FI76373B - Foerfarande foer framstaellning av en odling som innehaoller levande cellmassa av bifidobakterier och mjoelksyrabakterier. - Google Patents

Description

x 76373

Menetelmä viljelmän tuottamiseksi, joka sisältää bifido-bakteereiden ja maitohappobakteereiden elävää solumassaa Tämä keksintö koskee menetelmää viljelmän tuottami-5 seksi, joka viljelmä sisältää bifidobakteereiden ja maitohappobakteereiden elävää solumassaa ja joka saadaan inku-boiraalla suvun Bifidobacterium, suvun Lactobacillus ja Streptococcus thermophilus’in mikro-organismeja väliaineessa, joka sisältää maitoa yhtenä pääasiallisena aineosana.

10 Keksinnön mukaisesti saadut viljelmät sisältävät bifidobakteereiden ja maitohappobakteereiden eläviä soluja, ja viljelmissä bifidobakteereiden kuolleisuus säilytettäessä aerobisissa olosuhteissa on alentunut. Viljelmät käsittävät sukuun Bifidobacterium kuuluvan mikro-organismin elävää 15 solumassaa (johon tästä lähtien viitataan nimellä "bifido-bakteerit") ja sukuun Lactobacillus kuuluvan mikro-organismin elävää solumassaa (johon tästä lähtien viitataan nimellä "lactobacillus-bakteerit") ja uuden Streptococcus thermo-philus'in, jolla on korkea hapenottokyky (ja johon tästä 20 lähtien viitataan nimellä "S-bakteerit").

Bifidobakteerit ovat vallitsevimmat bakteerit ihmisten suolistossa ja niiden merkitystä terveydelle on laajasti tutkittu. Niitä on toistaiseksi käytetty hyväksi suolis-tohäiriöiden hoitoon käytettävissä lääkkeissä, ruoassa ja 25 ravintoaineissa ja niin edelleen.

Bifidobakteereilla on myös suotuisa merkitys eläinten suolistoissa, joka on samanlainen kuin ihmisten suoliston osalta ja niitä on käytetty hyväksi eläinten rehuna.

Bifidobakteerit ovat kuitenkin kykenemättömiä säily-30 mään hengissä säilytettäessä niitä pitkän aikaa aerobisessa ympäristössä, missä happea on läsnä, alemmalla pH-alueella, koska ne ovat obligaatteja anaerobeja ja niiden haponkestä-vyys on hyvin rajoitettu. On ollut mahdotonta taata elävien bifidobakteerisolujen huomattavaa lukumäärää viljellyissä 35 tuotteissa, kun bifidobakteereita käytetään niihin. /Umada: New Food Industry 24 (1982) _1, sivu 63. / Bifidobakteereiden 2 76373 hengissäsäilymisosuuden arvo viljellyissä tuotteissa, ilmaistuna säilytyksen jälkeisen bifidobakteereiden elävien solujen lukumäärän prosenttiosuutena välittömästi valmistuksen jälkeisellä hetkellä olleesta bifidobakteereiden 5 elävien solujen lukumäärästä, oli alentunut johtuen ilman hapelle altistumisen ja valmistusprosessissa ja varastoinnissa vallinneen alhaisen pH:n synergistisestä haitallisesta vaikutuksesta. Edellä kuvattujen ongelmien ratkaisemiseksi on yritetty a) modifioitua valmistustapaa tai eri-10 tyistä tuotemuotoa, joka estää tuotteen joutumisen kosketukseen ilman kanssa valmistuksen ja varastoinnin aikana, ja b) jonkin bifidobakteereiden mutanttikannan, jolla on hapon- ja hapenkestävyys, käyttöä. Kuitenkin menettely a) aiheuttaa tuotantokustannusten kasvun. Hapon- ja hapenkes-15 tävät Bifidobacterium breve 1 in (Japanese Examined Patent Application Publication Gazette No. 42250/1981; Japenese Unexamined Patent Application Publication Gazette No. 99190/1982), Bifidobacterium bifidum'in (Japanese Examined Patent Application Publication Gazeete No. 42250/1981) ja 20 Bifidobacterium longum'in (JP-patenttihakemus 106182/1982) mutantit on eristetty, mutta tämä teknologia on sovellettavissa ainoastaan bifidobakteereiden rajoitettuihin lajeihin ja on vähemmän käytännöllinen.

Lactobacillus acidophilus 1 in, Lactobacillus arabino-25 sus'in, Lactobacillus batatas'in, Lactobacillus casei'n, Lactobacillus delbrueckii1n, Lactobacillus fermentii'n, Lactobacillus platanrum’in ja Lactobacillus sake'in, jotka kuuluvat sukuun Lactobacillus, hapenottokyky on raportoitu ,/iTitahara ja Fukui: Journal of Agricultural Chemical Socie-30 ty of Japan 26 (1952) 555; C.F. Strittmatter: Journal of

Biological Chemistry 234 (1959) 2789; M.I. Dolin: The Bacteria, toimittajat I.C. Gunsalus, R.Y. Stainer, Acad. Press Inc., sivu 425 (1961); Iwamoto et ai.: Journal of the Pharmaceutical Society of Japan 99 (1979) 3547 ja Leuconostoc 35 masenteroides'in, joka kuuluu sukuun Leuconostoc /Iwamoto et ai.: Journal of the Pharmaceutical Society of Japan 99 3 76373 (1979) 354/ ja Streptococcus agalactiae1 n, Streptococcus cremoris'in, Streptococcus faecalis'in, Streptococcus faecium'in, Streptococcus lactis'in, Streptococcus lique-faciens'in ja Streptococcus mastitidis'in, jotka kuuluvat 5 sukuun Streptococcus /O.J.O. Kane, I.C. Gunsalus: Journal of Bacteriology 56 (1948) 499; Obayashi et al.: Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 34 (1960) 272; M.I. Dolin: Bacteria, toimittajat I.C. Gunsalus & R.Y. Stainer, Acad. Press Inc., sivu 425 (1961); M.N.

