ES2335529T3 - Bacteria nueva que pertenece al genero bifidobacterium y utilizacion de la misma. - Google Patents
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Abstract
Bifidobacterium bifidum YIT 10347 (FERM BP-10613).
Description
Bacteria novedosa que pertenece al género
Bifidobacterium y utilización de la misma.
La presente invención se refiere a un
Bifidobacterium bifidum novedoso que tiene un efecto de
destruir Helicobacter pylori y muestra una alta capacidad de
supervivencia en una bebida o alimento de leche fermentada y a la
utilización del mismo.
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Las bacterias que pertenecen al género
Bifidobacterium (en lo sucesivo en este documento,
denominadas "bacterias bífidus") son bacterias principales en
la flora bacteriana intestinal humana y se conoce que tienen efectos
favorables para la salud humana, tales como regulación de la
función intestinal incluyendo mejora en síntomas de estreñimiento o
diarrea, supresión del aumento del colesterol sérico, efecto de
activación del sistema inmune y similares. Están disponibles muchos
productos comerciales de bacterias Bífidus en formas de diversas
bebidas o alimentos de leche fermentada o preparaciones bacterianas
vivas, que establecen un mercado sólido. En particular, las bebidas
y alimentos de leche fermentada que tienen bacterias bífidus tienen
un sabor favorable y son adecuadas para la ingestión continua de
bacterias bífidus.
Con el avance reciente del estudio sobre la
eficacia de bacterias bífidus se observó que las bacterias bífidus
tienen un efecto antiulceroso; por ejemplo, se ha descrito que 3
especies de Bifidobacterium breve YIT 4014,
Bifidobacterium breve YIT 4043 y Bifidobacterium
bifidum YIT 4007 (FERM BP-791) muestran un
efecto antiulceroso en un modelo de rata con úlcera inducida por
ácido acético (documento no de patente 1). Además, se ha descrito
que administrando Bifidobacterium bifidum YIT 4007 en forma
de polvo seco, mejora la afección de pacientes que padecen úlcera
gástrica o úlcera duodenal y que Helicobacter pylori
desaparece de la mucosa gástrica (documento no de patente 2). Por
tanto, la utilización de las bacterias bífidus se ha esperado como
un agente preventivo o terapéutico para la infección por
Helicobacter pylori o como un agente preventivo o terapéutico
para gastritis, úlcera gástrica y úlcera duodenal. Además, se ha
descrito que el efecto del Bifidobacterium bifidum YIT 4007
que se ha mencionado anteriormente aumenta de acuerdo con el aumento
en el recuento de células viables a administrar (documento no de
patente 3). Para hacer un uso eficaz de la acción farmacológica de
Bifidobacterium bifidum YIT 4007, es necesario dejar que
tantas células vivas como sea posible alcancen el estómago y el
tracto intestinal.
Las bacterias bífidus que incluyen
Bifidobacterium bifidum YIT 4007 son sensibles a oxígeno, ya
que son anaerobios estrictos; particularmente, cuando se conservan
en una condición aerobia surge un problema ya que se reducen
rápidamente en el recuento de células viables; por lo tanto, fue
difícil administrar el número suficiente de bacterias bífidus.
Para resolver este problema se está realizando
un intento de usar diversos componentes para mejorar la capacidad
de supervivencia en conservación, tales como zumo de verduras de
calabaza, pepino, etc., ácido pirúvico, glutatión de tipo reducido
(documento de patente 1), glicerol, xilitol, etc. (documento de
patente 2), lactitol (documento de patente 3) y similares. Sin
embargo, la adición de estos componentes implica problemas tales
como un aumento en el coste de producción, disminución en el sabor
y similares y, por tanto, no se puede aplicar de forma sencilla. Se
está realizando otro intento de poner un producto fermentado que
contiene una bacteria bífidus en un recipiente compuesto por
material de envuelta impermeable a oxígeno para bloquear
completamente el contacto con el oxígeno. Sin embargo, tal
recipiente con una impermeabilidad a oxígeno perfecta todavía no se
ha proporcionado y, además, existe un problema ya que los
materiales que tienen una baja permeabilidad de oxígeno son malos
en flexibilidad de moldeo. Además, cuando se usa un material
compuesto para un recipiente compuesto por material poco permeable
a oxígeno, surgen problemas tales como que el tratamiento de sus
desechos es complicado, el recipiente per se es costoso y
similares y, por tanto, existe una gran limitación en su
utilización.
Se considera, por consiguiente, que una solución
final para mejorar la capacidad de supervivencia de bacterias
bífidus en bebidas y alimentos de leche fermentada, etc. es crear
una cepa de bacterias bífidus que tenga una alta capacidad de
supervivencia incluso en una condición aerobia; como ejemplos de
tales cepas bacterianas ya se han descrito Bifidobacterium
breve YIT 10001 (FERM BP-8205) (documento de
patente 4), Bifidobacterium breve SBR3212 (FERM
P-11915) (documento de patente 5),
Bifidobacterium bifidum YIT 4002 (FERM
BP-1038) (documento de patente 6) y similares.
Estas bacterias bífidus que tienen una alta
capacidad de supervivencia en condición aerobia, sin embargo,
mostraron una actividad mucho menor de destrucción de
Helicobacter pylori y actividad antiulcerosa en comparación
con Bifidobacterium bifidum YIT 4007. Tal cepa, que tiene una
alta capacidad de supervivencia incluso en una condición aerobia y
muestra una actividad de destrucción de Helicobacter pylori,
todavía no se ha creado y ha sido difícil suministrar el número
suficiente de células vivas para expresar un efecto antiulceroso en
el estómago o el tracto
intestinal.
intestinal.
Documento de patente 1:
JP-A-2003-250528
Documento de patente 2:
JP-A-11-137172
Documento de patente 3: Patente Japonesa Nº
3261571
Documento de patente 4: Folleto Internacional
Publicado WO 03/040350
Documento de patente 5: Patente Japonesa Nº
2922013
Documento de patente 6:
JP-B-61-19220
Documento no de patente 1: The Japanese Society
of Carbohydrate Research, 16th Carbohydrate Symposium, Pamphlet,
24-25 (1994)
Documento no de patente 2: Jpn Pharmacol Ther
Vol. 22, Nº 11, 253- 256 (1994)
Documento no de patente 3: Functional Foods and
Pharmacological Nutrients Vol. 2, Nº 3, 203-213
(2005).
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Por consiguiente, el propósito de la invención
es proporcionar una cepa novedosa de Bifidobacterium bifidum
que tenga un efecto de destruir Helicobacter pylori y que
muestre una alta capacidad de supervivencia incluso en el caso de
estar presente en un alimento o bebida de leche fermentada
almacenado en una condición aerobia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores trabajaron
diligentemente para resolver los anteriores problemas y observaron
que Bifidobacterium bifidum, que tenía un efecto de destruir
Helicobacter pylori y que mostró una alta capacidad de
supervivencia incluso en el caso de almacenarse en una condición
aerobia, se podría obtener cultivando y modificando
Bifidobacterium bifidum, que tiene un efecto de destruir
Helicobacter pylori en las condiciones específicas. Por
tanto, se llevó a cabo la invención.
Es decir, la invención proporciona
Bifidobacterium bifidum que tiene las siguientes
propiedades.
- (1)
- Tiene un efecto de destruir Helicobacter pylori.
- (2)
- Muestra una tasa de supervivencia del 10% o más en el caso de estar presente en una bebida o alimento de leche fermentada y estar almacenado en una condición aerobia a 10ºC durante 14 días.
La invención también proporciona un agente
preventivo o terapéutico para la infección por Helicobacter
pylori, un agente preventivo o terapéutico para gastritis y
úlcera, un agente preventivo o terapéutico para dolencia indefinida
en el estómago o un agente preventivo o terapéutico para hiperquilia
y reflujo gastroesofágico, que comprende el Bifidobacterium
bifidum que se ha mencionado anteriormente como un ingrediente
activo.
Además, la invención proporciona una bebida o
alimento, particularmente una bebida o alimento de leche fermentada,
que comprende el Bifidobacterium bifidum que se ha
mencionado anteriormente.
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Ya que el Bifidobacterium bifidum de la
invención es excelente en tasa de supervivencia incluso en el caso
de estar presente en una bebida o alimento de leche fermentada
almacenado en una condición aerobia, su efecto de destruir
Helicobacter pylori se puede mantener a lo largo de un
periodo prolongado.
Por tanto, el Bifidobacterium bifidum de
la invención se puede utilizar preferiblemente en la prevención o
el tratamiento de infección por Helicobacter pylori,
prevención o tratamiento de gastritis y úlcera, prevención o
tratamiento de dolencia indefinida en estómago o prevención o
tratamiento de hiperquilia y reflujo gastroesofágico. Además, el
Bifidobacterium bifidum de la invención se puede utilizar
preferiblemente en la producción de bebidas y alimentos que tienen
el efecto preventivo o terapéutico que se ha mencionado
anteriormente, particularmente bebida y alimento de leche
fermentada, y no es necesario que se ponga en un recipiente hecho de
un material de envuelta impermeable a oxígeno; por tanto, las
opciones de los recipientes son amplias.
\vskip1.000000\baselineskip
El Bifidobacterium bifidum de la
invención tiene un efecto de destruir Helicobacter pylori y
muestra una tasa de supervivencia del 10% o más en el caso de estar
presente en una bebida o alimento de leche fermentada y almacenado
en una condición aerobia a 10ºC durante 14 días. La expresión
"efecto de destruir Helicobacter pylori" indica que el
número de células de Helicobacter pylori disminuye debido a
una acción inhibidora para la adhesión de Helicobacter
pylori a la célula gástrica humana o una acción inhibidora
directa para el desarrollo de Helicobacter pylori. Como se
describe en este documento, la acción inhibidora para adhesión de
Helicobacter pylori a la célula gástrica humana significa
específicamente que cuando se añade Bifidobacterium bifidum
de la invención a las células procedentes del estómago humano en un
medio L-15 de Leibovitz a una tasa de
10^{8}-10^{9} UFC/ml y se preincubada a 37ºC
durante 2 horas y se añade a esto Helicobacter pylori a
10^{7} UFC/ml y se incuba a 37ºC durante 90 minutos y se deja
reposar a 4ºC durante una noche, entonces la adhesión de
Helicobacter pylori a la célula gástrica humana se inhibe el
5% o más, preferiblemente el 5-20%.
Alternativamente, puede significar que cuando 10^{7} UFC/ml de
Helicobacter pylori y 10^{8}-10^{9}
UFC/ml de Bifidobacterium bifidum de la invención se
preincuban en un medio L-15 de Leibovitz a 37ºC
durante 2 horas y la solución pre-incubada se añade
a las células procedentes del estómago humano y se incuba a 37ºC
durante 90 minutos y se deja reposar a 4ºC durante una noche,
entonces la adhesión de Helicobacter pylori a la célula
gástrica humana se inhibe el 5% o más, preferiblemente el
5-20%. La acción inhibidora del desarrollo de
Helicobacter pylori significa específicamente que cuando se
añaden 10^{5} UFC/ml de Helicobacter pylori y 10^{7}
UFC/ml de Bifidobacterium bifidum de la invención a un medio
de Brucella y se incuba a 37ºC durante 48 horas, el número de
células vivas de Helicobacter pylori se reduce a 10^{3}
UFC/ml o menos, preferiblemente 10-10^{3} UFC/ml.
La disminución del número de células de Helicobacter pylori
se refiere específicamente al número reducido de las células de
Helicobacter pylori que se adhieren a la célula gástrica,
mucina gástrica o tejido gástrico, el número reducido de las
células de Helicobacter pylori existentes en el tracto
intestinal tal como cavidad oral, cavidad nasal, garganta, esófago,
estómago, duodeno, intestino delgado, apéndice, intestino grueso,
recto y similares, el número reducido de las células de
Helicobacter pylori en incubación concurrente (cultivo mixto)
con Helicobacter pylori, disminución del valor de
\Delta^{13}CO_{2} en un ensayo de aliento con urea,
disminución del título de anticuerpos para Helicobacter
pylori en suero y disminución de la cantidad de antígeno para
Helicobacter pylori en heces. En este contexto, el número de
células de Helicobacter pylori incluye el número de células
vivas (UFC) de Helicobacter pylori, la cantidad de células
(reactividad con un anticuerpo anti-Helicobacter pylori), la
cantidad de genes (la cantidad de ADN o ARN capaz de reconocer
específicamente Helicobacter pylori), la cantidad o
actividad de un factor patógeno específico para Helicobacter
pylori (actividad de ureasa, toxina de vacuolación VacA, CagPAI
(isla de patogenia), la cantidad de antígeno
LPS-Lewis). Además, la tasa de supervivencia se
refiere a la proporción del recuento de células viables de un de
aliento con urea de cultivo o una bebida o alimento de leche
fermentada después de almacenamiento en una condición aerobia (10ºC,
14 días) a recuento de células viables antes del almacenamiento en
una condición aerobia. El recuento de células viables se puede
obtener de acuerdo con un método convencional. Por ejemplo, un caldo
de cultivo o una bebida o alimento de leche fermentada descritos
más adelante que se ha usado en almacenamiento en una condición
aerobia se diluye apropiadamente, después se aplica o se mezcla en
un medio de agar-ácido propiónico TOS, después se incuba a 37ºC de
forma anaerobia durante 72 horas y la colonia se cuenta para obtener
el número de células.
