JP2010239874A - ビタミンb12定量用の乳酸菌及び該乳酸菌を用いたビタミンb12の定量方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】乳酸菌を使用して試料中のビタミンB12を定量する方法において、乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)NRIC0700株(受領番号:NITE AP-726)を使用する。
【選択図】図4
Description
本実施形態のビタミンB12定量用乳酸菌は、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)である。
(1)試料の調製
図2は、本実施形態のビタミンB12の定量方法に供される試料の調製方法の概要を説明した図である。ビタミンB12の定量に供される試料の調製方法は、日本食品標準成分表の分析マニュアルに基づき実施することができる。
図3は、本実施形態のビタミンB12の定量方法に使用される検量線の作成手順と上記(1)で調製した試料のビタミンB12量を定量する方法を説明した図である。ビタミンB12量の定量は、日本食品標準成分表の分析マニュアルに基づき実施することができる。
(1)供試菌株
ビタミンB12定量用乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)NRIC0700株(受領番号:NITE AP-726)、NRIC0705株(受領番号:NITE AP-727)、NRIC0755株(受領番号:NITE AP-728)、NRIC0756株(受領番号:NITE AP-729)及び従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ(Lactobacillus leichmannii)ATCC 7830 株を使用した。
供試菌株を表2に示すトマト寒天培地に接種し、37℃、24時間培養後、1〜2週間低温室で保存した。
トマト寒天培地に保存した供試菌株を表3に示すトマト培地に接種し、37℃、24時間培養した。これを2回行った。
トマト培地にて培養後、0.85 %の滅菌生理食塩水を用いて、菌体洗浄を2回行い、菌体量を一定にするため600 nmにおける透過率が80〜90 %となるように希釈し、接種菌液とした。
表4に示す組成からなるビタミンB12 定量用基礎培地(pH 6.0)1.25 mlにビタミンB12 標準液を加えて、必要に応じて蒸留水 でフィルアップし、全量2.5 mlとした。その後、121℃、5分間オートクレーブで滅菌したものを本培地とした。なお、ビタミンB12 標準液は、シアノコバラミン標準品を25%(v/v)エタノール溶液に溶かし、10 μg/mlの水溶液の361 nmの吸光度0.207を用いて希釈し、調製したものを使用した。
上記(4)で調製した接種菌液20 μlを上記(5)で調製したビタミンB12 定量用基礎培地に接種し、37℃、24時間培養した。
吸光度計(LKB社製のNOVASPEC II)を使用して、600 nmの波長で上記(6)で得られた培養液中の生育濁度を測定した。対照として無接種培地の測定値を差し引き、各濃度における吸光度を求めた。
図4は、各乳酸菌のビタミンB12の検量線を示す図である。R2は決定係数を意味し、値が1に近づくほど理論値に近い検量線であることを示す。図4に示すとおり、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)NRIC0700株(受領番号:NITE AP-726)、NRIC0705株(受領番号:NITE AP-727)、NRIC0755株(受領番号:NITE AP-728)、NRIC0756株(受領番号:NITE AP-729)の各乳酸菌は、従来ビタミンB12のバイオアッセイ法の指定菌として知られているラクトバチルス・ライヒマニ(Lactobacillus leichmannii)ATCC 7830 株よりも決定係数(R2)の値が高く、ビタミンB12のバイオアッセイの指示菌としての適性が高いことが判明した。
現在日本食品標準成分表の分析マニュアルにおいて選定されている線形回帰モデルは単回帰モデルである。しかし、線形回帰モデルは他にも対数容量モデルやロジスティック回帰モデルがあるため、供試菌株ごとに最も適した線形回帰モデルを選定することが望ましい。そこで、各供試菌株ごとに得られた検量線について、単回帰モデル、対数容量モデル、ロジスティック回帰モデルによる分析を行った。結果を表5に示す。
(1)試料抽出液の調製