10 Mickelson: Journal of Bacteriology 94 (1967) 184; R.F. Anders et al: Applied Microbiology 19 (1970) 608; M.J. Coventry: The Australian Journal of Dairy Technology 33 (1978) 148; Iwamoto et al: Journal of the Pharmaceutical Society of Japan 99 (1979) 35j4_/. Tinson et al. selostivat, 15 että Streptococcus thermophilus'in (johon tästä lähtien viitataan nimellä "thermophilus-bakteerit") hapenottonopeus oli 7,3 μπιοο1ΐ3 90 minuutissa 12 mg kuivattua solumassaa * kohti 33,5uC:ssa, kun kuorittua maitoa, joka sisälsi 0,1 % hiivauutetta, käytettiin substraattina /The Australain 20 Journal of Dairy Technology 37 (1982) 1_4?. Tämä hapenottokyky, muutettuna yksikköihin yhdessä minuutissa yhtä milligrammaa kohti kuivattua solumassaa kohti, oli 6,76 nonomoo-lia happimolekyylejä. Hapenottokyky ilmaistaan tästä lähtien nanomooleina siten kuin edellä on määritelty. Aiemmat 25 tutkimukset kannustivat tämän keksinnön tekijöitä tutkimaan bifidobakteereiden elinkykyisyyden edistämistä poistamalla happi ympäristöstä, mikä saatettaisiin saavuttaa yhtäaikaisesti läsnäolevien Streptococcus- tai lactobacillus-baktee-reiden hapenottokyvyn avulla.

30 Lactobacillus-bakteereiden solujen lukumäärän suhde thermophilus-bakteereiden solujen lukumäärään tavanomaisessa fermentoidussa maidossa on likimain alueella 1:4 - 4:1 /TT.K. Robinson, A.Y. Tamime: Journal of the Society of Dairy Technology 28 (1975) 149; Morichi: Bulletin of Japan 35 Dairy Technical Association 25 (1975) 2; Kikuchi: Fermentation and Industry 37 (1979) 13j/. Schiller et al. /Milch- 4 76373 wissenschaft 23 (1968 9^, sivu 554 ja ibid. 10, sivu 614? kuvasivat fermentoitua maitoa varten tarkoitettua käynnistä jäkompos itiötä , jossa oli likimain suhteessa 5:1:1 organismeja Streptococcus :Lactobacillus acidophilus :Bifidobac-5 teriä ja havaitsivat, että käynnistäjän kolmen mikro-organismin koostumussuhde tuloksena saadussa fermentoidussa tuotteessa oli 15:1:2 sen jälkeen, kun fermentaatio oli päättynyt. Bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuus oli noin 1 %, kun fermentoitua maitoa säilytettiin pH:ssa 10 4,6-4,9 seitsemän päivän ajan.

Kuten edellä on kuvattu, bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuus oli melkoisesti alentunut lactobacillus-ja thermophilus-bakteereiden läsnäollessa, mikä näyttää johtuvan viimeksi mainittujen kahden bakteerin rajoitetus-15 ta hapenottokyvystä.

Kuitenkin tämän keksinnön tekijät eristivät S-bak-teerit, thermophilus-bakteereiden uuden kannan, joilla on korkea hapenottokyky. Bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuus fermentoidussa maidossa, jolla on alhainen pH, kohosi 20 huomattavasti mainittujen S-bakteereiden läsnäollessa johtuen ympäristön happikonsentraation alenemisesta.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota viljelmä, joka aikaansaa korkean bifidobakteereiden hengissäsäilymis-osuuden, kun viljelmää säilytetään aerobisissa olosuhteissa. 25 Tämän keksinnön toisena tarkoituksena on tarjota viljelmä, joka on tarkoitettu hyväksikäytettäväksi ruokaa, ravintoaineita, suolistohäiriöiden lääkkeitä ja eläinten rehua varten ja jolla on korkea bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuus silloinkin, kun viljelmää säilytetään aero-30 bisissa olosuhteissa.

Keksinnön mukaisesti valmistettu viljelmä sisältää a) Streptococcus thermophilus'in FERM BP-351, FERM BP-352, FERM BP-353 ja/tai FERM BP-354, joiden hapenottokyky on vähintään 30 nanomoolia Streptococcus thermophi-35 lus'in kuivattujen solujen milligrammaa kohti minuutissa määriteltynä hapen kulutuksena, joka on määritetty Warbur- 5 76373 gin manometrimenetelmän mukaisesti, b) suvun Bifidobacterium solujen hengissäsäilymis-osuus on vähintään 5 % ilmaistuna säilytyksen jälkeisen solujen lukumäärän suhteena prosenteissa säilytystä edel- 5 tävään solujen lukumäärään säilytettynä aerobisissa olosuhteissa 5°C:ssa seitsemän päivän ajan ja c) Streptococcus thermophilus'in elävien solujen lukumäärä on vähintään 10 kertaa suurempi kuin suvun Lactobacillus elävien solujen lukumäärä hetkellä välittömäs- 10 ti inkuboinnin jälkeen.

Tämän keksinnön yksityiskohtia kuvataan alempana.

Viljelmä sisältää siis ainakin tunnettuja bifido-bakteereita ja lactobacillus-bakteereita ja uusia S-bak-teereita, missä S-bakteereiden elävien solujen lukumäärä 15 viljelmässä välittömästi valmistuksen jälkeen on ainakin 10 kertaa suurempi kuin lactobacillus-bakteereiden vastaava. Tämän keksinnön menetelmän mukaisesti bifidobakteerei-den elävien solujen lukumäärä yhdessä grammassa viljelmää 7 välittömästi valmistuksen jälkeen on ainakin 2 x 10 ja 20 bifidobakteereiden elävien solujen kokonaislukumäärä on vähintään 5 % säilytettäessä 5°C:ssa seitsemän päivän ajan tai vastaavissa olosuhteissa. Bifidobakteereiden elävien solujen kokonaislukumäärä yhdessä grammassa viljelmää vä-

O

littömästi valmistuksen jälkeen on vähintään 1,3 x 10 .

25 Keksinnön mukaisesti saatu huomattava bifidobaktee reiden kuolleisuutta viljelmässä estävä vaikutus johtuu viljelmään sisältyvien S-bakteereiden korkeasta hapenottokyvystä eikä vastaavaa erinomaista bifidobakteereiden hen-gissäsäilymistä ole aikaisemmin onnistuttu saavuttamaan.

30 Niinpä tämän keksinnön mukaisesti valmistettua viljelmää voidaan käyttää hyväksi ruokaa, ravintoaineita tai eläinten rehua varten sellaisenaan tai sen jälkeen, kun sille on tehty tavanomainen prosessointi tai sitä voidaan käyttää hyväksi suolistohäiriöiden lääkkeitä varten tavanomaisen 35 menettelyn mukaisesti suoritetun viljelmän kylmäkuivauksen jälkeen.