Específicamente, el Bifidobacterium
bifidum de la invención se puede obtener cultivando y
modificando Bifidobacterium bifidum como una cepa parental
que tiene un efecto de destruir Helicobacter pylori. En
cuanto a Bifidobacterium bifidum utilizable como una cepa
parental, no existe ninguna limitación particular siempre que tenga
un efecto de destruir Helicobacter pylori, por ejemplo, se
puede administrar Bifidobacterium bifidum YIT 4007 (se
depositó como FERM BP-791 el 2 de febrero de 1981
en el International Patent Organism Depository, National Institute
of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6,
1-1, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken)).
Ibaraki-ken)).
No existe ninguna limitación particular en un
método de cultivar y modificar; por ejemplo, se da un método de
condensación, un método de mutación por mutágeno tal como rayo
ultravioleta, nitrosoguanidina (NTG), ácido etilmetanosulfónico
(EMS) y similares.
Un ejemplo específico de cultivo y modificación
se explicará por un método de condensación. El Bifidobacterium
bifidum como una cepa parental que tiene un efecto de destruir
Helicobacter pylori se incuba en primer lugar en un medio de
leche para dar un caldo de cultivo, que se almacena en una condición
aerobia. Entre los organismos que sobrevivieron se selecciona una
cepa altamente resistente a oxígeno de los organismos
supervivientes. Más específicamente, se incuba Bifidobacterium
bifidum YIT4007 (FERM BP-791) en un medio de
leche para dar un caldo de cultivo, al que después se añade una
solución de jarabe para preparar una bebida o alimento de leche
fermentada; y después la bebida o alimento de leche fermentada se
almacena en una condición aerobia durante 21 días y se seleccionan
los organismos supervivientes. Usando los organismos seleccionados
como se ha mencionado anteriormente, se repite el mismo proceso de
tal forma que se concentran los organismos que tienen una alta
resistencia a oxígeno. Por tanto, se puede obtener el
Bifidobacterium bifidum de la invención que muestra una tasa
de supervivencia del 10% o más, preferiblemente del 10 al 40% en el
caso de estar presente en una bebida o alimento de leche fermentada
en una condición aerobia a 10ºC durante 14 días. Un ejemplo de
almacenamiento en condición aerobia incluye almacenamiento con
ventilación y agitación en la que se pasa una atmósfera a través de
un sistema de almacenamiento por agitación continua con una varilla
agitadora o cuchilla agitadora en el estado
aerobio.
aerobio.
El medio de cultivo de leche usado en el
anterior método de condensación se refiere a un medio de cultivo
que contiene leche como un ingrediente principal, donde la leche
incluye leche de vaca y el producto procesado de la misma, tal como
leche desnatada, y péptidos obtenidos de leche. No existe ninguna
limitación particular en la condición de cultivo para incubar
Bifidobacterium bifidum en un medio de cultivo de leche, que
se puede ajustar como sea apropiado de acuerdo con el estado de
desarrollo de Bifidobacterium bifidum; en general, es
apropiado realizar el cultivo de forma anaerobia a
30-40ºC, preferiblemente 33-37ºC.
Entre Bifidobacterium bifidum existe una cepa que es difícil
de cultivar debido a que su única fuente nutricional es leche; en
tal caso, se puede añadir una sustancia aceleradora del desarrollo
tal como diversos azúcares, extracto de levadura, péptidos y
similares.
Al almacenar el caldo de cultivo por el anterior
método de condensación en una condición aerobia, se pueden añadir
ingredientes opcionales tales como edulcorantes, por ejemplo,
jarabe, agente emulsionante, espesante (estabilizante), vitaminas,
minerales, acidificante, grasa de leche, sabor, extracto y
similares. Si se requiere, se pueden usar otros microorganismos
diferentes de Bifidobacterium bifidum en combinación en un
método conocido para obtener una forma de bebidas o alimentos de
leche fermentada para condensación. En tal caso, el entorno está
muy próximo a la forma final del producto en comparación con el caso
en el que se usa solamente un caldo de cultivo; por tanto, la
bacteria que muestra una alta capacidad de supervivencia en la forma
final del producto se puede concentrar de manera más eficaz.
Entre los ingredientes opcionales añadidos al
caldo de cultivo, el jarabe incluye azúcares tales como glucosa,
sacarosa, fructosa, isoglucosa, paratinosa, trehalosa, lactosa,
xilosa, azúcar de malta, miel, melazas y similares, alcohol de
azúcar tal como sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, paratinito,
jarabe de almidón reducido, jarabe de azúcar de malta reducido y
similares, edulcorante muy dulce tal como aspartamo, taumatina,
sucralosa, acesulfamo-K, estevia y similares. El
agente emulsionante incluye ésteres de ácidos grasos de sacarosa,
ésteres de ácidos grasos de glicerina, ésteres de ácidos grasos de
poliglicerina, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, lecitina y
similares. El espesante (estabilizante) incluye agar, gelatina,
carragenina, goma guar, goma de xantano, pectina, goma de
algarrobilla, goma gellan, carboximetilcelulosa, polisacáridos de
semilla de soja, propilenglicol de ácido algínico y similares. La
vitamina incluye vitamina A, vitaminas B, vitamina C, vitaminas E y
similares. El mineral incluye calcio, magnesio, cinc, hierro,
manganeso y similares. El acidificante incluye ácido cítrico, ácido
láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glucónico y similares.
La grasa de leche incluye nata, mantequilla, nata ácida y
similares. El sabor incluye de tipo yogurt, de tipo baya, de tipo
naranja, de tipo dulce de membrillo, de tipo perilla, de tipo
cítrico, de tipo manzana, de tipo menta, de tipo uva, de tipo
albaricoque, pera, galleta de crema, melocotón, melón, plátano,
tropical, de tipo hierba, té, café y similares. El extracto incluye
extracto de hierbas, terrones de azúcar moreno y
similares.
similares.
El microorganismo diferente de
Bifidobacterium bifidum incluye, por ejemplo, bacterias
pertenecientes al género Bifidobacterium tales como
Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium
catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium
animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium globosum y
similares; bacterias pertenecientes al género Lactobacillus
tales como Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus
gallinarum, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus
paracasei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus zeae,
Lactobacillus helveticus, Lactobacillus salivalius, Lactobacillus
gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus xeuteri,
Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii,
Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus
mali y similares; bacteria del género Streptococcus tales
como Streptococcus thermophilus; bacterias del género
Lactococcus tales como Lactococcus lactis subsp. lactis,
Lactococcus lactis subsp. cremoris y similares; bacterias del
género Enterococcus tales como Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium y similares; bacterias del género
Bacillus tales como Bacillus subtilis y levaduras
pertenecientes a los géneros Saccharomyses,
Torulaspora y Candida tales como Saccharomyses
cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Candida kefyr
y
similares.
similares.
Se reconoció que una de las cepas obtenidas por
el anterior método de condensación, de la cual la tasa de
supervivencia era particularmente alta, se depositó el 23 de junio
del 2005 como Bifidobacterium bifidum YIT 10347 (FERM
BP-10613) de forma internacional en el International
Patent Organism Depository, National Institute of Advanced
Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6,
1-1, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) (FERM
BP-10613 a su vez era de FERM
P-20569 depositado en la anterior Autoridad de
Depósito el 23 de junio del
2005).
2005).
Las propiedades bacteriológicas de
Bifidobacterium bifidum YIT 10347 (en lo sucesivo en este
documento denominado en ocasiones "YIT 10347") se muestran del
siguiente modo en comparación con la cepa parental
Bifidobacterium bifidum YIT 4007 (en lo sucesivo en este
documento denominado en ocasiones "YIT 4007").
\vskip1.000000\baselineskip
Cada cepa se inoculó en un medio agar MILS
(Iwata & Morishita, Letter in Applied Microbiology, vol. 9,
165-168, 1989) y se incubó a 37ºC de forma
anaerobia y se repitió el aislamiento de una única colonia. Por
tanto, se observaron el carácter de la colonia de la cepa
purificada y la forma morfológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando API 50CH (producto de bioMerieux Japón),
se inoculó una solución de la bacteria después de la incubación
durante una noche en cada sustrato de acuerdo con el método
descrito en el manual adjunto al kit. Esto se incubó a 37ºC en una
cámara de guantes anaerobia y se determinó el carácter de la
fermentación de azúcar en cada sustrato el 7º día después de la
incubación.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\global\parskip0.920000\baselineskip
El Bifidobacterium bifidum de la
invención tiene un efecto de destruir Helicobacter pylori,
particularmente, un efecto inhibidor de la adhesión de
Helicobacter pylori a las células gástricas humanas y un
efecto inhibidor del crecimiento de Helicobacter pylori.
Además, el Bifidobacterium bifidum de la invención tiene un
efecto protector para la mucosa gástrica, un efecto de mejorar el
valor de pepsinógeno sérico (PG) y un efecto de inhibir la
producción de interleucina (IL)-8 similar en la cepa
parental Bifidobacterium bifidum YIT 4007 como un
ejemplo.
Además, en bebidas y alimentos de leche
fermentada producidos usando bacterias de Bifidobacterium o
bacterias de ácido láctico, se observan algunos cambios con el
tiempo tales como aumento de acidez durante el almacenamiento, que
deterioran el sabor. Se conoce que este deterioro aumenta con la
edad cuando se usan disacáridos tales como sacarosa y,
particularmente, esto es señalable en una mayor concentración de
sólidos no grasos (SNF) de leche. Sin embargo, mediante el uso de
Bifidobacterium bifidum de la invención, el aumento de la
acidez se suprime durante el almacenamiento incluso en el caso del
uso de disacáridos tales como sacarosa en bebidas o alimentos de
leche fermentada, aunque este mecanismo no se entiende; por tanto,
se puede suprimir el deterioro de un sabor. En un caso específico,
cuando se usa el Bifidobacterium bifidum de la invención en
una bebida o alimento de leche fermentada que contiene el 3% en
masa o más, preferiblemente el 3-6% en masa de
sacarosa y el 8% en masa o más, preferiblemente el
8-12% en masa de porción de sólidos no grasos de
leche y se almacena a 20ºC durante 4 días en una condición aerobia,
la diferencia de la acidez antes (inmediatamente después de la
producción) y después del almacenamiento es 2 o menos,
preferiblemente 1 o menos. En esta situación, la acidez significa
la cantidad de 1/10 de solución acuosa de hidróxido sódico normal
(ml) requerida para neutralizar 9 g de una muestra.
El Bifidobacterium bifidum de la
invención que tiene las propiedades que se han mencionado
anteriormente, ya que tiene un efecto de destruir Helicobacter
pylori, se puede utilizar como un agente preventivo o
terapéutico para la infección por Helicobacter pylori. El
efecto destructor como una acción farmacológica del
Bifidobacterium bifidum de la invención aumenta con el
aumento del recuento de células viables y, por lo tanto, es deseable
usar Bifidobacterium bifidum de la invención en el estado de
organismos vivos. Además, ya que el Bifidobacterium bifidum
de la invención tiene una alta resistencia a oxígeno, se puede
enviar un gran número de células vivas al estómago y tracto
intestinal, se puede usar de forma adecuada en la prevención o la
terapia de infección por Helicobacter pylori, en la
prevención o la terapia de gastritis y úlceras, en la prevención o
la terapia de dolencia indefinida en el estómago o en la prevención
o la terapia de hiperquilia y reflujo gastroesofágico.