試料として市販のブロイラー鶏もも肉及び市販の干し海苔を使用し、日本食品標準成分表分析マニュアルに従い、KCN法によるビタミンB12の抽出を行った。試料2 gに水40 ml、0.57 mol/l酢酸緩衝液10 mlと0.05%(w/v)シアン化カリウム溶液0.4 mlを加え、100℃、30分間煮沸抽出した。得られた抽出液を冷却した後、10%(w/v)メタリン酸溶液0.6 mlを加え、水で100 mlに定容し、ろ紙(アドバンテック社製、No.2)でろ過することにより試料抽出液を得た。
上記(1)で得られた試料抽出液から25 mlを分取し、pH 6.0に調整した後、水で50 mlに定容し、ろ紙(アドバンテック社製、No.2)でろ過することによりろ液を得た。ろ液を必要に応じて希釈したものを試料溶液Aとし、ビタミンB12定量用の試料とした。
上記(1)で得られた試料抽出液から25 mlを分取し、pH11〜12に調整した後、オートクレーブに121℃、30分間かけて滅菌した。冷却後、pH 6.0に調整し、水で50 mlに定容し、ろ紙(アドバンテック社製、No.2)でろ過することによりろ液を得た。ろ液を必要に応じて希釈したものを試料溶液Bとし、アルカリ耐性因子定量用の試料とした。
(1)本培地への分注
上記1(5)で調製したビタミンB12 定量用基礎培地1.25 mlに、上記2(2)で調製した試料溶液Aを1 ml加え、蒸留水を加え、全量を2.5 mlとした。その後は上記1(6)(7)と同様の要領で培養し、生育濁度を測定した。また、試料溶液Aに代えて、上記2(3)で調製した試料溶液Bについても実施した。
ビタミンB12 量は、検量線から求めたビタミンB12濃度に基づき、下記数式(1)から算出した。また、アルカリ耐性因子含量は、検量線から求めたアルカリ耐性因子濃度に基づき、下記数式(2)から算出した。そして、下記数式(3)に示すように、試料溶液AのビタミンB12 量から、試料溶液Bのアルカリ耐性因子量を差し引くことにより、最終的に試料中のビタミンB12含量を算出した。結果を表6に示す。
(1)試料を処理するときに使用する試薬の影響
試料を処理するときに使用する試薬(KCN、酢酸、メタリン酸)によって確度が影響を受けるか調べた。すなわち、検量線用に調製した各濃度のシアノコバラミン含有培地に、処理したシアノコバラミン標準液を一定量加え、供試菌株として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)NRIC0700株(受領番号:NITE AP-726)と、NRIC0755株(受領番号:NITE AP-728)を接種し、吸光度で生育濁度を測定し、その測定結果に基づいて添加回収率を算出し、確度が高い範囲を調べた。
上記(1)の結果に基づき、KCN法によるビタミンB12の抽出方法に使用する試薬の改良を行った。酢酸緩衝液の影響を低減させるため、酢酸緩衝液の濃度を0.57 mol/lから0.1 mol/lとした。すなわち、ビタミンB12の抽出に影響を与えず、かつ、検量線用の培地とビタミンB12量定量用の培地との酢酸緩衝液の濃度差が少なくなるように酢酸緩衝液の濃度を調整した。
Claims (5)
- 乳酸菌を使用してビタミンB12を定量するためのビタミンB12定量用乳酸菌であって、
前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)であることを特徴とする、
ビタミンB12定量用乳酸菌。 - 前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)NRIC0700株(受領番号:NITE AP-726)であることを特徴とする、
請求項1に記載のビタミンB12定量用乳酸菌。 - 乳酸菌を使用して試料中のビタミンB12を定量する方法において、
前記乳酸菌として、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)を使用することを特徴とする、
ビタミンB12の定量方法。 - 前記乳酸菌が、ラクトバシルス・デルブリュッキ・サブスピーシーズ・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)NRIC0700株(受領番号:NITE AP-726)であることを特徴とする、
請求項3に記載のビタミンB12の定量方法。 - 前記試料を、水と、酢酸緩衝液、シアン化カリウム溶液で処理する工程において、
前記酢酸緩衝液として、0.1mol/l酢酸緩衝液を使用することを特徴とする、請求項3又は4に記載のビタミンB12の定量方法。
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