6 76373

Keksinnön mukaiselle menetelmälle viljelmän valmistamiseksi, joka viljelmä sisältää bifidobakteereiden ja maitohappobakteereiden elävää solumassaa, on tunnusomaista, että siinä siirrostetaan käynnistäjäseosta, 5 joka käsittää (a) suvun Bifidobacterium mikro-organismin käynnistäjän, (b) suvun Lactobacillus käynnistäjän ja (c) Streptococcus thermophilus1 in FERM BP-51, FERM BP-352, FERM BP-353 ja/tai FERM BP-354, joiden hapenottokyky on vähintään 30 nanomoolia Streptococcus thermophi-10 lus1 in kuivattujen solujen milligrammaa kohti minuutissa määriteltynä hapen kulutuksena, joka on määritetty War-burgin manometrimenetelmän mukaisesti, käynnistäjän, väliaineeseen, joka sisältää maitoa yhtenä pääasiallisena aineosana ja aerobisesti inkuboidaan mainittua väli-15 ainetta, tai että erillisesti siirrostetaan kutakin mainituista käynnistäjistä vastaavaan väliaineeseen, aerobisesti inkuboidaan kutakin mainituista väliaineista ja lopuksi sekoitetaan saadut viljelmät yhteen.

Tätä keksintöä varten tarkoitettu viljelyväliaine 20 sisältää lehmän maitoa, kuorittua maitoa, rekonstruoitua kuorittua maitoa tai niiden konsentraatteja pääasiallisena aineosana siten, että on tai ei ole lisätty kasvua edistäviä aineita yksittäisiä bakteereita varten, ja väliaine on steriloitu tavanomaisen menettelyn mukaises-25 ti. Steriloituun ja jäähdytettyyn väliaineeseen siirrostetaan bifidobakteereiden, lactobacillus-bakteereiden ja S-bakteereiden käynnistäjäviljelmiä, jotka valmistetaan tavanomaisen menettelyn mukaisesti, suhteessa 100:0,5 -50:3 - 600 painon mukaan, riippuen halutusta tarkoituk-30 sesta, kun bifidobakteereiden määränä pidetään 100. Käyn-nistäjäseos siirrostetaan väliaineeseen konsentraatioon 1,4 - 16 % (V/V).

Viljely suoritettiin 37-42°C:ssa 3-24 tunnin ajan tavanomaisen menettelyn mukaisesti. Välittömästi valmistuk-35 sen jälkeen sisältää yksi gramma täten saatua viljelmää 7 76373 normaalisti 2-500 x 10^, 1-20 x 10® ja 5-100 x 10® bifido-bakteereiden, S-bakteereiden ja lactobacillus-bakteereiden elävää solua, vastaavasti.

Vaihtoehtoisesti siirrostetaan bifidobakteereiden, 5 lactobacillus-bakteereiden ja S-bakteereiden alaviljelmiä erillisiin väliaineisiin konsentraatioon 3-10 % (V/V), 1-5 % (V/V) ja 1-5 % (V/V), vastaavasti, ja viljellään 37-42°C:ssa 3-24 tunnin ajan käynnistäjäviljelmien g saamiseksi. 1 g vastaavaa käynnistäjää sisältää 5-50 x 10 g 10 bifidobakteereiden elävää solua, 2-20 x 10 lactobacillus- g bakteereiden elävää solua ja 1-10 x 10 S-bakteereiden elävää solua. Sitten bifidobakteereiden käynnistäjää (määränä pidetään 100), lactobacillus-bakteereiden käynnistäjää ja S-bakteereiden käynnistäjää sekoitetaan suhteessa 100:0,28 -15 625:11 - 24 800 painon mukaan, riippuen ko. tarkoituksesta, seosviljelmän saamiseksi.

Kuten edellä on kuvattu, menetelmä viljelmän valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti on hyvin yksinkertainen ja vaatii vain tavanomaisen asennusprosessin, mutta sil-20 lä on bifidobakteereiden säilytyksen jälkeistä hengissäsäi-lymisosuutta huomattavasti suurentava vaikutus johtuen uusien S-bakteereiden toiminnasta.

1) Streptococcus thermophilus'iin kuuluvien kantojen eristys: 25 Streptococcus thermophilus'iin kuuluvat kannat eris tettiin seuraavan menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet Ozawa et ai. /Bulletin of the national Institute of Agricultural Sciences, Series G (Husbandry), nro 5, sivu 41 (1953)^7- Lukuisia koaguloituneen maidon valmisteita, jotka 30 saatiin seisottamalla raakamaitoa 45-50°C:ssa 4-5 päivän ajan tai luonnollisesti hapantunutta maitoa tarkasteltiin mikroskooppisesti. Niitä näytteitä, joissa havaittiin varmuudella Streptococcus'in olemassaolo, siirrostettiin 10-%:iseen /W/W) rekonstituoituun kuorittuun maitoon, joka 35 oli steriloitu 115°C:ssa 15 minuutin ajan, konsentraatios- 8 76373 sa 5 % (V/V) ja viljeltiin 45-50°C:ssa. Sitten viljelmiä siirrostettiin 2-3 kertaa samalla tavalla kuin yllä ja yksi platinasilmukallinen viljelmiä levitettiin M-17-väliainetta oleville agarmaljoille /Applied Micro-5 biology 28 (1975) 6^, sivu 80/7 ja inkuboitiin 40°C:ssa 2-3 päivän ajan pesäkkeiden muodostumista varten. Pesäkkeiden solujen bakteriologisia ominaisuuksia verrattiin teoksessa Bergey's Manual of Determinative Bacteriology kuvattujen thermophilus-bakteereiden vastaaviin 10 ominaisuuksiin ja 40 kantaa indentifiointiin Streptococcus thermophilus'iksi.

2) Thermophilus-bakteereiden hapenottokyky: 40 kannalle, jotka kuuluivat niihin Streptococcus thermophilus1eihin, jotka eristettiin koaguloituneesta 15 maidosta ja luonnollisesti hapantuneesta maidosta, kannalle Streptococcus thermophilus 9Y, jonka lajoitti tri Morichi (National Institute of Animal Industry) autenttiseksi kannaksi LThe Japanese Journal of Zootechninal Science 53 (1982) 16Γ7 ja Streptococcus thermophilus 20 ATCC 19258:lie, joka saatiin American Type Culture Collection ' ista , josta tästä lähtien käytetään lyhennettä "ATCC", tehtiin hapenottokyvyn määritys seuraavalla tavalla .

