CN105349692B - 检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对，该引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，该引物检测的特异性良好、灵敏度高；本发明还提供了检测该菌株的方法，包括DNA提取、PCR扩增及电泳检测分析，该方法能够快速检测出菌株的数量，检测特异性高，能够区分Lactobacillus paracasei N1115(CGMCC4691)菌和同源性较高的其他菌株。本发明适用于对Lactobacillus paracasei N1115(CGMCC4691)菌株进行检测，进一步地对食品或乳制品中Lactobacillus paracasei N1115(CGMCC4691)菌株进行检测计数。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种检测植物乳杆菌的引物对及方法，具体地说是一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对及方法。
背景技术
Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 是具有优良益生特性的乳杆菌。该菌株在消化系统中具有优异的耐受胃酸、胆盐和牛磺胆酸钠水解的能力，其具有乳杆菌共同的特性，即为革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、不液化明胶、无运动性、能在pH4.5的BLB液体培养基中生长发育。只有在对Lactobacillus paracaseiN1115 (CGMCC4691) 进行准确定量的基础上，才能够更有针对性地深入了解适宜Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 体内定植的条件，从而更进一步地开发出具有相对更为优良的Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)体内定植率的产品，更好地发挥Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 的作用。
由于同种益生菌不同菌株之间的相似性超过了99%，常用的分子生物学手段很难从菌株水平对益生菌进行区分，因此，需要根据不同益生菌之间的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，并从菌株水平对该菌株进行分子标记，寻找特异性的检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对，该引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQID NO.2所示，该引物检测的特异性良好、灵敏度高；
本发明还提供了利用前述引物对检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法，包括DNA提取、PCR扩增及电泳检测分析，该方法能够快速检测出菌株的数量，检测特异性高，能够区分Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 菌和同源性较高的其他菌株。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对，该引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法，它按照如下的步骤顺序进行：
1）提取待测样品菌株DNA，得A；
2）以A为模板，以前述的引物对进行PCR反应，得B；
3）将B进行电泳检测，具有前述的引物扩增片段的样品中存在Lactobacillusparacasei N1115菌株。
作为本发明的一种限定，所述的PCR 扩增体系包括2×PCR Mix 10μL ,40mmol/L上游引物和下游引物各1μL，40 ng/μL的DNA模板1μL。
作为本发明的另一种限定，步骤2）所述的PCR反应程序为95℃变性5min；95℃变性1min，65℃退火45s，72℃延伸30s，循环30 次；72℃延伸5min，4℃保存。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对，该引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，该引物检测的特异性良好、灵敏度高；
本发明还提供了检测该菌株的方法，能够快速检测出菌株的数量，检测特异性高，能够区分Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 菌株和同源性较高的其他菌株。
本发明适用于对Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 菌株进行检测，进一步地对食品或者乳制品中Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 菌株进行检测计数。
附图说明
图1为 Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 菌株特异性引物和扩增的目的基因信息图；
图2 为Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)菌株的特异性扩增条带图；其中：Lane1为D2000Marker，Lane2为PCR产物, Lane3为具有目的片段的质粒DNA扩增产物，作为阳性对照, Lane4为无菌水扩增产物，作为阴性对照；
图3为Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)的Q-PCR 扩增标准曲线图；
图4为引物筛选试验中利用不同的引物对菌株的DNA扩增条带图（其中：M为D2000Marker， Lane1为副干酪乳杆菌N1115，Lane2为干酪乳杆菌CICC6117，Lane3为植物乳杆菌 JMCC0108，Lane4为鼠李糖乳杆菌JMCC1001）；
图5引物筛选试验中利用本发明提供的引物对菌株的DNA扩增条带图（其中：M为D2000Marker， Lane1为副干酪乳杆菌N1115，Lane2为干酪乳杆菌CICC6117，Lane3为：植物乳杆菌 JMCC0108，Lane4为鼠李糖乳杆菌JMCC1001）；
图6为不同退火温度下Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)菌株的特异性扩增条带图（其中：M为D2000Marker，Lane1为65℃退火样品，Lane2为68℃退火样品，Lane3为58℃退火样品，Lane4为55℃退火样品）。