El Bifidobacterium bifidum de la
invención, ya que tiene un efecto preventivo para la mucosa gástrica
y un efecto de mejorar el valor de pepsinógeno sérico (PG), se
puede utilizar en el tratamiento o la mejora o la prevención de
úlcera por estrés, úlcera necrótica provocada por alcohol, etc.,
gastritis activa, gastritis dominante vestibular, gastritis
dominante en el cuerpo del estómago, pangastritis, adenoma gástrico,
pólipo hiperplásico, pólipo en glándulas fúndicas, gastritis
atrófica, reflujo gastroesofágico (esofagitis por reflujo),
dolencia indefinida en el estómago (incluyendo dispepsia no
ulcerosa) y cáncer de estómago relacionado estrechamente con la
infección por Helicobacter pylori.
En la mucos gástrica infectada por
Helicobacter pylori, se provoca. gastritis activa (gastritis
de corteza), que es una gastritis histológica caracterizada por
infiltración de neutrófilos y una gran cantidad de células
mononucleares Con el avance de la gastritis, se suprime el
crecimiento de las células, se degrada la función celular y la
mucosa se debilita, dando como resultado gastritis atrófica en la
que no se observa ninguna imagen inflamatoria activa. Con el
progreso de la gastritis atrófica, la metaplasia epitelial
intestinal provoca el aumento del riesgo de cáncer de estómago. Por
el otro lado, la descomposición tisular de la mucosa gástrica que
está provocada por una influencia de un factor de exposición tal
como ácido gástrico o pepsina o fármacos tales como AINE en un
estado de gastritis activa da como resultado úlcera péptica tal como
úlcera gástrica o úlcera duodenal. Por lo tanto, el
Bifidobacterium bifidum de la invención que tiene un efecto
de destruir Helicobacter pylori se puede utilizar como un
agente preventivo o terapéutico para gastritis o úlcera provocada
por Helicobacter pylori, particularmente para úlceras
gástricas y duodenales. Además, el Bifidobacterium bifidum
de la invención, ya que disminuye el valor de pepsinógeno sérico I
que se correlaciona intensamente con la secreción de ácido
gástrico, se puede utilizar como un agente preventivo o terapéutico
para hiperquilia o como un agente preventivo o terapéutico para
reflujo gastroesofágico (esofagitis por reflujo) que tiene lugar
después del tratamiento con destrucción de Helicobacter
pylori con un antibiótico.
La infección con Helicobacter pylori
induce una citocina inflamatoria tal como IL-8,
IL-1\beta o TNF-\alpha.
IL-8 trabaja haciendo que los neutrófilos migren a
la mucosa gástrica y provoca localmente una reacción inflamatoria.
La IL-1 \beta y el TNF-\alpha
actúan induciendo la producción de IL-8 y además
disminuyen la secreción de ácido gástrico y se dice que tienen
relación con la atrofia de la mucosa gástrica; por tanto, la
infección por Helicobacter pylori que tiene una alta
inducibilidad de citocinas provoca que el estado inflamatorio
crónico de la mucosa gástrica provoque daño en la función de la
mucosa gástrica. El Bifidobacterium bifidum de la invención
es capaz de suprimir la producción de IL-8 inducida
por infección con Helicobacter pylori o
TNF-\alpha. Además, el efecto inhibidor es mayor
que el de Bifidobacterium bifidum YIT 4007 como un ejemplo de
cepas parentales y aumenta de acuerdo con el aumento del recuento
de células viables.
Cuando se usa Bifidobacterium bifidum de
la invención como un agente preventivo o terapéutico para la
infección por Helicobacter pylori, un agente preventivo o
terapéutico para gastritis y úlcera, un agente preventivo o
terapéutico para dolencia indefinida en el estómago o un agente
preventivo o terapéutico para hiperquilia y reflujo
gastroesofágico, no existe ninguna limitación particular en la forma
de Bifidobacterium bifidum como un ingrediente activo
siempre que esté en un estado de organismo vivo, incluyendo
liofilizado o un producto de cultivo que contenga la bacteria.
El agente preventivo o terapéutico que se ha
mencionado anteriormente para la infección por Helicobacter
pylori, el agente preventivo o terapéutico para gastritis y
úlcera, el agente preventivo o terapéutico para dolencia indefinida
en el estómago o el agente preventivo o terapéutico para hiperquilia
y reflujo gastroesofágico se puede administrar en forma de
preparaciones farmacéuticas convencionales preparadas mezclando o
combinando el ingrediente activo Bifidobacterium bifidum con
vehículos sólidos o líquidos no nocivos para farmacéuticos. Tal
preparación incluye, por ejemplo, preparaciones sólidas tales como
comprimidos, gránulos, polvos o cápsulas, preparaciones líquidas
tales como soluciones, suspensiones o emulsiones y preparaciones
liofilizadas. Estas preparaciones se pueden preparar mediante
métodos de preparación conocidos en la tecnología farmacéutica. El
vehículo no nocivo que se ha mencionado anteriormente para
farmacéuticos incluye, por ejemplo, glucosa, lactosa, sacarosa,
almidón, manitol, dextrina, glicérido de ácidos grasos,
polietilenglicol, almidón de hidroxietilo, etilenglicol, ésteres de
ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno, aminoácidos, gelatina,
albúmina, agua, solución salina fisiológica y similares. Si se
requiere, se puede añadir de forma apropiada un excipiente o
excipientes conocidos tales como un estabilizante, agente
humectante, agente emulsionante, aglutinante, agente de ajuste de
la tonicidad, carga y similares. El ingrediente activo
Bifidobacterium bifidum se puede administrar como una única
preparación o en combinación con un inhibidor de secreción de ácido
gástrico usado para úlcera péptica, esofagitis por reflujo, reflujo
gastroesofágico o dispepsia funcional, incluyendo inhibidor del
receptor H_{2} tal como cimetidina, renitidina, famotidina,
roxatidina, nizatidina, lafutidina, ranitidina y similares;
inhibidores de la bomba de protones tales como omeprazol,
lansoprazol, rabeprazol y similares; un agente protector de la
mucosa gástrica tal como ecabet sódico, ornoprostilo, enprostilo,
misoprostol, cetraxato, sucralfato, sofalcona, troxipida,
plaunotol, teprenona, polaprezinc, clorhidrato de benexato, betadex,
rebamipida, sulpirida, selectina, maleato de irsogladina y
similares para administrar cada ingrediente activo de forma
concurrente. Como se usa en este documento, el agente protector de
la mucosa gástrica incluye fármacos o ingredientes que tienen un
efecto de mejorar factor protector, un efecto de mejora de la
expresión de ciclooxigenasa, un efecto de mejorar la producción de
prostaglandinas, un efecto de mejorar la secreción de moco, un
efecto de citoprotección, un efecto de aumentar el flujo sanguíneo
en la mucosa, un efecto de suprimir la secreción de ácido gástrico,
un efecto de mejorar la secreción del ión bicarbonato, un efecto
anti-gastrina, un efecto
anti-oxidación, un efecto de mejorar la generación
de selectina endógena y similares. El ingrediente activo
administrado de forma concurrente con Bifidobacterium bifidum
incluye un agente anti-muscarina tal como
clorhidrato de pirencepina, sulfato de atropina y similares; un
antiácido tal como carbonato de hidrógeno sódico, óxido de
magnesio, solución combinada de gel de hidróxido de
aluminio/hidróxido de magnesio, silicato de aluminio y similares;
materiales de origen natural tales como ácido ascórbico, ácido
úrico, bilirrubina de unión a albúmina,
\beta-caroteno, vitamina E, coenzima Q, glutatión,
cisteína, cistina, ácido pirúvico, fitina, ácido fítico, lignina,
saponina, ácido ferúlico, ácido
\gamma-aminobutírico,
\gamma-orizanol y similares; y polifenol tal como
isoflavona, antocianina, catequina, flavona, flavonol, flavanona,
calcona, xantona, proantocianina, polifenol de frutas, polifenol de
hoja de té, polifenol de cacao, polifenol de café, polifenol de té
verde y similares.
El Bifidobacterium bifidum que es un
ingrediente activo en el agente preventivo o terapéutico para la
infección con Helicobacter pylori, el agente preventivo o
terapéutico para gastritis y úlcera, el agente preventivo o
terapéutico para dolencia indefinida en estómago o el agente
preventivo o terapéutico para hiperquilia y reflujo gastroesofágico
en la invención ya se ha utilizado como alimento y se ha confirmado
su seguridad. Cuando se usa como agente preventivo o terapéutico
para la infección por Helicobacter pylori, el agente
preventivo o terapéutico para gastritis y úlcera, el agente
preventivo o terapéutico para dolencia indefinida en el estómago o
el agente preventivo o terapéutico para hiperquilia y reflujo
gastroesofágico, no existe ninguna limitación estricta en la
dosificación, aunque la dosificación preferida es cuando el recuento
de células viables es 10^{5} UFC -10^{13} UFC, particularmente
10^{9} UFC -10^{13} UFC por día.
El agente preventivo o terapéutico para la
infección por Helicobacter pylori, el agente preventivo o
terapéutico para gastritis y úlcera, el agente preventivo o
terapéutico para dolencia indefinida en el estómago o el agente
preventivo o terapéutico para hiperquilia y reflujo gastroesofágico
en la invención se puede usar no solamente como las preparaciones
farmacéuticas que se han mencionado anteriormente, sino también en
combinación con bebidas o alimentos. En el caso de la combinación
con bebidas o alimentos, se puede añadir a los mismos como tales o
junto con una diversidad de ingredientes nutricionales. Las bebidas
y alimentos se pueden utilizar como alimentos sanitarios o
materiales alimentarios útiles en la prevención o la mejora o el
tratamiento de la infección por Helicobacter pylori o en la
prevención o la mejora o el tratamiento de gastritis, úlcera,
dolencia indefinida en el estómago, hiperquilia o reflujo
gastroesofágico. Específicamente, cuando el agente preventivo o
terapéutico para la infección por Helicobacter pylori, el
agente preventivo o terapéutico para gastritis y úlcera, el agente
preventivo o terapéutico para dolencia indefinida en el estómago o
el agente preventivo o terapéutico para hiperquilia y reflujo
gastroesofágico se usa en combinación con bebidas o alimentos, los
aditivos apropiados que se pueden usar en bebidas y alimentos se
pueden usar para el moldeo en una forma adecuada para alimentos
mediante un método conocido, es decir, gránulos, granos,
comprimidos, cápsulas, pasta y similares o, alternativamente, se
puede añadir a una diversidad de alimentos, por ejemplo, productos
cárnicos procesados tales como jamón o salchichas; productos de
procesamiento de marisco tales como pasta de pescado hervida o
salchicha de pescado; pan, pasteles, mantequilla, leche seca y
similares o se puede añadir a bebidas tales como agua, zumo de
frutas, leche, refrescos, bebida de té y similares. El
Bifidobacterium bifidum de la invención, ya que tiene una
alta resistencia a oxígeno y no requiere una condición anaerobia
estricta, se puede adaptar a cualquier forma de bebidas y
alimentos. Las bebidas y alimentos incluyen piensos para uso
animal.
A las bebidas o alimentos que se han mencionado
anteriormente se pueden añadir una diversidad de materiales sin
procesar para productos alimenticios. Por ejemplo, se pueden añadir
diversos azúcares tales como glucosa, sacarosa, maltosa, fructosa,
tagatosa, lactosa, isoglucosa, trehalosa, trehallosa,
agarooligosacárido, nigerooligosacárido, galactooligosacárido,
fructooligosacárido, xilooligosacárido, rafinosa, staquiosa,
lactulosa, maltotriosa, isomaltooligosacárido, ciclodextrina, miel,
jarabe de arce, azúcar moreno y jarabe de batata; diversos
nutrientes tales como extracto cárnico, extracto de levadura,
extracto de carne de pescado, extracto de corazón, extracto de
hígado y péptidos; diversas fibras alimentarias o sus diversos
hidrolizados o extractos tales como ácido algínico, alginato
sódico, fucoidano, sargasano, fulcerano, funorano, porfirano,
laminarano, pulonano, goma tara, manano konjak, inulina,
\beta-glucano, quitina, quitosana, polidextrosa,
ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de heparano,
sulfato de polisacárido, gangliósido, sulfátido, ácido siálico,
ácido polisiálico, manano, galatano, fructano, xilano, arabinano,
arabinogalactano, glucomanano, galactomanano, fibra de remolacha,
fibra de harina de avena, fibra de trigo, fibra de semilla de soja,
fibra de arroz, fibra de grano de cebada, goma de xantano, fibra de
maíz, fibra de manzana, fibra de cítrico, fibra de zaragatona,
fibra de pino, fibra de pruno, fibra de plátano, celulosa de
bacteria de ácido acético, pared celular de bacteria de ácido
láctico, pared celular de Bifidobacterium, pared celular de
levadura, fructano de semilla de soja fermentada, colágeno y ácido
poliglutámico de semilla de soja fermentada; y diversos materiales
sin procesar que contienen una gran cantidad de fibra alimenticia
escasamente digestible o un ingrediente extraído de la misma tal
como salvado de trigo, salvado de grano de cebada, salvado de arroz,
salvado de avena, salvado de harina de avena, salvado de centeno,
zaragatona, arroz pulido, arroz sin pulir, achicoria, desechos de
semilla de soja, pulpa de manzana, almidón resistente, malta de
cebada, cáscara de maíz, célula de bacteria de ácido láctico,
célula de Bifidobacterium, célula de levadura de cerveza,
célula de levadura de vino, célula de levadura de panadero, heces
de vino, heces de sake, heces de fuente de soja, heces de cerveza,
koji de arroz, koji de trigo, koji de soja, koji rojo, koji
amarillo, mucosa de semilla de soja fermentada, extracto de semilla
de uva, miel, jalea real, propoleo, Clorella, espirulina, Euglena,
Aloe, wakame (un tipo de alga), egonori, iwanori, ogonori,
kawanori, tengusa, kombu, hon-dawara, arame, kajime,
Asakusa-nori, aonori, hijiki, lechuga de mar y
mozuku.