Bakteerit siirrostettiin viljelyväliaineeseen 25 /Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 45 (1971) 423/ konsentraatiossa 5 % (V/V) ja tehtiin stationäärinen viljely 37°C:ssa 16 tunnin ajan. Solut erotettiin saadusta viljelyväliaineesta sentrifugoimal-la ja pestiin aseptisesti steriloidulla fysiologisella 30 suolaliuoksella. Solut suspendoitiin sitten steriloituun fysiologiseen suolaliuokseen konsentraatioon 3-5 mg solu-massaa (kuivapainon mukaan laskettuna) millilitraa kohti. Kunkin kannan hapenottokyky määritettiin Warburgin manomet-rimenetelmän mukaisesti /Yoshikawa et ai: Kagaku no Ryoiki 35 Journal of Japanese Chemistry) , erityisnumero nro 13,Marburg's 9 76373 manometer", Nankodo, helmikuu (1954 )J, kuten pääpiirteittäin esitetään alempana: Käytettiin astiaa, jossa oli kaksi sivuosaa. Yksi ml mainittua bakteerisuspensiota ja 0,5 ml steriloitua fosfaat-5 tipuskuriliuosta, jonka pH oli 6,0, pantiin reaktioastian pääosastoon ja kaksi 0,75 ml:n erää 20-%:ista (W/W) steriloitua rekonstituoitua kuorittua maitoa pantiin kahteen sivuosaan, jotka oli tarkoitettu substraattiliuokselle. Suodatinpaperi, joka oli kyllästetty 0,2 ml :11a 20-%:ista (W/V) 10 kaliumhydroksidiliuosta, pantiin lisäosastoon hiilidioksidin absorboijaksi. Astiaa ravisteltiin viiden minuutin ajan etukäteen 37°C:ssa ja sitten sivuosissa olleet substraatti-liuokset kaadettiin bakteerisuspension joukkoon. Hapenottokyky mitattiin joka kolmas minuutti maksimaalisen ottonopeu-15 den määrittämiseksi, joka määriteltiin hapenottokyvyksi.

Testattujen kantojen hapenottokyky on taulukoita taulukkoon 1.

Taulukko 1

Kanta Hapenottokyky nanomooleina 20 9Y 19,8 ATCC 19258 10,1 STH - 01 30,0 STH - 17 37,3 STH - 23 42,3 25 STH - 50 78,5 STH - 15 14,7 STH - 32 12,1 muut 34 kantaa vähemmän kuin 18,5

Kuten taulukosa 1 ilmenee, eristetyistä 40 kannas-30 ta 36 kannan hapenottokyky oli vähemmän kuin 18,5 nano-moolia, kun taas neljän kannan hapenottokyky oli 30,0 - 78,5 nanomoolia. Standardikannan 9Y ja kannan ATCC 19258 hapenottokyky oli 19,8 ja 10,1 nanomoolia, vastaavasti .

35 Tämän keksinnön tekijät yrittivät mitata niiden nel jän kannan hapenottokyvyn, joilla oli tällainen korkea ίο 7 6 3 7 3 hapenottokyky, saman menettelyn mukaisesti kuin Tinson'in et ai. menetelmässä. Kuitenkin näiden neljän kannan hapenottokyky oli niin huomattavan korkea, että Tinson'in et ai. esittämää 90 minuutin reaktion jälkeistä mittaus-5 ta . ei voitu soveltaa. Niinpä ajanjakso, joka vaaditaan 7,3 ^moolin happimolekyylejä ottoon, siten kuin Tinson et ai. ovat kuvanneet, mitattiin saman menettelyn mukaisesti kuin Tinson'in et ai. menetelmässä. Tinson'in et ai. saama arvo oli 90 minuuttia, kun taas kantojen STH-01 10 ja STH-23 arvot olivat 26, kannaan STH-17 arvo oli 28 ja kannan STH-50 arvo oli 21 minuuttia. Kannan 9Y ja kannan ATCC 19258 vastaavat arvot olivat 46 ja 140 minuuttia, vastaavasti. Kantojen STH-01, 17, 23 ja 50 hapenottokyky oli huomattavasti korkeampi kuin muiden kantojen. 15 Kantojen STH-01, 17, 23 ja 50 bakteriologiset ominaisuudet: Tämän keksinnön tekijät havaitsivat näiden neljän kannan bakteriologisia ominaisuuksia ja havaitsivat, että bakteriologiset ominaisuudet, lukuun ottamatta korkeaa 20 hapenottokykyä, olivat identtiset teoksessa Bergey's Manual of Determinative Bacteriology kuvattujen autenttisten thermophilus-bakteereiden vastaavien ominaisuuksien kanssa, kuten esitetään alempana: (A) 37°C:ssa 48 tunnin ajan M-17-agarmaljalla 25 aerobisesti inkuboidun solun muoto: a. Koko (halkaisija): 0,7 - 0,9 pm b. Muoto: pyöreä tai soikea, pareittain tai ketjuna (B) 37°C:ssa 48 tunnin ajan M-17-agarmaljalla ae-30 robisesti viljeltyjen pesäkkeiden muoto: a. Muoto: pyöreä b. Kohoaminen: kupera kehä c. Periferia: sileä d. Koko (halkaisija): 0,5 - 1,5 mm 35 e. Värisävy: vaikeahko ja läpikuultamaton n 76373 f. Pinta: sileä ja kiiltävä (C) Kaasu: ei tuota

(D) Ei kasva alemmassa lämpötilassa kuin 20°C

(E) Kasvaa 45°C:ssa 5 (F) Liikkumaton (G) Endosporia ei muodostu (H) Gram-positiivinen (I) Bentsidiini-negatiivinen (J) Katalaasi-negatiivinen 10 (K) Säilyy hengissä kuumennettaessa 65°C:ssa 30 mi nuutin ajan (L) Ei kasva, kun läsnä on 2 % (W(V) natriumkloridia (M) Ei kasva maidossa, joka sisältää 0,1 % (W/V) metyleenisinistä 15 (N) Ei kasva pH:ssa 9,6 (O) Tuottaa happoa glukoosista, fruktoosista, sakkaroosista ja laktoosista, mutta ei tuota happoa arabinoosista, ksyloosista, raffinoosista, maltoosista, trehaloosista, inu-liinista, mannitolista, sorbitolista, salisiinista eikä gly- 20 serolista (P) Ei tuota ammoniakkia arginiinista.

Jopa sen jälkeen, kun oli tehty siirrosviljelmä yli 20 kertaa, kannoilla oli korkea hapenottokyky. Niinpä tämän keksinnön tekijät luokittelivat nämä mikro-organismit uusik-25 si kannoiksi ja nimesivät kannat STH-01, STH-17, STH23 ja STH-50 nimillä Streptococcus thermophilus M-8202, Streptococcus thermophilus M-8203, Streptococcus thermophilus M-8204 ja Streptococcus thermophilus M-8205, vastaavasti, jotka kannat talletettiin laitokseen Fermentation Research 30 Institute, Agency of Industrial Science and Technology lokakuun 22. päivänä 1982, jolloin vastaavat talletusnume-numerot olivat FERM BP-351, FERM BP-352, FERM BP-353 ja FERM BP-354, vastaavasti.