具体实施方式
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。
实施例1 一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法
本实施例提供了一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法，待测样品以发酵乳制品为例，检测方法按照如下的步骤顺序进行：
1）样品中宏基因组DNA的提取：
采用液氮冻融-CTAB 法提取样品中宏基因组DNA；
①取1.0g样品洗涤处理，将洗脱的菌体置于1.5mL 离心管中，并立即将该离心管置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃ 水浴中融化（约5min），反复冻融3 次，得a；
②向a加0.1mL10%SDS 和10.0μL 10mg/mL 蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000rpm心10min，收集上清液转移至另一离心管中,得b；
③向上清液b中加入等体积的氯仿，于12000rpm 离心10min,得c；
④为了使沉淀、水相和有机相分层，吸取c中上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次（苯酚与氯仿的体积比为25：24），得上清液d；
⑤向d加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，沉淀总DNA，然后用70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶即得A，备用；
2）Q-PCR检测
①检测Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)的特异性引物序列如下：
SEQ ID No.2:5′-ttcaccagatggaaggactc-3′
SEQ ID No.3:5′- tcaatgttcgctgcctgt-3′；
②Q-PCR扩增、检测
应用已知数量的Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 通过Q-PCR 扩增制作标准曲线，如图3所示；由图3 可见，Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)标准品的Ct 值和拷贝数呈较好的线性关系，以模板初始拷贝数的对数为横坐标、Ct 值为纵坐标绘制出的荧光定量PCR 标准曲线方程为：Y=-3.45X+38.383（其中Y 代表Ct 值，X 代表模板初始拷贝数的对数），模板初始拷贝数与Ct 值之间的线性相关系数为0.9999，斜率为-3.45，所建立的标准曲线符合荧光定量PCR 的要求；
以A为模板，用上述特异性引物通过Q-PCR 扩增样品的基因组DNA，测定待测样品的Ct值。然后以标准曲线为依据，将所获得的待测样品的Ct 值代入标准曲线方程，可以确定待测样品中Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 菌株的量。结果与分析误差结果显示在下表1 中；
Q-PCR 反应体系：10mmol/L的上游引物，10mmol/L的下游引物，40 ng/μL的DNA模板；
Q-PCR 反应参数：95℃变性15min； 95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次。
表1 样品内Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 的数量
本实施例中所提供的特异性引物特异性良好、灵敏度高；检测该菌株的方法，能够快速检测出菌株的数量，检测特异性高。
实施例2 一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法
待测样品以发酵乳制品为例，检测方法按照如下的步骤顺序进行。
1）样品中宏基因组DNA的提取：
采用液氮冻融-CTAB 法提取样品中宏基因组DNA。
①取1.0g样品洗涤处理，将洗脱的菌体置于1.5mL 离心管中，并立即将该离心管置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃ 水浴中融化（约5min），反复冻融3 次，得a；
②向a加0.1mL10%SDS 和10.0μL 10mg/mL 蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000rpm离心10min，收集上清液转移至另一离心管中,得b；
③向上清液b中加入等体积的氯仿，于12000rpm 离心10min,得c；
④为了使沉淀、水相和有机相分层，吸取c中上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次（苯酚与氯仿的体积比为25：24），得上清液d；
⑤向d加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，沉淀总DNA，然后用70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶即得A，备用；
2）PCR扩增
①检测Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)的特异性引物序列如下：
SEQ ID No.2:5′-ttcaccagatggaaggactc-3′
SEQ ID No.3:5′- tcaatgttcgctgcctgt-3′；
②扩增
以提取后的DNA为模板，用上述特异性引物对进行PCR扩增反应；
扩增体系20μL ：2×PCR Mix 10μL ,40mmol/L上游引物和下游引物各1μL，40 ng/μL的DNA模板1μL，dd H2O 补足至20μL；
PCR 反应参数：95℃变性5min ； 95℃变性1min，65℃退火45s，72℃延伸30s，循环30 次； 72℃延伸5min，4℃保存；
Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691) 菌株特异性引物和扩增的目的基因如图1所示，方框中的基因信息为特异性引物；
3）琼脂糖凝胶电泳
