레인 12 : 제품 5 M, 레인 13 : 제품 6 M을 나타낸 것이다.

예상한 바와 같이, 락토바실러스 람노서스는 158bp에 상응하는 크기의 PCR 증폭산물을 생산하였고, 비피도박테리움 비피덤은 431bp, 락토바실러스 애시도필러스는 614bp, 비피도박테리움 롱검은 831bp에 상응하는 PCR 증폭 산물을 생산하였다 (도 2, 레인 1).

주형 DNA와 다중효소중합반응에 사용한 프라이머 쌍들의 농도

표준균주	주형 DNA(ng)	특이 프라이머	쌍(pM)
Lactobacillus rhamnosus	12.5	RhamF RhamR	6μM 6μM
Bifidobacterium bifidum	12.5	BifF BifR	6μM 6μM
Lactobacillus acidophilus	12.5	SSYF SSY2R	6μM 6μM
Bifidobacterium longum	12.5	BiflongF BiflongR	6μM 6μM

실험예 3: 다중효소중합반응을 이용하여 프로바이오틱에서 분리한 균주 동정

상기에서 언급한 Jeanne Drisko의 변형 방법과 DNeasy® Tissue Kit을 사용하여 프로바이오틱 제품에서 들어있는 게놈 유전자를 추출하였다.

본 발명에서 사용한 6개의 프로바이오틱 제품은 국내시장에서 유통되고 있는 제품들로 모든 제품은 구입 즉시 기재된 보존 방법에 따라 냉동 또는 실온 보관하였다.

6개의 프로바이오틱 제품으로부터 분리된 유산균을 동정하기 위하여 균종 특이적 프라이머를 사용하였으며 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 애시도필러스, 비피도박테리움 롱검으로 동정된 PCR 증폭 산물은 도 2에 나타내었다. 표 5는 PCR 증폭 산물의 여부를 나타낸 것이다.

제품 1, 제품 5, 제품 6에서 직접 분리한 게놈 유전자에서는 PCR 증폭산물이 나타나지 않았다(도 2의 레인 2, 6, 7). 반면, MRS 배지에 배양한 후 게놈 유전자를 추출하여 다중효소중합반응을 수행한 결과 614 bp의 크기에 상응하는 락토바실러스 애시도필러스에 해당되는 밴드를 확인할 수 있었다(도 2의 레인 8, 12, 13).

다중효소중합반응법을 사용하여 프로바이오틱 제품들의 젖산균을 동정한 결과.

샘플 균주

제품 1

제품 2

제품 3

제품 4

제품 5

제품 6

L. rhamnosus

aD

bM

aD

bM

aD

bM

aD

bM

aD

bM

aD

bM

L. rhamnosus

-

-

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

B. bifidum

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-

-

-

-

-

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-

-

-

L. acidophilus

+

+

-

+

-

-

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-

-

+

-

+

B. longum

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-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

a D, 프로바이오틱 제품으로부터 직접 게놈유전자를 추출 b M, 프로바이오틱 제품을 MRS 배지에 배양한 후 그 배양물로부터 DNA를 추출 증폭산물 1 ~ 6의 전기영동 결과는 도 2에 도시함

실험예 4: 프로바이오틱 제품의 PCR 증폭 산물의 염기서열 분석

균종 특이적인 프라이머를 사용하여 얻은 프로바이오틱 제품의 PCR 증폭산물들의 염기서열을 분석하였다. 프로바이오틱 샘플의 PCR 증폭산물을 QIAquick^® 젤 추출용 키트(퀴아젠, 독일)를 사용하여 아가로우즈 젤로부터 추출하였다. pMD18-T 벡터(다카라, 일본)를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 클로닝하고 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) DH5α 균주에 형질전환시켰다. 재조합된 플라스미드를 포함한 이 콜라이(E. coli)를 선별하여 순수배양한 뒤 재조합된 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이것을 ABIPRISM 3700 DNA 애널라이저(퍼킨 앨머, 미국)로 염기서열을 분석한 후 벡터 NTI 프로그램을 사용하여 DNA 염기서열을 분석하고, 타겟으로 한 표준균주의 염기서열과 비교하였다.

예상대로 표준균주와 100% 일치하거나 거의 100%에 가까운 유사도가 있는 것으로 나타났다. 락토바실러스 람노서스 (accession No. AF243146)와 비교해 볼 때, 제품 2D와는 100% 일치하였고, 제품 2M과 제품 3D와는 99% 일치, 제품 3M과는 98% 일치함을 보였다. 락토바실러스 애시도필러스 (accession No. AY773947)와 비교해보면, 제품 1D, 제품 1M, 제품 2M, 제품 6M과는 100%일치하고 제품 5M과는 98% 일치함을 보이고 있다. NCBI GenBank database의 BLAST query를 이용하여 유사성을 비교해 본 결과 제품 5M는 락토바실러스 애시도필러스 균주 (accession No. AY763430)과 99% 일치하였다. 제품 4D는 비피도박테리움 롱검 (accession No. M58739)과 100% 일치했지만 제품 4M는 비피도박테리움 롱검 (accession No. M58739)과 1개의 뉴클레오티드가 차이를 보였다.

상기 결과로부터, 본 발명에서는 다중효소중합반응 분석법을 이용하여 프로바이오틱 제품으로부터 4가지 유산균을 동정하였고, DNA 시퀀싱을 통하여 그 결과를 다시 한 번 확인하였다. 기존의 방법들은 락토바실러스 속 균종간이나 비피도박테리움 속 균종 간의 동정 방법인 것에 반해, 본 발명의 다중효소중합반응을 이용한 동정방법은 락토바실러스 속 2종과 비피도박테리움 속 2종의 4가지 다른 유산균을 한 번의 반응으로 구분해 낼 수 있어서 단일 또는 이중 PCR과 비교해 볼 때, 시간과 비용을 줄일 수 있다. 따라서 이 방법은 프로바이오틱 제품의 표기 시스템의 신뢰도를 모니터하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.

상기 실시예와 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 다중효소중합반응 방법을 이용한 기능성 식품으로부터 유산균 검출방법에 관한 것으로, 본 발명의 특이 프라이머를 이용하여 락토바실러스 속 2종과 비피도박테리움 속 2종의 4가지 다른 유산균을 한 번의 반응으로 구분해 낼 수 있어서 단일 또는 이중 PCR과 비교해 볼 때, 시간과 비용을 줄일 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 프라이머를 이용하여 검사체 내에 혼재되어 있는 락토바실러스 속 균종과 비피도박테리움 속 균종을 동시에 신속, 정확하게 동정할 수 있으므로, 건강식품 및 의약품의 원료개발 및 프로바이오틱 제품의 표기시스템의 신뢰도를 모니터하는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 건강식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

1. 서열목록 서열번호 1 내지 8의 서열을 프라이머로 이용하여 다중효소중합반응을 실시하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilius), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 중 어느 하나의 유산균을 동정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 기능성 식품으로부터 유산균의 검출방법.
2. 삭제
3. 서열목록 서열번호 1과 2의 서열로 구성된, 기능성 식품으로부터 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 검출용 프라이머쌍.
4. 서열목록 서열번호 3과 4의 서열로 구성된, 기능성 식품으로부터 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 검출용 프라이머쌍.
5. 서열목록 서열번호 5와 6의 서열로 구성된, 기능성 식품으로부터 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilius) 검출용 프라이머쌍.
6. 서열목록 서열번호 7과 8의 서열로 구성된, 기능성 식품으로부터 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 검출용 프라이머쌍.

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