4) Thermophilus-bakteereiden elävien solujen luku-35 määrän suhde lactobacillus-bakteereiden vastaavaan solujen lukumäärään : 12 76373

Kantoja M-8205 (STH-50) ja STH-32, tyypillisiä S-bakteereiden ja vastaavasti thermophilus-baktee-reiden, joilla on matala hapenottokyky, kantoja, ja Lactobacillus bulgaricus'ta ja Bifidobacterium longum'ia 5 (ATCC 15708), tyypillisten lactobacillus-bakteerikantojen bifidobakteereita, käytettiin fermentoidun maitotuotteen valmistamiseen. Thermophilus-bakteereiden elävien solujen lukumäärän suhdetta lactobacillus-bakteereiden vastaavaan vaihdeltiin fermentoiduissa maitotuotteissa ja bifidobak-10 teereiden hengissäsäilyminen niissä testattiin. Thermophilus-bakteereiden ja lactobacillus-bakteereiden käynnistäjät testiä varten valmistettiin siirrostamalla niiden alaviljelmiä erillisesti 10-%:iseen (W/W) rekonstituoituun kuorittuun maitoon, joka oli steriloitu 115°C:ssa 15 minuutin ajan, 15 kumpaistakin konsentraatiossa 3 % (V/V), minkä jälkeen viljeltiin 37°C:ssa 16 tunnin ajan. Bifidobakteereiden käynnistäjä valmistettiin siirrostamalla sen alaviljelmää 15-%:iseen (W/W) rekonstituoituun kuorittuun maitoon, joka sisälsi 0,25 % (W/W) hiivauutetta ja joka oli steriloitu 115°C:ssa 20 15 minuutin ajan, konsentraatiossa 10 % (V/V), minkä jälkeen viljeltiin 37°C:ssa viiden tunnin ajan. Thermophilus-bakteereiden ja lactobacillus-bakteereiden käynnistäjiä siir-rostettiin lehmän maitoon, joka oli homogenisoitu ja sitten steriloitu 90°C:ssa 10 minuutin ajan, ensin mainitun käyn-25 nistäjän suhteessa viimeksi mainittuun käynnistäjään (1) 1,0:2,0 (2) 1,5:1,5 (3) 2,5:0,5 (4) 2,8:0,2 ja (5) 5,9:0,1, tilavuusprosentteina ja sitten lisättiin vielä bi-fidobakteereiden käynnistäjää jokaiseen testikompositioon (1)-(5) konsentraatioon 5,0 % (V/V). Fermentaatiota suori-30 tettiin 40°C:ssa 3,5 - 4,5 tunnin ajan, minkä jälkeen välittömästi jäähdytettiin, jotta saatiin fermentoidut maito-näytteet, joiden pH oli noin 4,5. Thermophilus-bakteereiden ja lactobacillus-bakteereiden elävien solujen lukumäärät näissä fermentoiduissa maitonäytteissä ja näiden kahden 35 bakteerin lukumäärien suhteet, bifidobakteerien elävien solujen lukumäärän muutokset ja hengissäsäilymisosuus ja 13 76373 pH sen jälkeen, kun näytteitä oli säilytetty 5°C:ssa seitsemän päivän ajan, esitetään taulukossa 2. Thermophilus-bakteereiden ja lactobacillus-bakteereiden elävien solujen lukumäärien selektiivinen laskenta oli mahdollinen 5 johtuen bromikresolipurppuraa sisältävää ravintoväliainet-tä olevalla agar-maljalla olevien pesäkkeiden muodon erilaisuuksista. Bifidobakteereiden elävien solujen lukumäärä mitattiin MGLP-agar-pylväässä tapahtuneen pesäkkeiden muodostuksen avulla /Journal of Food Hygienic Society of 10 Japan 23 (1982) 3$J, joka väliaine on bifidobakteereiden selektiiviseen pesäkkeenmuodostukseen soveltuva väliaine sen jälkeen, kun on tehty desimaalinen laimennus fermen-toidusta maitonäytteestä Mitsuoka'n laimenninliuoksella, joka on tarkoitettu anaerobisia bakteereita varten /Mit-15 suoka: Rinshokensa (Journal of Medicinal Tehcnology) 18 (1973)1163/. Bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuus saatiin seitsemän päivän säilytyksen jälkeisen elävien solujen lukumäärän prosenttiosuutena (%) elävien solujen lukumäärästä välittömästi valmistuksen jälkeen.

20 Thermophilus-bakteereiden ja lactobacillus-baktee reiden elävien solujen lukumäärä fermentoiduissa maito-näytteissä sen jälkeen, kun näytteitä oli säilytetty seitsemän päivän ajan, jätettiin huomiotta, koska arvot olivat samantasoiset välittömästi valmistuksen jälkeen vallinnei-25 den arvojen kanssa.

14 70373

1 I m CM CM rH rH

•X H I I I I I

d :rö to ooooo

-P Wd rH rH rH rH rH

m :/d d ov in oo o m h mm— x x X x x - - - - -

S U1 0 <*> OrHinrHO

—I -H (0 — 04 rH VO in —(04 /d Cp ή ^ ·« « > C β n r-ι in iH vo 0) >1 <d ffii-i n 'f 'f in io VO vo O' r- O' d ooooo ooooo

-P r-I rH rH r-I rH rH rH »H rH i—I

-P I :d d d p x x x x x x x x x x ι-l M :<d d d :d —I o 04 vo m m ® rH en in Λί d g — — - — - - - - - - in 04 00 OJ —I H P4 H (N ^ C 03 :rd r~ co o o o- co »H n· in o

> n^^^in G

-H id P3 r- *v *- *v ►►·.·.·- itj :td +J ci. ^j· tj· ττ »r ί· 'f u (d (¾ m > O) OOOOCOCOCOOOOOOOOOOO d o-m oooooooooo d

rH rH rH i—1 ri rH rH »Hi—I Η -P

I :td w d P XXXXXXXXXX d a: :d > d:d in ο· vo vo o voovoviHoi

pqg ----- - C

I »—I I—I r-4 I—I OI »H »—I —I 04 04

CQ I J

, r~ ir-ii-irpmoo σ\ vo r- vo ο Φ <d ^ ^ ^ ό nd »h m m ο ο- o m σι σ\ η· χχ χΧ rΗ Π TT ι-Η Ό· d ^ Cfl c w