Además, se puede añadir lo siguiente a las
anteriores bebidas o alimentos: una diversidad de minerales o sus
sales tales como calcio, magnesio, cinc, hierro y dolomita; una
diversidad de ácidos o sales de los mismos, tales como ácido
cítrico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glucónico, ácido
succínico, ácido fumárico, ácido ascórbico, ácido láctico, ácido
acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido fosfórico y
aminoácidos; una diversidad de ingredientes de origen natural tales
como glutatión, fitina, ácido fítico, lignina, saponina, ácido
ferúlico, acido \gamma-aminobutírico,
\gamma-orizanol, calcona, flavanona, flavona,
flavonol, isoflavona, antociano, catequina, proantocianidina,
polifenol de hoja de té, curcumida, capsaicinoide, sesaminol,
gomalignano, teaflavina, \beta-dicetonas,
carotinoides, compuestos de azufre de alilo, isotiocianatos,
terpenos, clorofilas, ácidos grasos saturados, ácidos grasos
n-3 poliinsaturados, ácidos grasos
n-6 poliinsaturados, ácidos linoleicos conjugados,
fosfolípidos, esteroles vegetales, proteínas de huevo, proteínas de
leche, proteínas de arroz, proteínas de cebada, proteínas de trigo,
proteínas de carne de pescado y colágeno; una diversidad de
vitaminas tales como vitamina A, vitaminas B, vitamina C, vitaminas
D, vitamina E, vitaminas K, \beta-caroteno, ácido
retinoico y ácido fólico; una diversidad de extractos o sus
ingredientes de hierba sonajero, semillas de calabaza, semillas de
granada, hierba de San Juan, flor de la pasión, valeriana,
Pueraria mirifica, romero, menta, perejil, clavel chino,
toronjil, artemisa, cártamo, semillas de rábano Japonés, árbol de
café, Acanthopanax sieboldianum, fruta de calabaza vinatera,
piel de fruta cítrica, hoja de ginkgo, dokudami
(Saururaceae), árbol de azufaifa, Gouqizi, raíz de regaliz,
hongo rojo Reishi, ginseng Panax, guaraná, savia de mactis y
similares; una diversidad de plantas o extractos de las mismas
tales como té verde, té negro, té oolong, té hydrangea, té gymnema y
hoja de guayaba; y una diversidad de especias tales como pimienta,
pimienta Japonesa, cúrcuma, canela, mostaza, pimentón, cúrcuma,
Salvia officinalis, tomillo, albahaca, pimiento y nuez
moscada.
Además, se puede añadir lo siguiente a las
anteriores bebidas o alimentos: una diversidad de cereales
(cualquier parte incluyendo hoja, tallo, semilla, raíz, flor,
brote, cáscara, savia y fruta) o los componentes de sus semillas
germinadas o sus componentes extraídos tales como arroz, arroz
descascarillado, cebada, trigo, harina de avena, centeno, avena,
maíz, planta de tipo Amaranta, mijo de pájaros, mijo, trigo
sarraceno, lágrimas de Job, pasto shawa, sorgo, sorgo para grano,
kudzu común y mandioca; una diversidad de verduras (cualquier parte
incluyendo hoja, tallo, semilla, raíz, flor, brote, cáscara, savia y
fruta) o sus semillas germinadas o sus componentes extraídos tales
como calabaza, pepino, esponja vegetal, jengibre mioga, apio,
berenjena, cebolla, ajo, aguacate, judía Azuki, judía Azuki blanca,
judía común, frijol, guisante, judía pinta, judía chanamame,
semilla de soja blanca, semilla de soja marrón, semilla de soja
verde, semilla de soja joven, judía mung, haba, judía de daifuku,
judía rennzu, lenteja roja, batata morada, Ashitaba, kale, cúrcuma,
diente de león, patata, batata, taro, konjak, ñame, berenjena,
tomate, melón de quinina, pimienta, sésamo, repollo, calabaza de
china, brócoli, coliflor, lechuga, jengibre, bardana, aroide,
calabaza, brote de árbol angélica Japonesa, rábano Japonés, rábano
picante Japonés, guindilla, zanahoria, espinaca, lirio, cebolleta,
perilla, cebolla de tallo blanco, ajo cebollino, pastinaca, capa de
la reina japonesa, ajo rojo, repollo Chino, perejil, albahaca,
helecho común, cola de caballo menor, helecho real y brotes de
bambú; hongos o sus componentes extraídos tales como Shiitake,
champiñón, Maitake, colibia de pie aterciopelado, oreja de madera,
Hatakeshimeji, Bunashimeji, Nameko, jirbola, Eringii y Matsutake;
frutas (cualquier parte incluyendo hoja, tallo, semilla, raíz, flor,
brote, cáscara, savia y fruta) o sus componentes extraídos tales
como uva, caqui, limón, manzana, cereza, ciruela, fresa, naranja,
guayaba, plátano, arándano, mora, arándano agrio, frambuesa, baya de
gaulteria, fresa China, feijoa, tomatera arboréa, acerola,
aceituna, coco, lima, seakuwasar, melón, melocotón, fresa China,
lichi, mango, Yuzu, papaya, piña, pera, ciruela, pomelo, dulce de
membrillo, albaricoque, albaricoque Japonés, Natsumikan, níspero
del Japón, mandarina, granada, terminalia beberica, sandía,
ciruela Japonesa, ciruela Europea y fruta del kiwi; y una
diversidad de nueces (cualquier parte incluyendo hoja, tallo,
semilla, raíz, flor, brote, cáscara, savia y fruta) o sus
componentes extraídos tales como almendra, anacardo, cacahuete,
piñón, nuez de macadamia, castaña, nuez de ginkgo, nuez de nogal,
cacao y café.
Además se pueden añadir proteínas de leche o sus
hidrolizados tales como caseína o proteína sérica o componentes de
leche tales como péptidos de leche, aminoácidos, suero, leche de
mantequilla, grasas de leche, la membrana de esférula grasa de
leche, lactoferrina u oligosacáridos que contienen ácido siálico a
las anteriores bebidas o alimentos.
Además, se pueden añadir los siguientes
materiales sin procesar alimenticios que tienen un efecto bacteriano
anti-pílori a las anteriores bebidas o alimentos:
el producto de la reacción de Maillard, melanoidina, proteína de
yema de pollo que contiene un anticuerpo de huevo
anti-pylori, cacao, chocolate, café, té verde, té
oolong, té negro, infusión de cebada en percha, vino, cerveza, vino
de arroz Shaoxing, saque y etanol.
Entre las anteriores bebidas o alimentos, se
prefiere leche fermentada, bebida de bacteria de ácido láctico,
leche de soja fermentada, zumo de frutas fermentado o líquido
vegetal fermentado, que contiene Bifidobacterium bifidum en
forma de células vivas como un ingrediente activo. Estas bebidas o
alimentos de leche fermentada se pueden preparar mediante un método
conocido, por ejemplo, se puede inocular Bifidobacterium
bifidum e incubar solo o de forma concurrente con otro
microorganismo en un medio de leche esterilizada y el producto se
homogeneiza para producir una base de leche fermentada.
Posteriormente, a esto se añade una solución de jarabe preparada
por separado y se homogeneiza con un homogeneizador, a lo que se
añade además un sabor o un material sin procesar de alimento para
producir el producto final. Por tanto, la leche fermentada
resultante se puede formular en cualquier tipo de producto
incluyendo tipo plano, tipo blando, tipo de sabor de frutas, forma
sólida y forma líquida.
Cuando las bebidas o alimentos de leche
fermentada se preparan usando Bifidobacterium bifidum en
combinación con una o más especies de bacterias de ácido láctico
seleccionadas entre bacterias Lactobacillus, bacterias
Streptococcus y bacterias Lactococcus tienen un mejor
sabor y, por tanto, permiten la bebida continua, lo que es
preferible.
Además, en el Bifidobacterium bifidum de
la invención, el aumento de la acidez durante el almacenamiento se
suprime incluso en el caso de usar un edulcorante tal como un
disacárido, particularmente sacarosa, y se suprime el deterioro del
sabor y, por consiguiente, se puede utilizar de forma adecuada para
bebidas o alimentos de leche fermentada que contienen los
anteriores aditivos.
Hasta ahora, las bebidas o alimentos que
contienen una bacteria bífidus se han puesto principalmente en
recipientes compuestos por un material de envuelta impermeable a
oxígeno tal como vidrio o papel recubierto de aluminio. Sin
embargo, el Bifidobacterium bifidum de la invención tiene una
propiedad de alta resistencia a oxígeno y no requiere una condición
anaerobia estricta; por tanto, una bebida o alimento que contiene
este organismo se puede poner en cualquier tipo de recipiente, el
material de envuelta de recipiente puede ser permeable a oxígeno o
impermeable a oxígeno. Ya que un material de envuelta permeable a
oxígeno es menos caro y tiene una mayor flexibilidad de moldeo que
un material de envuelta impermeable a oxígeno al preparar un
recipiente, es preferible usar un recipiente compuesto por un
material de envuelta permeable a oxígeno. Tal recipiente compuesto
por un material de envuelta permeable a oxígeno incluye aquellos en
los que la cantidad de oxígeno permeable por recipiente es 0,05 ml
o más/24 h atm a 25ºC (por ejemplo, recipiente de poliestireno (área
superficial de poliestireno 125,6 cm^{2}, área superficial de
tapón de aluminio 5 cm^{2} (la cantidad de oxígeno que penetra
por la porción de tapa de aluminio es 0 ml)): 2,1 ml/24 h atm a
25ºC; recipiente de polietileno de baja densidad (área superficial
de polietileno de baja densidad 125,6 cm^{2}, área superficial de
tapón de aluminio 5 cm^{2} (la cantidad de oxígeno que penetra
por la porción de aluminio es 0 ml)): 1,4 ml/24 h atm a 25ºC;
recipiente de polietileno de alta densidad (área superficial de
polietileno de alta densidad 125,6 cm^{2}, área superficial de
tapón de aluminio 5 cm^{2} (la cantidad de oxígeno que penetra por
la porción del tapón de aluminio es 0 ml)): 0,63 ml/24 h atm a
25ºC; recipiente de tereftalato de polietileno (área superficial de
tereftalato de polietileno 125,6 cm^{2}, área superficial de tapón
de polietileno de baja densidad 5 cm^{2}): 0,08 ml/24 h atm a
25ºC; recipiente compuesto de etilenvinil
alcohol-polietileno de baja densidad (área
superficial de etilenvinil alcohol 125,6 cm^{2}, área superficial
de tapa de polietileno de baja densidad 20,9 cm^{2}): 0,23 ml/24
h atm a 25ºC; recipiente compuesto de etilenvinil
alcohol-polietileno de alta densidad (área
superficial de etilenvinil alcohol 125,6 cm^{2}, área superficial
de tapa de polietileno de alta densidad 20,9 cm^{2}): 0,10 ml/24
h atm a 25ºC, etc.) (la cantidad de oxígeno que penetra se muestra
por 100 ml de recipiente de volumen en todos los casos).
La invención se explicará con más detalle
mediante los siguientes Ejemplos y Ejemplos de Ensayo que no tienen
por objeto ser una limitación de la misma.