将PCR 产物于1% 琼脂糖凝胶中以5V/cm 的电压，电泳20-30min，EB 染色，紫外拍照，检测扩增效果。其中设置以含有目的扩增片段的质粒DNA 作为模板的阳性对照，以灭菌水作为模板的阴性对照，根据在274bp 处是否出现预期性特征条带，确定样品中是否含有Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)，检测的结果如图2所示。
实施例3 Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)引物对的特异性检测
本实施例对本发明所提供的引物对的特异性进行了验证。验证方法如下：
挑选在分类学地位上与Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)同源性较高的已知菌种，如：Bacteroides fragilisJCM 11019T,Bifidobacterium animalis DSM10140,B.breve ATCC 15700T,B.Longum ATCC15697,Clostridium coccoides JCM 1395T,Enterococcus faecalis ATCC 19433T,E.faecium ATCC 19434T,Escherichia coli JCM1649T Lactobacillus acidophilus ATCC4356T,L.brevis ATCC 14869T,L.buchneri ATCC4005T,L.crispatus JCM 1185T,L.fermentum ATCC 14931T,L.gallinarum JCM 2011T,L.gasseri DSM 20243T,L.johnsoniiJCM 2012T,L.plantarum ATCC 14917T,L.reuteriJCM 1112T,L.rhamnosus ATCC 7469T，L.casei ATCC 393T，利用本发明所提供的引物通过PCR扩增方法分别扩增并通过琼脂糖凝胶电泳检测Lactobacillus paracasei N1115(CGMCC4691)菌株和上述所列的菌株。其中，DNA的提取方法、PCR扩增方法、琼脂糖凝胶电泳方法与实施例2相似，不同之处仅在于：菌种的种类不同。
检测结果表明，该引物只能扩增出Lactobacillus paracasei N1115(CGMCC4691)，不能扩增出其它菌株，所以该引物特异性良好。
实施例3 Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)引物对的灵敏度检测
本实施例对本发明所提供的引物对的灵敏度进行了验证。应用本发明所提供的引物对已知数量的Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)进行定量扩增实验，其中的DNA提取步骤以及PCR扩增步骤与实施例2相同。结果显示，当样品中Lactobacillusparacasei N1115 (CGMCC4691)的数量在1.65×104 cfu 到1.65×108 cfu时，该菌株定量结果线性关系良好并可以被准确定量。
实施例4 Lactobacillus paracasei N1115 特异引物筛选实验
使用DNAMAN7.0软件，对Lactobacillus paracasei N1115的pheS基因进行分析，设计引物，引物长度设为50-350bp。对设计的几百种引物对进行初步排除后，最终确定3对引物如下表所示
使用细菌基因组DNA提取试剂盒按照说明提取Lactobacillus paracasei N1115以及三株与Lactobacillus paracasei N1115遗传距离相近的菌株（如干酪乳杆菌CICC6117，植物乳杆菌 JMCC0108，鼠李糖乳杆菌JMCC1001）的DNA作为模板（DNA的提取与实施例1中的DNA提取方法相同），分别以三组引物进行PCR扩增。PCR扩增体系与扩增的条件与实施例2中相同。
PCR 反应后产物用1%的琼脂糖凝胶120v电压进行电泳，用BIO-RAD凝胶成像系统成像，琼脂糖凝胶使用用GoldView染色，以副干酪乳杆菌N1115能够扩增出目的条带且其它菌株无扩增产物的引物作为荧光定量PCR特异性引物。
实验结果如图4和图5所示。由图4、图5可知A组和B组引物特异性较差，且在其它相近菌种之间也出现了条带，而C组引物表现出良好的引物特异性，在扩增出明亮的目的片段的同时其它相近菌株均未出现扩增产物。
实施例5 PCR扩增过程中退火温度的优化实验
PCR扩增过程中退火温度对扩增产物的特异性有重要影响，主要为在一定的温度范围内，退火温度越高，扩增的特异性也就越高。退火温度越低，扩增产物的特异性也就降低。如果退火温度过高，引物与模板结合差，电泳条带差，甚至没有扩增。如果温度过低，扩增特异性差，杂带较多，背景深。本实施例为了探究最佳的退火温度，设计了68℃、65℃、58℃、55℃三个退火温度，以Lactobacillus paracasei N1115 DNA为模板，进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测。其中的DNA提取、琼脂糖凝胶电泳检测与实施例2相同，PCR扩增过程与实施例2相似，不同之处仅在于：退火温度不同。具体的实验结果见图6。
由图6可知，当PCR扩增条件的退火温度在65℃时，条带清晰且无非特异性扩增。
实施例1和2，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对，其特征在于：该引物对中，上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法，其特征在于，它按照如下的步骤顺序进行：
1)提取待测样品菌株DNA，得A；
2)以A为模板，以权利要求1中所述的引物对进行PCR反应，得B；
3)将B进行电泳检测，具有权利要求1所述的引物扩增片段的样品中存在Lactobacillus paracasei N1115菌株。
3.根据权利要求2中所述的检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法，其特征在于：所述的PCR扩增体系包括2×PCR Mix 10μL，40mmol/L上游引物和下游引物各1μL，40ng/μL的DNA模板1μL。
4.根据权利要求2中所述的检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法，其特征在于：步骤2)所述的PCR反应程序为95℃变性5min；95℃变性1min，65℃退火45s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸5min，4℃保存。
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