04 0) 00 CO Γ~· Γ" Γ" ΟΟΟΟΟ-Ο-Γ- G

m ooooo ooooo ;d

O ,¾ rHrHiHiHfHrHrHrHrHrH P

Λί d l :d ;d X -P d p XXXXXXXXXX :d d m * :d 6 rH -h d :d ooooovorn σνο-ο-οιη d

d g P) g — — — — »X

id »h m rH n· m oi en —4 vo in oi d B d J H c > αοοοοοοοοοοοοοοοοοσν > I :rd i o o o o o ooooo G \ H dP ,rHrHiH»HiH »HrH»—IrHrH -P-P d) t> 4J X :d -H· H Tr io d:d XXXXX XXXXXpp d

:id PI B d) d) »h <4P

g »HinxTiHrH ® OI in 00 H did) O

:0 G -P - - — - - - -- -- +J4J ω ·· jj OKO 'TinvoovrH m vo vo ov rH χχ >i

-p a; . rdd G -P

h -n o n m m o o 04 in m ,α,ο h-> cr> <υ -M

Hris in in in in in in in in in in 1 1 -h -H ad ;(d:rdQi — - — — — — — — - — ui m ρή > m «τ n· n· r? n· n* ^ dddJ ad -p »Η»—I o; p .—ti—1 :rd -HrH -M d) 0) :/d oooooooooo xj-h x d ad -r-ipq ---- - - -- -- rd C :d :td in in m in m in in in in in ολλ.....m -p EX! 0:d -P :d w> o m m 04 rH o m m 04 »h vi o d p m 4-1 H -P μ! ---- - - - - - - op -Had m

C4J 04 rH O O O 04 -4 O O O χ| U PHad ·· -H

β Kd -P <d -H H dl G

(/} o in in oo ov oininooov η Λ3 Ό C

:<d-P-P ---- - - Λ! £ >i v; rH en rH rH 04 04 in H H (N (N in p». d d :d enhd oqpi en x,

2 noiduin Hesm^injJ

Z d) m

„ M

oi in rj /d en o 4_i -P 04 3

Cl oo «j d , & H d

OT s X

15 76373

Kuten taulukosta 2 ilmenee, säilytyksen jälkeinen bi-fidobakteereiden hengissäsäilymisosuus kasvaa, kun STH-50:n elävien solujen lukumäärän suhde lactobacillus-bakteereiden vastaavaan välittömästi viljelyn päättymisen jälkeen kasvaa.

5 Se on 30-100 kertaa korkeampi, kun verrataan tapaukseen, jossa bakteereiden lukumäärien suhde on 0,5.

Päinvastoin taas STH-32:n tapauksessa, jolla kannalla on matala hapenottokyky, bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuus säilytyksen jälkeen on alhainen myös samoissa 10 olosuhteissa kuin olivat käytössä S-bakteereilla. Bifidobakteereiden säilytyksen jälkeistä merkitsevää hengissäsäi-lymistä ei missään tapauksessa voida taata käyttämällä STH-32:a, fermentoidun maidon thermophilus-bakteereita.

5) S-bakteereiden vaikutus bifidobakteereiden hengis-15 säsäilymissuhteeseen: Tämän keksinnön tekijät testasivat bifidobakteereiden hengissäsäilymistä, kun fermentoituja maitonäytteitä valmistetaan käyttäen S-bakteereita paitsi M-8205, thermophilus-bakteereita, joilla on matala hapenottokyky, paitsi 20 STH-32:a, standardia 9Y ja ATCC 19258:aa samalla tavalla kuin kuvataan edellä olevassa kappaleessa 4). Kun thermo-philus-bakteereiden elävien solujen lukumäärä oli noin 40 kertaa suurempi kuin lactobacillus-bakteerien ja kun fermentoituja maitonäytteitä säilytettiin 5°C:ssa seit-25 semän päivän ajan, bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuu-det ylittivät 10 % tapauksessa, jossa käytettiin S-bakteereita, kun taas kaikki hengissäsäilymisosuudet olivat alempia kuin 1 % niissä tapauksissa, joissa käytettiin thermophilus-bakteereita, joilla on matala hapenottokyky, 30 ja standardia 9Y ja ATCC 19258:aa, samoissa olosuhteissa. Päätellään, että S-bakteerit saavat aikaan huomattavan korkean bifidobakteereiden hengissäsäilymisen.

6) Thermophilus-bakteereiden vaikutus useiden erilaisten bifidobakteereiden hengissäsäilymiseen.

35 Seuraavat testit suoritettiin thermophilus-baktee reiden aktiivisuuksien arvioimiseksi useiden erilaisten

Ib 76373 hyvin tunnettujen bifidobakteereiden hengissäsäilymiseen fermentoidussa maidossa. Neljälle bifidobakteerikannalle Bifidobacterium bifidum ATCC 15696, Bifidobacterium in-fantis ATCC 15697, Bifidobacterium breve ATCC 15700 ja 5 Bifidobacterium adolescentis ATCC 15706 ja thermophilus-bakteereille ATCC 19258 ja M-8205 tehtiin testit.

Thermophilus-bakteereiden, lactobacillus-bakteerei-den ja bifidobakteereiden käynnistäjiä, jotka oli valmistettu samalla tavalla kuin kuvataan edeltävässä kohdassa 10 4), siirrostettiin erillisiin maitoväliaineisiin, jotka oli homogenoitu ja steriloitu 90°C:ssa 10 minuutin ajan, konsentraatiohin 2,8 % (V/V), 0,2 % (V/V) ja 1,5 % (V/V), vastaavasti. Fermentaatiota suoritettiin 40°C:ssa noin neljän tunnin ajan, minkä jälkeen viljelmät välittömästi 15 jäähdytettiin fermentoitujen maitonäytteiden valmistamiseksi, joiden pH oli 4,6. Bifidobakteerien elävien solujen lukumäärän muutokset, hengissäsäilymisominaisuudet, kun fermentoituja mainonäytteitä säilytettiin 5°C:ssa seitsemän päivän ajan ja pH esitetään taulukossa 3.

20 Thermophilus-bakteereiden elävien solujen lukumää rän suhde lactobacillus-bakteereiden solujen lukumäärään fermentoiduissa maitonäytteissä oli noin 30 kannan ATCC 19258 tapauksessa ja noin 20 kannan M-8205 tapauksessa.

17 7 637 3

C -H

<U :rö qj »n oi n n (U to x) l I i l X ad x3 o o o o oo in o n i—I 0) 3 »HrHiHtH k ·- #. ►,

:«J co tn oho moinrH

*1“ -H tl] ' X X X X H rH

tn-H

C C E Ή M VO o <U a) >i ·*- 01 S3 I—I VO rH I—I 00

X

3 — -P Cp

tn C •H CD P

g.n a) M* PO CM VO VO VO VO

H 3 dl o O O O O O O O

(d rH ^ Ή Ή rH rH «H rH rH i—(

>S:(0 X X X X X X X X

:rd M _ :njc:td o ** cm οι vo av in o> > 0) :td ·* * *- ·· ·“ ·» ·- · •H h S ^ Ή oi m η r-- vo n :tÖ > 3 Ή 3

o» W I—I

OOOOCMOr^^P-M* jr! ^'ροιη^'ιη'β'ιη^· Π. ►·.·„·» K K 4.