Ejemplo
1
Se inoculó Bifidobacterium bifidum YIT
4007 (FERM BP-791) como una cepa parental en leche
desnatada que contenía el 14% en masa de porción de sólidos no
grasos de leche y se incubó a 37ºC hasta pH 4,8 para dar una
solución de células. A esta solución de células se añadió una
solución de Streptococcus thermophilus YIT 2021 que se había
inoculado por separado y se había incubado en leche desnatada que
contenía el 14% en masa de porción de sólidos no grasos de leche a
37ºC hasta pH 4,3 (proporción de mezcla: 20 : 1) y finalmente se
añadió a esto un jarabe que contenía isoglucosa de tal forma que la
concentración final era del 3% en masa, produciendo una bebida o
alimento de leche fermentada.
Esta bebida o alimento de leche fermentada se
conservó en una condición aerobia del siguiente modo y se
seleccionaron los organismos que tenían una propiedad de alta
resistencia a oxígeno. La bebida o alimento de leche fermentada que
se había preparado anteriormente (10 l) se puso en un tanque de 10
l, en el que introdujo aire a una velocidad de 7 l/min de tal forma
que la concentración de oxígeno disuelto era 12 mg/l o superior y se
conservó a 2ºC con agitación a 60 rpm. Después del transcurso de 21
días, las células supervivientes se recogieron como cepas
parentales y se preparó una solución celular del mismo modo que
anteriormente, que se usó posteriormente en la preparación de una
bebida o alimento de leche fermentada. Esta bebida o alimento de
leche fermentada se conservó a 2ºC con ventilación y agitación
durante 21 días. Esta operación se repitió 3 veces para concentrar
cepas que tenían una alta capacidad de supervivencia; las células
supervivientes del procedimiento de la 3ª concentración se
aplicaron en un medio de agar-ácido propiónico TOS (Yakult.
Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) para aislar 24 cepas, cada una
como una colonia individual.
Mediante el uso de una de las anteriores cepas
aisladas y la parental YIT 4007 se prepararon bebidas o alimentos
de leche fermentada del mismo modo que anteriormente. Estos (100 ml
cada uno) se pusieron respectivamente en un recipiente de volumen
de 100 ml compuesto por un poliestireno permeable a oxígeno (área
superficial de poliestireno 125,6 cm^{2}; la cantidad de oxígeno
que penetra (por recipiente) 2,1 ml/24 h atm, 25ºC) y se almacenó a
10ºC (en condición aerobia). Se recontaron los números de células
inmediatamente después de la preparación y después del
almacenamiento y se comparó su capacidad de supervivencia. Por
tanto, se obtuvo YIT 10347 como un microorganismo que tenía una
mayor capacidad de supervivencia que YIT 4007. Como se muestra en
la Tabla 3, la tasa de supervivencia 14 días después del
\hbox{almacenamiento era del 30% en YIT 10347 en comparación
con el 2% en YIT 4007.}
Ejemplo
2
Mediante los siguientes experimentos y la
comparación de las propiedades de colonias, la forma de los
organismos y las propiedades en la fermentación de azúcar se
confirmó que Bifidobacterium bifidum YIT 10347 es una cepa
cultivada y mejorada de Bifidobacterium bifidum YIT 4007 como
una cepa parental.
Se extrajeron los ADN de 1 ml de la solución de
células de Bifidobacterium bifidum YIT 10347 e YIT 4007 de
acuerdo con un método de cloruro de bencilo (Nuc. Acid. Res 21,
5279-5280 (1993)) usando perlas de vidrio. Las
especies de los organismos se confirmaron mediante un método de PCR
usando los cebadores específicos para Bifidobacterium
bifidum (FEMS Microbiol. Letts. 167, 113-121
(1998)) y los anteriores ADN como moldes. Como resultado, se
observó amplificación específica de Bifidobacterium bifidum
en ambas cepas, identificando ambas cepas como pertenecientes a
Bifidobacterium bifidum (Figura 1).
BiBIF-1 (SEC ID Nº: 1)
- \quad
- 5' -CCACATGATCGCATGTGATTG-3'
BiBIF-2 (SEC ID Nº: 2)
- \quad
- 5' -CCGAAGGCTTGCTCCCAAA-3'
Usando como moldes el ADN extraído del mismo
modo que anteriormente, los respectivos organismos se compararon
mediante el uso de 6 miembros de cebadores (Nuc. Acid. Res 20,
5137-5142 (1992)). Ya que YIT 4007 e YIT 10347
muestran el mismo patrón de bandas en todos los cebadores, se
sugirió que ambas cepas están estrechamente relacionadas
genéticamente. La Figura 2 muestra el patrón de bandas de los
cebadores A y E que muestran una diversidad de patrones de
bandas.
Cebador A (SEC ID Nº: 3): CCGCAGCCAA
Cebador B (SEC ID Nº: 4): AACGCGCAAC
Cebador C (SEC ID Nº: 5): GCGGAAATAG
Cebador D (SEC ID Nº: 6): GAGGACAAAG
Cebador E (SEC ID Nº: 7): CGAACTAGAC
Cebador F (SEC ID Nº: 8): GTAGACAAGC
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un bloque de agarosa preparado mezclando caldos
de cultivo de ambas cepas con agarosa de bajo punto de fusión
(agarosa LMP (preparada por BIO-RAD) se liso con
lisozima y después de la desproteinización con una solución
proteolítica (Proteinasa K), se lavó con un tampón de lavado (Tris
20 mM, EDTA 50 mM). Posteriormente, 60 unidades de cada enzima de
restricción de XbaI (secuencia de reconocimiento: T'CTAGA), Hind III
(secuencia de reconocimiento: AA'GCTT) y Vsp I (secuencia de
reconocimiento: AT'TAAT) (todas preparadas por Takara) se añadió al
bloque de agarosa, se dejó reposar durante una noche a 4ºC y después
se dejó reaccionar para el tratamiento enzimático a 37ºC durante 24
horas. Después del tratamiento con las enzimas, el producto se
sometió a electroforesis de campo pulsado en gel de agarosa del 1%
en masa (PFC Agarosa; preparada por BIO-RAD) usando
CHEF MAPPER (preparado por BIO-RAD). Después de la
electroforesis, el gel se tiñó con 0,5 mg/l de solución de bromuro
de etileno durante 30 minutos, después se decoloró con agua
destilada durante 30 minutos y se fotografió bajo rayo ultravioleta
para analizar a simple vista. En todas las enzimas de restricción,
los resultados del análisis RFLP en ambas cepas eran completamente
idénticos (Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Mediante el uso de Bifidobacterium
bifidum YIT 10347 e YIT 4007, se prepararon bebidas o alimentos
de leche fermentada del siguiente modo. Es decir, las anteriores
cepas de Bifidobacterium bifidum respectivamente se
inocularon en una cantidad del 2% en masa en leche desnatada que
contenía el 14% en masa de porción de sólidos no grasos de leche y
se incubó a 37ºC hasta pH 4,8 y después se homogeneizó a 15 MPa para
dar una solución celular A. Por otro lado, se inoculó
Streptococcus thermophilus en el 0,1% en masa en leche
desnatada que contenía el 14% en masa de porción de sólidos no
grasos de leche, se incubó a 37ºC hasta pH 4,3 y se homogeneizó a
15 MPa para dar una solución de células B. Posteriormente se preparó
una solución de jarabe que contenía sacarosa de tal forma que la
concentración final de la mezcla fue del 4% en masa. La solución de
células A, la solución de células B y la solución de jarabe se
mezclaron a la proporción de 55 : 3 : 42 para preparar leche
fermentada que contenía el 8,1% en masa de porción de sólidos no
grasos de leche.
La leche fermentada (100 ml cada una) preparada
como anteriormente se puso en un recipiente combinado de
papel-aluminio impermeable a oxígeno de volumen de
100 ml (área superficial 143 cm^{2}; permeabilidad de oxígeno (por
recipiente) 0 ml/24 h atm, 25ºC) y un recipiente de poliestireno
permeable a oxígeno (área superficial 125,6 cm^{2}; permeabilidad
de oxígeno (por recipiente) 2,1 ml/24 h atm, 25ºC), respectivamente,
y se conservó a 10ºC durante 14 días. El número de células se contó
inmediatamente después de la preparación y después del
almacenamiento, respectivamente, para comparar la capacidad de
supervivencia de Bifidobacterium bifidum. En este ensayo, el
recipiente combinado de papel-aluminio corresponde
al almacenamiento en condición anaerobia y el recipiente de
poliestireno corresponde al almacenamiento en condición aerobia.
Los resultados indicaron que la tasa de
supervivencia de YIT 4007 en el recipiente de poliestireno permeable
a oxígeno era del 2%, pero que la de la cepa YIT 10347 en el
recipiente de poliestireno permeable a oxígeno era del 34%,
indicando que YIT 10347 tienen un mayor tasa de supervivencia que
YIT 4007 (Tabla 4).
Ejemplo
4
Mediante el uso de Bifidobacterium
bifidum cepas YIT 10347 e YIT 4007, respectivamente, se
prepararon bebidas o alimentos de leche fermentada del siguiente
modo. Es decir, las anteriores cepas YIT 10347 e YIT 4007 se
inocularon respectivamente en una cantidad del 2% en masa de leche
desnatada que contenía el 14% en masa de porción de sólidos no
grasos de leche y se incubó a 37ºC hasta pH 4,8 y después se
homogeneizó a 15 MPa para dar una solución de células A. Por otro
lado, Streptococcus thermophilus se inoculó en el 0,1% en
masa de leche desnatada que contenía el 14% en masa de porción de
sólidos no grasos de leche, se incubó a 37ºC hasta pH 4,3 y se
homogeneizó a 15 MPa para dar una solución de células B.
Posteriormente, se preparó una solución de jarabe que contenía
sacarosa (concentración final: 4,2% en masa) o isoglucosa
(concentración final: 5,6% en masa) como edulcorante. La solución
de células A, la solución de células B y la solución de jarabe se
mezclaron en la proporción de 55 : 3 : 42 para preparar una bebida
o alimento de leche fermentada que contenía el 8,1% en masa de
porción de sólidos no grasos de
leche.
leche.
La bebida o el alimento de leche fermentada
preparada anteriormente (100 ml) se puso en el mismo recipiente de
poliestireno que en el Ejemplo 1 y se almacenó a 20ºC durante 4 días
(en condición aerobia). Inmediatamente después de la preparación y
después del almacenamiento, se midieron la acidez y el pH y se
evaluó el sabor por 10 sujetos. En este ensayo, los criterios para
la evaluación del sabor fueron los siguientes.
Los resultados indicaron que cuando se usó
sacarosa como un edulcorante, la cepa YIT 10347 mostró un menor
cambio en la acidez que la cepa YIT 4007 incluso después de
almacenamiento a 20ºC durante 4 días y el sabor también era mejor
debido a que el olor del ácido acético y la fermentación era más
débil. Por otro lado, cuando se usó isoglucosa como un edulcorante,
no había diferencia entre las cepas YIT 4007 e YIT 10347 en el
cambio de acidez y sabor después del almacenamiento a 20ºC durante
4 días (Tabla 5 y Tabla 6).
\vskip1.000000\baselineskip
- (Puntuación)
- (Evaluación)
- +2:
- sabor muy bueno
- +1:
- sabor bueno
- \pm0:
- ninguna preferencia
- -1:
- sabor no satisfactorio
- -2:
- sabor malo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se disolvieron polvo de leche entera (70 g) y
péptido de leche (0,1 g) en 290 g de agua y se esterilizaron a
135ºC durante 3 segundos, de lo cual se inoculó el 2% en masa de
Bifidobacterium bifidum YIT 10347 y se incubó a 37ºC hasta
pH 4,8 y se homogeneizó a 15 MPa para dar 360 g de una solución de
células A. Por otro lado, 6 g de leche desnatada se disolvieron en
24 g de agua y se esterilizaron a 120ºC durante 3 segundos, después
de lo cual se inoculó el 0,1% en masa de Streptococcus
thermophilus YIT 2021, se incubó a 37ºC hasta pH 4,3 y se
homogeneizó a 15 MPa para dar 30 g de una solución de células B.
Además se disolvieron en sacarosa (50 g), carboximetilcelulosa (5
g), goma gellan (1 g), suclarosa (0,1 g), ácido
DL-málico (0,5 g y sabor (1 g) en agua, a lo que se
añadió agua para preparar el total de 610 g; esto se esterilizó a
120ºC durante 3 segundos para dar una solución de jarabe. La
solución de células A, la solución de células B y la solución de
jarabe se mezclaron y se pusieron en un recipiente combinado de
etilenvinil alcohol-polietileno de baja densidad de
100 ml (área superficial de etilenvinil alcohol 125,6 cm^{2}, la
superficie de porción de tapa de polietileno de baja densidad, 20,9
cm^{2}; la cantidad de oxígeno que penetra (por recipiente) 0,23
ml/24 h atm, 25ºC) para dar una bebida de bacteria de ácido láctico
que contenía el 0,5% en masa de porción de sólidos no grasos de
leche. El número de células inicial de YIT 10347 en la bebida de
bacteria de ácido láctico era 1,3 x 10^{9} UFC/ml.
Cuando esta bebida de bacteria de ácido láctico
se almacenó a 10ºC durante 14 días, la tasa de supervivencia de YIT
10347 era del 14% y el sabor era favorable. Además, cuando se
almacenó a 20ºC durante 4 días, el cambio de acidez era de tan sólo
0,6 y no se reconoció deterioro del sabor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se disolvió leche desnatada (80 g) en 470 g de
agua y se esterilizó a 135ºC durante 10 segundos, después de lo
cual se inoculó el 2% en masa de Bifidobacterium bifidum YIT
10347, se incubó a 37ºC hasta pH 4,8 y se homogeneizó a 15 MPa para
dar 550 g de una solución de células A. Por otro lado, 5 g de leche
desnatada se disolvieron en 25 g de agua y se esterilizaron a 120ºC
durante 3 segundos, después de lo cual se inoculó el 0,1% en masa
de Streptococcus thermophilus YIT 2021, se incubó a 37ºC
hasta pH 4,3 y se homogeneizó a 15 MPa para dar 30 g de una
solución de células B. Además, 60 g de isoglucosa y 5 g de
carboximetilcelulosa se disolvieron en agua, a lo cual se añadió 1
g de sabor, a la mezcla se añadió adicionalmente agua de tal forma
que la mezcla se convirtió en el total de 420 g. Después, la mezcla
se esterilizó a 120ºC durante 3 segundos para dar una solución de
jarabe. La solución de células A, la solución de células B y la
solución de jarabe se mezclaron y se pusieron en el mismo
recipiente de poliestireno que en el Ejemplo 1 para dar leche
fermentada que contenía el 8,1% en masa de porción de sólidos no
grasos de leche. El número de células inicial de YIT 10347 en la
leche fermentada era 2,6 x 10^{9}
UFC/ml.
UFC/ml.
Cuando esta leche fermentada se almacenó a 10ºC
durante 14 días, la tasa de supervivencia de YIT 10347 era del 35%
y el sabor era favorable. Además, cuando se almacenó a 20ºC durante
4 días, el cambio de acidez era de tan sólo 0,7 y no se reconoció
ningún deterioro del sabor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
1
Se inoculó Bifidobacterium bifidum YIT
10347 o YIT 4007 en un medio GAM bouillon (producto de Nissui
Seiyaku) y se incubó a 37ºC durante 20 horas en condición
anaerobia. El caldo de cultivo se centrifugó a 3.000 rpm durante 10
minutos y las células precipitadas se lavaron dos veces con una
solución salina fisiológica (PBS) tamponada con fosfato y se
suspendió en RPMI 1640 (preparado por Gibco; sin suero fetal bovino
(FBS); sin antibiótico) para preparar una suspensión de células. Se
inoculó Streptococcus thermophilus YIT 2021 (FERM
BP-7537) como un control negativo en un medio MRS
(preparado por Gibco), se incubó del mismo modo y se suspendió para
dar una suspensión de las células. Además, se aisló Lactobacillus
gasseri (aislado disponible en el mercado) de yogurt disponible
en el mercado (Meiji Probioyogurt LG21; Meiji Milk Products Co.,
Ltd.), se inoculó en un medio MILS (Iwata & Morishita, Letter
in Applied Microbiology, vol. 9, 165-168, 1989), se
incubó del mismo modo y se suspendió para dar una suspensión de las
células. Al igual que para Lactobacillus gasseri, se ha
descrito capacidad de adhesión a la célula gástrica humana y
erradicación de Helicobacter pylori.
La cepa celular obtenida del estómago humano
(cepa GCIY; disponible en Bioresource Center, Institute of Physical
and Chemical Research) se incubó en medio MEM de Eagle con FBS al
15% en vol (que no contenía antibiótico) en una placa recubierta
con colágeno de 24 pocillos (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) en un
incubador de dióxido de carbono fijado a 37ºC hasta un estado
semi-confluente. El número de células promedio de
GCIY era 6,53 x 10^{4} células/pocillo. Cada pocillo se lavó con
el RPMI 1640 que se ha mencionado anteriormente, a lo que se añadió
la suspensión que se ha preparado anteriormente de cada cepa y esto
se incubó durante 90 minutos y se lavó adicionalmente dos veces con
el anterior RPMI 1640 para eliminar las células no adherentes. Por
tanto, las células tratadas con GCIY se liberaron con una solución
de tripsina-EDTA 1 mM al 0,25% p/v, se diluyeron
apropiadamente con solución de extracto de levadura al 0,1% p/v y se
aplicaron sobre un medio de selección para cada cepa
(Bifidobacterium bifidum: medio de agar-ácido propiónico TOS
(Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.); Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus gasseri: medio MRS agar (Difco));
por tanto, el número de las células que se adherían a la cepa GCIY
se calculó a partir del número de colonias (Figura 4).
La adhesividad de Bifidobacterium bifidum
YIT 10347 e YIT 4007 a la cepa GCIY se comparó con la de
Streptococcus thermophilus como un control negativo,
indicando que el número de las células adheridas era aproximadamente
igual a 10 veces en ambas cepas. Por tanto, se consideró que la
capacidad de adhesividad era equivalente en ambas cepas. También se
observó que el número de células adheridas en ambas cepas era
ligeramente mayor que la de un aislado disponible en el mercado,
Lactobacillus gasseri como un control positivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
2
Experimento
A
La cepa de células GCIY obtenida del estómago
humano se incubó en un medio L-15 de Leibovitz con
FBS 15% en vol en una placa recubierta con colágeno de 96 pocillos
en un incubador de dióxido de carbono fijado a 37ºC hasta un estado
semiconfluente con oscuridad durante 2-5 días. Cada
cepa de ensayo incubada del mismo modo que en el Experimento 1 se
suspendió en un tampón fosfato (PBS) (concentración final 10^{8} -
10^{9} UFC/ml) y se añadió a cada pocillo y se
pre-incubó a 37ºC durante 2 horas. Entre tanto,
Helicobacter pylori se incubó a 37ºC durante 40 horas en
condiciones de microaerofilia (oxígeno al 5%, dióxido de carbono al
10%, nitrógeno al 85%) en un medio de Brucella de suero
equino al 10% en vol (preparado por Becton Dickinson) que se había
lavado una vez con medio L-15 de Leibovitz con HEPES
20 mM (que no contenía FBS). La solución de Helicobacter
pylori (concentración final 10^{7} UFC/ml) se añadió a cada
pocillo, se incubó a 37ºC durante 90 minutos, se lavó con PBS, se
añadió con solución de paraformaldehído al 8% p/v de y se dejó
reposar a 4ºC durante una noche. Esto se lavó adicionalmente dos
veces con PBS, se añadió con una solución de peróxido de
hidrógeno/metanol al 1% p/v, se dejó reposar a temperatura ambiente
durante 10 minutos y se lavó; después, se añadió un anticuerpo
anti-Helicobacter pylori (Anti H.p. (IgGl Murina): Cat.
#2007; preparada por SYNBIO) (100 \mul) diluido 200 veces con BSA
(albúmina sérica bovina)/PBS al 0,25% p/v y se incubó a 37ºC durante
2 horas. Después del lavado, se añadió un anticuerpo
anti-IgG de ratón (conjugado con peroxidasa;
preparado por Cappel) (100 \mul) diluido 1.000 veces con albúmina
sérica bovina (BSA)/PBS al 0,25% p/v y se incubó a 37ºC durante 1
hora. Después del lavado, se realizó una reacción de coloración con
reactivo de coloración ABTS y la reacción se terminó con
dodecilsulfato sódico (SDS) al 1% p/v y se midió la absorbancia a
405 nm. La tasa inhibidora (%) para adhesión de Helicobacter
pylori a la cepa GCIY se calculó de acuerdo con la siguiente
ecuación (Figura 5).
Tasa\
inhibidora\ (%) = (1- A/B)\ x\
100
A: Absorbancia en el momento de la adición de la
suspensión de cada cepa de células de ensayo
B: Absorbancia en el caso de ninguna adición de
la suspensión de cada cepa de células de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado, se observó que cuando se había
dejado que YIT 10347 e YIT 4007 actuaran sobre la cepa GCIY de
antemano, se inhibió la adhesión de Helicobacter pylori
añadido posteriormente. En particular, la actividad inhibidora de
YIT 10347 era aproximadamente 6 veces tan potente como
Streptococcus thermophilus YIT 2021 como control negativo y
además más potente que Lactobacillus gasseri (aislado
disponible en el mercado) como control positivo. Estos resultados
sugieren que YIT 10347 de forma similar a la cepa parental YIT 4007
tenía un efecto preventivo contra infección o reinfección por
Helicobacter pylori.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
B
Una solución de Helicobacter pylori
(10^{7} UFC/ml) y suspensiones de PBS de cada cepa de células de
ensayo (concentración final: 10^{8}- 10^{9} UFC/ml) preparadas
del mismo modo que en el Experimento A se preincubaron a 37ºC en un
medio L-15 de Leibovitz con HEPES 20 mM (sin adición
de FBS) durante 2 horas. Por otro lado, la cepa de células GCIY
obtenida del estómago humano se incubó del mismo modo que en el
Experimento A hasta un estado semiconfluente y se lavó una vez con
el anterior medio L-15 de Leibovitz. A estos
pocillos se añadió la solución preincubada que se ha descrito
anteriormente y los pocillos se incubaron a 37ºC durante 90 minutos,
se lavaron con PBS, se añadió solución de paraformaldehído al 8%
p/v y se dejaron reposar a 4ºC durante una noche. La operación se
realizó en lo sucesivo en este documento del mismo modo que en el
Experimento A y se calculó la tasa inhibidora de adhesión (%) para
la adhesión de Helicobacter pylori a la cepa GCIY (Figura
6).
Como resultado, se observó que cuando se había
dejado que YIT 10347 e YIT 4007 coexistieran con Helicobacter
pylori de antemano, se inhibió la adhesión de Helicobacter
pylori a la cepa GCIY. Esto indica que YIT 10347 e YIT 4007
actúan directamente sobre Helicobacter pylori para inhibir la
infectividad. La actividad inhibidora de YIT 10347 era
aproximadamente 3 veces tan potente como Streptococcus
thermophilus YIT 2021 como un control negativo y el aislado
disponible en el mercado L. gasseri como un control positivo
mostró aproximadamente la misma tasa inhibidora que el control
negativo YIT 2021. Estos resultados sugieren que YIT 10347 de forma
similar a la cepa parental YIT 4007 tiene un efecto de suprimir la
actividad o el efecto de Helicobacter pylori en un estado de
infección con Helicobacter pylori.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
3
Se inoculó Bifidobacterium bifidum YIT
10347 en un medio MILS y se incubó de forma anaerobia a 37ºC durante
20 horas. El caldo de cultivo se centrifugó a 5.000 rpm durante 5
minutos para recoger las células, que se lavaron 3 veces con medio
MEM de Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía antibiótico) y
se suspendió en una pequeña cantidad de medio MEM de Eagle con FBS
al 15% en vol (que no contenía antibiótico). Por otro lado, la cepa
de células GCIY obtenida del estómago humano se incubó en medio MEM
de Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía antibiótico) en una
microplaca recubierta con colágeno de 96 pocillos en un incubador
de dióxido de carbono a 37ºC hasta un estado confluente (1 - 2 x
10^{5} células/cm^{2}). El medio de cultivo en los pocillos se
eliminó y se sustituyó con uno fresco y la anterior suspensión de
YIT 10347 se añadió a las células GCIY de tal forma que la
concentración final era de 10^{7} UFC/ml o 10^{8} UFC/ml y se
incubó adicionalmente durante 6 horas (preincubación). En este
contexto, las células preincubadas solamente con el medio de
cultivo se usaron como control. El medio en el pocillo se eliminó y
el pocillo se lavó 3 veces con PBS para eliminar YIT 10347; se
añadió Helicobacter pylori o no se añadió en la concentración
final de 10^{7} UFC/ml junto con medio fresco y las células GCIY
se incubaron durante 24 horas. Después de la finalización de la
incubación, el sobrenadante del cultivo se recogió del pocillo y la
IL-8 en el sobrenadante se determinó por ELISA
(Figura 7).