C I

a) 3

CO rH

X

3 c ·—· ro -P a) tn ^ _ υΐ-ηΟ'ΟΟΟΟνΟΟ-Γ'ΟΟΓ'

o -H s) P O o O O O O O O

g ,_|φ H H rH rH H rl rH rH

3 m ίο ~ x x x x x x x x rH > C £ :tTj VO CM Ό· o CM in PO ·Μ· <d -m α> 'ρ · *· *· * “ ·* ·“ ·-

E-l -P -rl Md Ό Ή Ή M· VO Γ— »H CM

CO > :td

:nl :cd E

E Ή 3 :0 C M χ nm O 00 rH «Tv OI in U0 00 •4JCUS3 Ό 1/1 vo in m in vo m H^j w ^ ^j· ^ «<* g Ή o o O' r» in m I C" I—I I"' >—< n vo σν vo σ>

m oo vo u Ov vo U

o voinouvotno u

o E m ErH Eo £H Em ErH So EH

,¾ 3 rH 3 3 0- 3 < 3 <-l 3 3 c-' 3 C

.n »H *H u **H m -Η ·ιΗ ·*Η Ο ·Η m »rl n] POPUPrHPCOPOPUPrHPO)

Il cu υ <u h cu o -m cu u o h cu <u -«h

cq ufH 4J«c -uo 4J4J ueh -p «: -uu 4-14J

^ uco υ u o c o *< o ouoc <d cd m «d E* id cu m cd en id H id cu

f? Xl B .O ·Ή JQ < S3 O O E ,Q-iH jQ < S3 CJ

li p 0 3 O 4J O OC0O3O-PO OIO

115 OOOCOOOOJOOOCOCUOCD

n -r_i -rl -rl -H Id M jQ ·*Η rH -rl «H -H Cd -H ^ **H rH

tr t, «P ΊΠ W U UH CD UHO Uh Uh UH UH Uh 0) UH O

mm -H -m -rl C -H lH *r| Ό -rl -H -rl C ·Η P ·Η Ό m xi ca -h cq λ m iu m xi cq-h oa xi mm 18 76373

Taulukosta 3 ilmenee, että bifidobakteereiden hengis-säsäilymisosuus fermentoidussa maidossa vaihtelee riippuen bifidobakteerilajista, mutta on käytettäessä S-bakteereiden kantaa M-8205 noin 800 - 100 000 kertaa niin korkea kuin 5 käytettäessä kantaa ATCC 19258. S-bakteereilla on huomattava useiden erilaisten hyvin tunnettujen bifidobakteereiden hengissäsäilymistä edistävä vaikutus bifidobakteereihin kohdistuvasta suojäävästä vaikutuksesta johtuen. Kun fermentoi-tuja maitotuotteita, jotka sisälsivät S-bakteereita ja bifi-10 dobakteereita, valmistettiin käyttäen Lactobacillus acidophilus' ta, Lactobacillus helveticus'ta, lactobacillus jugurti'a tai Lactobacillus casei'ta, jotka ovat taksonomisesti sukua Lactobacillus bulgaricus'ille, voitiin bifidobakteereiden hengissäsäilymisosuus myös varmistaa järjestä-15 mällä S-bakteereiden elävien solujen lukumäärä sellaiseksi, että se on korkeampi kuin 10 kertaa lactobacillus-bakteerei-den vastaava.

Esimerkki 1

Streptococcus thermophilus1 in M-8202 (STH-01) ala-20 viljelmä siirrostettiin 2 500 ml:aan 10-%:ista (W/W) rekonstruoitua kuorittua maitoa, joka oli steriloitu 90°C:ssa 30 minuutin ajan ja jäähdytetty, konsentraatiossa 3 % (V/V) ja viljeltiin 37°C:ssa 16 tunnin ajan. Erillisesti siirrostettiin Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842:n alaviljelmä 25 100 ml:aan väliainetta, jolla oli sama koostumus kuin yllä ja joka oli steriloitu 115°C:ssa 15 minuutin ajan ja jäähdytetty, konsentraatioon 3 % (V/V) ja viljeltiin 37°C:ssa 16 tunnin ajan.

Bifidobacterium longum ATCC 15708:n alaviljelmää 30 siirrostettiin 1 500 ml:aan viljelyväliainetta, joka sisälsi 0,2 % (W/W) hiivauutetta ja 10 % (W/W) kuoritun maidon jauhetta ja joka oli steriloitu 90°C:ssa 30 minuutin ajan, konsentraatioon 10 % (V/V) ja viljeltiin 37°C:ssa kuuden tunnin ajan.

35 Erillisesti 100 1 maitoa, jossa maitorasvan ja mai don ei-rasvapitoisen kiinteän aineen konsentraatiot sää- 19 76373 dettiin 3,1 %:ksi (W/W) ja 0,9. %:ksi (W/W), vastaavasti, kuumennettiin 60°C:seen, homogenoitiin paineessa 150 kg/cm2, steriloitiin 90°C:ssa 10 minuutin ajan ja jäähdytettiin 40°C: seen.

5 Steriloituun maitoon siirrostettiin kyseisiä kolmea käynnistäjää ja jaettiin 500 ml:n säiliöihin, suljettiin, fermentoitiin 40°C:ssa neljän tunnin ajan ja jäähdytettiin välittömästi. Näin saadulla fermentoidulla maidolla oli happamuus 0,78 % ilmaistuna maitohappokonsentraation avulla 7 10 ja se sisälsi 110 x 10 /ml Streptococcus thermophilus'ia, 6 6 75 x 10 /ml Lactobacillus bulgaricus’ia ja 90 x 10 /ml

Bifidobacterium longum'ia. Bifidobacterium longum'in elävien solujen lukumäärä fermentoidussa maidossa sen jälkeen, kun sitä oli säilytetty 5°C:ssa seitsemän päivän ajan, oli 12 x £ 15 10 /ml ja hengissäsäilymisosuus oli 13,3 %.