Los resultados indicaron, como se muestra en la
Figura 7, que en la célula preincubada junto con YIT 10347, la
cantidad de IL-8 inducida por infección por
Helicobacter pylori disminuyó en comparación con el control
preincubado solamente en el medio de cultivo. La velocidad de
disminución en la cantidad de IL-8 era del 17% en
el caso de preincubación con adición de 10^{7} UFC/ml y del 38% en
el caso de añadir 10^{8} UFC/ml. A partir de este resultado, se
sugirió que YIT 10347 tiene un efecto de inhibir la producción de un
factor de migración de leucocitos IL-8 inducida por
la célula epitelial gástrica por infección por Helicobacter
pylori y, por tanto, podría mejorar la inflamación en el
estómago provocada por infección por Helicobacter pylori.
También se sugirió que el efecto inhibidor se convirtió en elevado
con el aumento del número de células vivas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
4
Se inoculó Bifidobacterium bifidum YIT
10347 en un medio MILS y se incubó de forma anaerobia a 37ºC durante
20 horas. El caldo de cultivo se centrifugó a 5.000 rpm durante 5
minutos para recoger las células, que se lavaron 3 veces con medio
MEM de Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía antibiótico) y
se suspendió en una pequeña cantidad de medio MEM de Eagle con FBS
al 15% en vol (que no contenía antibiótico). Por otro lado, la cepa
celular GCIY obtenida del estómago humano se incubó en medio MEM de
Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía antibiótico) en una
microplaca recubierta con colágeno de 96 pocillos en un incubador
de dióxido de carbono a 37ºC hasta un estado confluente (1 - 2 x
10^{5} células/cm^{2}). El medio de cultivo en los pocillos se
eliminó y se sustituyó con uno fresco y la anterior suspensión de
YIT 10347 se añadió a las células GCIY de tal forma que la
concentración final era de 10^{7} UFC/ml o 10^{8} UFC/ml y se
incubó adicionalmente durante 6 horas (preincubación). En este
contexto, las células preincubadas solamente en el medio de cultivo
se usaron como control. El medio en el pocillo se eliminó y el
pocillo se lavó 3 veces con PBS para eliminar YIT 10347; se añadió
TNF-\alpha en la concentración final de 10 ng/ml
junto con medio fresco y las células GCIY se incubaron durante 24
horas. Después de la finalización de la incubación, el sobrenadante
del cultivo se recogió del pocillo y se determinó la
IL-8 en el sobrenadante por ELISA
(Figura 8).
(Figura 8).
Los resultados indicaron como se muestra en la
Figura 8 que en la célula GCIY preincubada junto con YIT 10347, la
cantidad de IL-8 inducida por tratamiento posterior
con TNF-\alpha disminuyó en comparación con el
control preincubado solamente en el medio de cultivo. La tasa de
disminución en la cantidad de IL-8 fue de 36% en el
caso de preincubación con adición de 10^{7 }UFC/ml y del 40% en el
caso de preincubación con adición de 10^{8} UFC/ml. A partir de
este resultado, se observo que YIT 10347 tiene un efecto de inhibir
la producción de un factor de migración de leucocitos
IL-8 inducido por TNF-\alpha que
es un mediador de reacción inflamatoria. Es decir, se sugirió que
YIT 10347 podría mejorar una diversidad de inflamaciones en las que
está implicado el TNF-\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
5
Se inocularon tanto Helicobacter pylori
(1 x 10^{5} UFC/ml) como Bifidobacterium bifidum YIT 10347
(1 x 10^{7} UFC/ml) en un caldo de Brucella de suero
equino al 10% en vol ajustado a pH 5,8 con ácido clorhídrico y se
incubó en una condición de microaerofilia a 37ºC con agitación. Se
tomó una porción del caldo de cultivo en el cultivo de mezcla con
un transcurso de tiempo y se aplicó sobre placas de un medio agar de
Helicobacter (Nissui Seiyaku) y de medio agar-ácido
propiónico TOS (Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.),
respectivamente. El primero se incubó en una condición de
microaerobiosis a 37ºC durante 5 días y el último de forma anaerobia
a 37ºC durante 3 días para desarrollar colonias, a partir de lo
cual se determinó el número de células vivas en ambos organismos.
Para un control, se inoculó Helicobacter pylori en solitario
y se recontó el número de células vivas (Figura 9).
Los resultados se indicaron como se muestra en
la Figura 9 que en un control de Helicobacter pylori sólo,
se cultivó Helicobacter pylori hasta 1 x 10^{7} UFC/ml
después del transcurso de 48 horas. En el caso de coexistencia de
YIT 10347, el número de células vivas de Helicobacter pylori
disminuyó con el transcurso de tiempo y se redujo hasta por debajo
de 1 x 10^{3} UFC/ml después de 48 horas. En esta etapa, el número
de células vivas de YIT 10347 aumentó 10 veces o más en comparación
con la etapa de inoculación. A partir de estos resultados, se
observó que el desarrollo de Helicobacter pylori estaba
inhibido por YIT 10347 en presencia de las células vivas de YIT
10347. Es decir, se considera que la cepa viva YIT 10347 ingerida
por una persona inhibiría el desarrollo de Helicobacter
pylori en el estómago.
\newpage
Ejemplo de Ensayo
6
Se inoculó Bifidobacterium bifidum YIT
10347 o YIT 4007 en un medio MILS y se incubó de forma anaerobia a
37ºC durante 20 horas. El caldo de cultivo se centrifugó a 5.000 rpm
durante 5 minutos para recoger las células, que se lavaron 3 veces
con medio MEM de Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía
sustancia antibiótica) y se suspendió en una pequeña cantidad de
medio MEM de Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía sustancia
antibiótica). Por otro lado, la cepa de células GCIY obtenida del
estómago humano se incubó en medio MEM de Eagle con FBS al 15% en
vol (que no contenía antibiótico) en una microplaca recubierta con
colágeno de 96 pocillos en un incubador de dióxido de carbono a
37ºC hasta un estado confluente (1 - 2 x 10^{5} células/cm^{2}).
El medio de cultivo en los pocillos se eliminó y se sustituyó con
uno fresco y la anterior suspensión de YIT 10347 o YIT 4007 se
añadió a las células GCIY de tal forma que la concentración final
era de 10^{6} UFC/ml y se incubó adicionalmente durante 6 horas
(preincubación). En este contexto, las células preincubadas
solamente en el medio de cultivo se usaron como control. Se retiró
el medio en el pocillo y el pocillo se lavó 3 veces con PBS para
eliminar las células de Bifidobacterium bifidum; después se
añadió Helicobacter pylori o no se añadió en la
concentración final de 10^{7} UFC/ml junto con medio fresco y las
células GCIY se incubaron durante 24 horas. Después de la
finalización de la incubación, el sobrenadante del cultivo se
recogió del pocillo y se determinó la IL-8 en el
sobrenadante por ELISA (Figura 10).
A partir de los resultados como se muestra en la
Figura 10, se indica que en la célula preincubada junto con YIT
10347 o YIT 4007, la cantidad de IL-8 inducida por
infección por Helicobacter pylori disminuyó en comparación
con el control preincubado solamente en el medio de cultivo. La
velocidad de disminución en la cantidad de IL-8 era
del 7% en el caso de preincubación con adición de YIT 4007, pero tan
alta como el 28% en el caso de preincubación con adición de YIT
10347. A partir de este resultado, se mostró que YIT 10347 e YIT
4007 tienen un efecto de inhibir la producción de un factor de
migración de leucocitos IL-8 inducido por la célula
epitelial gástrica por infección por Helicobacter pylori y el
efecto inhibidor de YIT 10347 es mayor que el de YIT 4007.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
7
Se inoculó Bifidobacterium bifidum YIT
10347 o YIT 4007 en un medio MILS y se incubó de forma anaerobia a
37ºC durante 20 horas. El caldo de cultivo se centrifugó a 5.000 rpm
durante 5 minutos para recoger las células, que se lavaron 3 veces
con medio MEM de Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía
antibiótico) y se suspendió en una pequeña cantidad de medio MEM de
Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía antibiótico). Por otro
lado, la cepa de células GCIY obtenida del estómago humano se incubó
en medio MEM de Eagle con FBS al 15% en vol (que no contenía
antibiótico) en una microplaca recubierta con colágeno de 96
pocillos en un incubador de dióxido de carbono a 37ºC para llevarse
hasta un estado confluente (de 1 a 2 x 10^{5} células/cm^{2}).
El medio de cultivo en los pocillos se eliminó y se sustituyó con
uno fresco y se añadió la anterior suspensión de YIT 10347 o YIT
4007 a las células GCIY de tal forma que la concentración final era
de 10^{6} UFC/ml y se incubó adicionalmente durante 6 horas
(preincubación). En este contexto, las células preincubadas
solamente con el medio de cultivo se usaron como control. El medio
en el pocillo se retiró y el pocillo se lavó 3 veces con PBS para
eliminar las células de Bifidobacterium bifidum; se añadió
TNF-\alpha en la concentración final de 10 ng/ml
junto con medio fresco y las células GCIY se incubaron durante 24
horas. Después de la finalización de la incubación, el sobrenadante
del cultivo se recogió del pocillo y se determinó
IL-8 en el sobrenadante por ELISA (Figura 11).
A partir de los resultados como se muestra en la
Figura 11, se indica que en la célula GCIY preincubada junto con
YIT 10347 o YIT 4007, la cantidad de IL-8 inducida
por tratamiento posterior con TNF-\alpha disminuyó
en comparación con el control preincubado solamente en el medio de
cultivo. La velocidad de disminución en la cantidad de
IL-8 era del 1% en el caso de YIT 4007 pero del 15%
en el caso de preincubación con adición de YIT 10347. A partir de
este resultado, se mostró que YIT 10347 e YIT 4007 tienen un efecto
de inhibir la producción de un factor de migración de leucocitos
IL-8 inducido por TNF-\alpha que
es un mediador de reacción inflamatoria y el efecto inhibidor es
mayor en YIT 10347 que en YIT 4007.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
8
En 79 adultos sanos que se quejaban de su
estómago, se realizó un estudio comparativo aleatorio doble ciego
entre los dos grupos paralelos usando un placebo como control en los
siguientes sujetos. En estos sujetos, se obtuvo de antemano el
consentimiento informado de los mismos.
- (1)
- Adultos sanos que se quejaban de su estómago (excluyendo mujeres embarazadas)
- (2)
- Aquellos cuyo valor en el ensayo de aliento con urea (el valor de \Delta^{13}CO_{2} 20 minutos después de la administración de Ubit; preparación de urea ^{13}C preparada por Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.; realizada de acuerdo con el manual para examen) es del 5% o mayor y cuya proporción de pepsinógeno I/II es menor de 6,5
- (3)
- Aquellos que no habían ingerido ningún producto farmacéutico o alimentario que pudiera tener influencia sobre la afección del estómago
- (4)
- Aquellos que no tienen alergia a la leche o intolerancia a lactosa
- (5)
- Aquellos que no tienen enfermedades crónicas.
En el ensayo, el producto alimenticio a ensayar
(bebida de bacteria de ácido láctico que contiene Bifidobacterium
bifidum YIT 10347 preparada en el Ejemplo 5) o un alimento
placebo (leche no fermentada) se ingirió a una dosis de una pieza
(100 ml/pieza) una vez al día en el momento del despertar y de las
comidas durante 12 semanas; el tiempo de observación fue 8 semanas
después de la finalización de la ingestión. Antes de la ingestión,
después de 4 semanas durante la ingestión, después de 8 semanas
durante la ingestión, después de 12 semanas durante la ingestión y
8 semanas después de la ingestión (20 semanas desde el inicio del
ensayo) un médico observó el cambio de un síntoma subjetivo por
entrevistas y medida con respecto a los siguientes puntos.
- (1)
- Valor de exhalación \Delta^{13} CO_{2} por un ensayo de aliento con urea
- (2)
- Valor de pepsinógeno en suero
- (3)
- La cantidad de antígeno de Helicobacter pylori en heces.
La medición de los anteriores puntos (1) a (3)
se realizó en BML Co., Ltd.
El análisis de los anteriores resultados de
ensayo se realizó en todos los sujetos, sujetos positivos a
Helicobacter pylori y el grupo de gastritis activa y el
grupo límite de gastritis atrófica basándose en el agrupamiento de
Yoshihara et al. (Estimation of the state of gastric mucosa
by the pepsinogen value, the source: Yoshihara et. al.,
Medical Practice, vol. 21, 77-81, 2004); además, se
realizó la comparación entre los grupos para cada valor medido
(ensayo de Mann-Whitney), comparación de la
variación a partir del nivel basal antes y después (ensayo de
Wilcoxon) y comparación del grado mejorado de síntoma subjetivo.
En todos los sujetos o los sujetos o los sujetos
del grupo de gastritis activa, el valor de pepsinógeno I en el
grupo de producto alimenticio de ensayo era significativamente menor
que el del placebo (Figura 12 y Figura 13). Ya que el valor de
pepsinógeno I se correlaciona con la secreción de ácido gástrico,
estos resultados indican que una bebida de bacteria de ácido
láctico que contiene YIT 10347 tiene un efecto de suprimir el
aumento del ácido gástrico y además un efecto de suprimir el ácido
gástrico en la gastritis activa en la que se repite una reacción
inflamatoria por el ataque de Helicobacter pylori y el efecto
preventivo o terapéutico para hiperquilia o esofagitis por
reflujo.
En los sujetos del grupo límite de gastritis
atrófica, el valor de pepsinógeno II en el grupo de producto
alimenticio de ensayo era significativamente menor que el del
placebo (Figura 14). Ya que el valor de pepsinógeno II refleja la
inflamación de mucosa gástrica, estos resultados indican que una
bebida de bacteria de ácido láctico que contiene YIT 10347 tiene un
efecto de aliviar la inflamación de la mucosa gástrica incluyendo
gastritis atrófica. En este contexto, ya que Streptococcus
thermophilus contenido en el producto alimenticio de ensayo se
ha confirmado que no afecta al valor de pepsinógeno, se considera
que el efecto observado en el producto alimenticio de ensayo
depende de Bifidobacterium bifidum YIT 10347.
En todas las personas positivas a
Helicobacter pylori o sujetos positivos a Helicobacter
pylori del grupo de gastritis activa, el valor de exhalación
\Delta^{13} CO_{2}en el grupo de producto alimenticio de
ensayo era menor que el nivel basal y la variación también era menor
que el grupo placebo (Figura 15, Figura 16). Ya que el valor de
exhalación \Delta^{13} CO_{2} refleja la actividad de ureasa
esencial para el desarrollo y la actividad de Helicobacter
pylori en el estómago, estos resultados indican que una bebida
de bacteria de ácido láctico que contiene YIT 10347 muestra un
efecto anti-Helicobacter pylori (disminución del número de
células de Helicobacter pylori, inhibición de la generación
de amonio por Helicobacter pylori, alivio/prevención/cura de
lesión de la mucosa gástrica por Helicobacter pylori, mejora
de una reacción inflamatoria por Helicobacter pylori y
similares) por inhibición de la actividad de ureasa (disminución de
la cantidad de amonio) de Helicobacter pylori. En los
sujetos positivos a Helicobacter pylori del grupo límite de
gastritis atrófica, la cantidad de antígeno de Helicobacter
pylori en heces en el grupo de producto alimenticio de ensayo
era menor que en el basal (Figura 17). Ya que la cantidad de
antígeno de Helicobacter pylori refleja la cantidad de
células de Helicobacter pylori, estos resultados indican que
una bebida de bacteria de ácido láctico que contiene YIT 10347
muestra un efecto de disminuir el número de células de
Helicobacter pylori. En este contexto, ya que
Streptococcus thermophilus contenido en el producto
alimenticio de ensayo se ha confirmado que no afecta a
Helicobacter pylori, se considera que el efecto observado en
el producto alimenticio de ensayo depende de Bifidobacterium
bifidum YIT 10347.
Con respecto a cambio de un síntoma subjetivo
por entrevista con todos los sujetos, la tasa de mejora de una
dolencia indefinida (dolor de estómago, indigestión, pesadez en el
estómago, arcadas, sensación desagradable, acidez, dolor de barriga
superior, eructos) en el estómago en el grupo de producto
alimenticio de ensayo era mayor que en el grupo de placebo (Figura
18). Los detalles son los siguientes: mejora del dolor de estómago
en el grupo de producto alimenticio de ensayo: 9 sujetos y ninguna
mejora: 1 sujeto (tasa de mejor del 90%); mejora en el grupo de
placebo: 4 sujetos y ninguna mejora: 2 sujetos (tasa de mejora del
67%); mejora de indigestión en el grupo de producto alimenticio de
ensayo: 4 sujetos y ninguna mejora: 1 sujeto (tasa de mejora del
80%); mejora en el grupo de placebo: 1 sujeto y ninguna mejora: 2
sujetos (tasa de mejora del 33%); y mejora de las demás afecciones
(pesadez en el estómago, arcadas, sensación desagradable, acidez,
dolor de barriga superior, eructos) en el grupo de producto
alimenticio de ensayo: 3 sujetos y ninguna mejora: ninguno (tasa de
mejora del 100%); mejora del grupo de placebo: 5 sujetos y ninguna
mejora: 3 sujetos (tasa de mejora del 63%). Estos resultados
indican que una bebida de bacteria de ácido láctico que contiene YIT
10347 muestra un efecto de mejorar de forma eficaz la dolencia
indefinida en el estómago. En este contexto, ya que Streptococcus
thermophilus contenido en el producto alimenticio de ensayo se
ha confirmado que no afecta a la afección gástrica, se considera
que el efecto observado en el producto alimenticio de ensayo depende
de Bifidobacterium bifidum YIT 10347.
El Bifidobacterium bifidum de la
invención tiene un efecto de destruir Helicobacter pylori y
muestra una alta capacidad de supervivencia incluso en el caso de
almacenarse en una bebida o alimento de leche fermentada en
condición aerobia. Ya que el efecto destructor que se ha mencionado
anteriormente y la capacidad de supervivencia se mantienen a lo
largo de un largo periodo de tiempo y una gran cantidad de las
células vivas se pueden suministrar al estómago y tracto
intestinal, se puede utilizar como un agente preventivo o
terapéutico para infección por Helicobacter pylori, un
agente preventivo o terapéutico para gastritis y úlcera, un agente
preventivo o terapéutico para dolencia indefinida en el estómago o
un agente preventivo o terapéutico para hiperquilia y reflujo
gastroesofágico. Además, se puede utilizar preferiblemente en la
producción de bebidas y alimentos, particularmente en bebidas o
alimentos de leche fermentada. Además, ya que suprime el aumento de
la acidez y el deterioro del sabor durante el almacenamiento de una
bebida o alimento de leche fermentada en el que se usa sacarosa, se
puede utilizar preferiblemente en bebidas y alimentos de leche
fermentada que contienen edulcorantes.
La Figura 1 muestra el resultado de la
identificación de especie de YIT 4007 e YIT 10347 usando un cebador
BiBIF.
La Figura 2 muestra los patrones de banda RAPD
de YIT 4007 e YIT 10347.
La Figura 3 muestra los patrones de
electroforesis de campo pulsado de ADN cromosómico de YIT 4007 e YIT
10347.
La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo
para capacidad de adhesión a la célula gástrica humana.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo
de inhibición para la adhesión de Helicobacter pylori a la
célula gástrica.
La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo
de inhibición para la adhesión de Helicobacter pylori a la
célula gástrica.
La Figura 7 muestra los resultados de ensayo de
un efecto inhibidor de YIT 10347 para IL-8 inducida
por las células gástricas humanas por infección por Helicobacter
pylori.
La Figura 8 muestra los resultados de ensayo de
un efecto inhibidor de YIT 10347 para IL-8 inducida
por las células gástricas humanas por adición de
TNF-\alpha.
La Figura 9 muestra los resultados de ensayo de
un efecto inhibidor para Helicobacter pylori por YIT 10347
en el caldo de cultivo (Experimento A: cultivo por una única
bacteria; Experimento B: cultivo mixto).
La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo
de comparación de un efecto inhibidor de YIT 10347 e YIT 4007 para
IL-8 inducida por las células gástricas humanas por
infección por Helicobacter pylori.
La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo
de comparación de un efecto inhibidor de YIT 10347 e YIT 4007 para
IL-8 inducida por las células gástricas humanas por
adición de TNF-\alpha.
La Figura 12 muestra los resultados (el valor de
pepsinógeno I en todos los sujetos) de un ensayo de administración
de una bebida de bacteria de ácido láctico que contiene YIT 10347 en
ser humano.
La Figura 13 muestra los resultados (el valor de
pepsinógeno I en los sujetos de gastritis activa) de un ensayo de
administración de una bebida de bacteria de ácido láctico que
contiene YIT 10347 en ser humano.
La Figura 14 muestra los resultados (el valor de
pepsinógeno II en los sujetos del grupo límite de gastritis
atrófica) de un ensayo de administración de una bebida de bacteria
de ácido láctico que contiene YIT 10347 en ser humano.
La Figura 15 muestra los resultados (el valor de
exhalación \Delta^{13} CO_{2} en todos los sujetos positivos
a Helicobacter pylori) de un ensayo de administración de una
bebida de bacteria de ácido láctico que contiene YIT 10347 en ser
humano.
La Figura 16 muestra los resultados (el valor de
exhalación \Delta^{13} CO_{2} en los sujetos con gastritis
activa positivos a Helicobacter pylori) de un ensayo de
administración de una bebida de bacteria de ácido láctico que
contiene YIT 10347 en ser humano.
La Figura 17 muestra los resultados (la cantidad
de antígeno de Helicobacter pylori en las heces de los
sujetos del grupo límite de gastritis atrófica y positivos para
Helicobacter pylori) de un ensayo de administración de una
bebida de bacteria de ácido láctico que contiene YIT 10347 en ser
humano.
La Figura 18 muestra los resultados (la tasa de
mejora de dolencia indefinida en el estómago en todos los sujetos)
de un ensayo de administración de una bebida de bacteria de ácido
láctico que contiene YIT 10347 en ser humano.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Co.,
Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Bacteria novedosa del género
Bifidobacterium y su utilización
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
PF-060014-WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2005-211670
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-07-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BiSIF-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacatgatc gcatgtgatt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BiBIF-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgaaggctt gctcccaaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgcagccaa
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgcgcaac
\hfill10
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggaaatag
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggacaaag
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaactagac
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtagacaagc
\hfill10
Claims (14)
1. Bifidobacterium bifidum YIT 10347
(FERM BP-10613).
2. Bifidobacterium bifidum de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que la diferencia de la acidez en una
bebida o alimento de leche fermentada que contiene el 3% en masa o
más de sacarosa y el 8% en masa o más de porción de sólidos no
grasos de leche después del almacenamiento a 20ºC durante 4 días en
una condición aerobia con respecto a la acidez inmediatamente
después de la producción es 2 o menos.
3. Bifidobacterium bifidum de acuerdo con
la reivindicación 1 ó 2, que tiene un efecto de destruir
Helicobacter pylori inhibiendo la adhesión de
Helicobacter pylori a la célula gástrica humana.
4. Bifidobacterium bifidum de acuerdo con
la reivindicación 1 ó 2, que tiene un efecto de destruir
Helicobacter pylori inhibiendo el desarrollo de
Helicobacter pylori.
5. Un agente preventivo o terapéutico para
infección por Helicobacter pylori, que comprende como un
ingrediente activo Bifidobacterium bifidum de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un agente preventivo o terapéutico para
gastritis o úlcera, que comprende como un ingrediente activo
Bifidobacterium bifidum de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
7. Un agente preventivo o terapéutico para
dolencia indefinida en el estómago, que comprende como un
ingrediente activo Bifidobacterium bifidum de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Un agente preventivo o terapéutico para
hiperquilia y reflujo gastroesofágico, que comprende como un
ingrediente activo Bifidobacterium bifidum de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Una bebida o alimento que comprende
Bifidobacterium bifidum de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
10. Una bebida o alimento de acuerdo con la
reivindicación 9, que es una bebida o alimento de leche
fermentada.
11. Una bebida o alimento de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, que contiene además un edulcorante.
12. Una bebida o alimento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que está envasado en un
recipiente.
13. Una bebida o alimento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el recipiente está compuesto por un
material de envuelta permeable a oxígeno.
14. Bifidobacterium bifidum YIT 10347
(FERM BP-10613) para el uso en la prevención o el
tratamiento de infección por Helicobacter pylori, para el
uso en la prevención o el tratamiento de gastritis o úlcera, para el
uso en la prevención o el tratamiento de dolencia indefinida en el
estómago o para el uso en la prevención o el tratamiento de
hiperquilia y reflujo gastroesofágico.
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