Esimerkki 2

Streptococcus thermophilus M-8204:ää (STH-23) siirrostettiin 30 litraan 18-%:ista (W/W) rekonstituoitua kuorittua maitoa, joka sisälsi 0,1 % (W/W) kasaminohappoa ja 20 joka oli steriloitu 90°C:ssa 30 minuutin ajan ja jäähdytetty 39°C:seen, konsentraatioon 3 % (V/V) ja fermentaatio suoritettiin 37-38°C:ssa 18 tunnin ajan. Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 siirrostettiin 2 litraan viljelyväliainetta, joka sisälsi 0,1 % (W/W) hiivauutetta ja 10 % (W/W) kuoritun mai-25 don jauhetta ja joka oli steriloitu 115°C:ssa 15 minuutin ajan ja jäähdytetty, konsentraatioon 3 % (V/V) ja fermentaatio suoritettiin 37°C:ssa 18 tunnin.ajan.

Bifidobacterium infantis ATCC 15697 siirrostettiin 19 litraan viljelyväliainetta, joka sisälsi 0,1 % (W/W) 30 kasaminohappoa, 0,1 % (W/W) hiivauutetta ja 12 % (W/W) kuoritun maidon jauhetta ja joka oli steriloitu 90°C:ssa 30 minuutin ajan ja jäähdytetty ja fermentaatio suoritettiin 37°C:ssa kahdeksan tunnin ajan.

65 kg siirappia, joka sisälsi 13 kg sokeria, 0,6 kg 35 haponkestävää karboksimetyyliselluloosaa ja 0,2 kg aromiainetta, steriloitiin erillisesti 120°C:ssa kahden sekunnin 20 76373 ajan ja jäähdytettiin noin 20°C:seen. 13 kg Streptococcus thermophilus -fermentoitua maitoa, 2 kg Lactobacillus acidophilus -fermentoitua maitoa ja 10 kg Bifidobacterium infantis -fermentoitua maitoa sekoitettiin 58 kg:aan sii- 2 5 rappia. Seos homogenisoitiin kahdesti paineessa 50kg/cm 2 ja 100 kg/cm ja täytettiin lasipulloihin, joiden tilavuus oli 200 ml, jolloin saatiin noin 400 pullollista fermentoi-tua maitojuomaa. Näin saatu fermentoitu maitojuoma, jonka 7 pH oli 4,8, sisälsi 32 x 10 /ml Streptococcus thermophilus'ia 10 22 x 10^/ml Lactobacillus acidophilus'ia ja 27 x 10^/ml

Bifidobacterium infantis'ia ja sillä oli happamuus 0,63 % ilmaistuna maitohappokonsentraationa. Bifidobacterium inf antis'in elävien solujen lukumäärä juomassa sen jälkeen, kun sitä oli säilytetty 5°C:ssa seitsemän päivän ajan, oli 29 x 15 10^/ml ja hengissäsäilymisosuus oli 10,7 %.

Claims (7)

21 763 7 3

1. Menetelmä viljelmän tuottamiseksi, joka viljelmä sisältää bifidobakteereiden ja maitohappobakteereiden 5 elävää solumassaa ja joka saadaan inkuboimalla suvun Bifidobacterium, suvun Lactobacillus ja Streptococcus thermophilus'in mikro-organismeja väliaineessa, joka sisältää maitoa yhtenä pääasiallisena aineosana, tunnettu siitä, että: 10 (a) viljelmä sisältää Streptococcus thermophilus'in FERM BP-351, FERM BP-352, FERM BP-353 ja/tai FERM BP-354, joiden hapenottokyky on vähintään 30 nanomoolia Streptococcus thermophilus'in kuivattujen solujen milligrammaa kohti minuutissa määriteltynä hapen kulutuksena, joka on määri- 15 tetty Warburgin manometrimenetelmän mukaisesti, (b) suvun Bifidobacterium solujen hengissäsäily-misosuus on vähintään 5 % ilmaistuna säilytyksen jälkeisen solujen lukumäärän suhteena prosenteissa säilytystä edeltävään solujen lukumäärään säilytettynä aerobisissa 20 olosuhteissa 5°C:ssa seitsemän päivän ajan ja (c) Streptococcus thermophilus'in elävien solujen lukumäärä on vähintään 10 kertaa suurempi kuin suvun Lactobacillus elävien solujen lukumäärä hetkellä välittömästi inkuboinnin jälkeen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että se sisältää kutakin elävää solumassaa seuraavasti g (a) vähintään 1 x 10 Streptococcus thermophilus1 ia, 7 (b) vähintään 2 x 10 suvusta Bifidobacterium, ja g 30 (c) vähintään 5 x 10 suvusta Lactobacillus maini tun viljelmän millilitraa kohti välittömästi viljelmän inkuboinnin jälkeen.

3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Streptococcus thermophilus 35 on vähintään yksi mikro-organismi, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat Streptococcus thermophilus M-8202 (FERM BP-351), Streptococcus thermophilus M-8203 76373 22 (FERM BP-352), Streptococcus thermophilus M-8204 (FERM BP-353) ja Streptococcus thermophilus M-8205 (FERM BP-354).

4. Menetelmä viljelmän valmistamiseksi, jotka viljelmä sisältää bifidobakteereiden ja maitohappobakteerei-5 den elävää solumassaa, tunnettu siitä, että siinä siirrostetaan käynnistäjäseosta, joka käsittää (a) suvun Bifidobacterium mikro-organismin käynnistäjän, (b) suvun Lactobacillus käynnistäjän ja (c) Streptococcus thermophi-lus'in. FERM BP-351, FERM BP-352, FERM BP-353 ja/tai FERM 10 BP-354, joiden hapenottokyky on vähintään 30 nanomoolia Streptococcus thermophilus1 in kuivattujen solujen milligrammaa kohti minuutissa määriteltynä hapen kulutuksena, joka on määritetty Warburgin manometrimenetelmän mukaisesti, käynnistäjän, väliaineeseen, joka sisältää maitoa yh-15 tenä pääasiallisena aineosana ja aerobisesti inkuboidaan mainittua väliainetta, tai että erillisesti siirrostetaan kutakin mainituista käynnistäjistä vastaavaan väliaineeseen, aerobisesti inkuboidaan kutakin mainituista väliaineista ja lopuksi sekoitetaan saadut viljelmät yhteen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että siinä painon mukaan laskettu sekoitussuhde suvun Bifidobacterium käynnistäjä:suvun Lactobacillus käynnistäjä:Streptococcus thermophilus1 in käynnistäjä on 100:0,5 - 50:3,0 - 600.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että väliainetta, johon on siirros-tettu sekoitettua käynnistäjää, inkuboidaan 37-42°C:ssa 3-24 tuntia.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n -30 n e t t u siitä, että siinä painon mukaan laskettu sekoitussuhde suvusta Bifidobacterium saatu viljelmä:suvusta Lactobacillus saatu viljelmä:suvusta Streptococcus thermo-philus'ista saatu viljelmä on 100:0,28 - 625:11 - 24 800. 76373 23