KR101279804B1 - 스트렙토코커스 마세도니커스 ｌｃ７４３ 균주를 함유하는 발효유 및 그 제조방법 - Google Patents

스트렙토코커스 마세도니커스 ｌｃ７４３ 균주를 함유하는 발효유 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 함유하는 발효유 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신규한 균주인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 스타터로 이용하여 제조한 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 함유하는 발효유 및 상기 균주를 원유에 접종하여 발효유를 제조하는 방법에 관한 것이다.
종균의 안정적인 공급으로 발효유의 생산단가를 낮추며, 또한 이를 이용하여 제조된 발효유는 색깔, 향, 맛, 종합적기호도 등에 있어서 기호성이 우수할 뿐만 아니라 종래에 발견된 젖산 발효균보다 면역활성 능력이 뛰어난 발효유를 생산할 수 있다.

Description

스트렙토코커스 마세도니커스 ＬＣ７４３ 균주를 함유하는 발효유 및 그 제조방법{Method for Preparing Fermented milk using Streptococcus macedonicus LC743}
본 발명은 신규한 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 이용한 발효유의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발효유 제조에 적합한 젖산 및 면역 활성능력이 있는 신규한 젖산균인 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743을 이용한 발효유의 제조방법 및 그에 의해 제조된 발효유에 관한 것이다.
발효유(Fermented milk)라 함은 우유(牛乳), 양유(羊乳) 따위를 유산균이나 효모균으로 발효시켜 만든 유제품을 말한다. 발효유는 통상적으로 몸의 영양을 돕는 자양 식료로 쓰이는 것이 일반적이며, 현재 발효유에 사용하는 젖산균으로는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 등이 주로 사용되어 있으며, 상기 발효유에 사용하는 젖산균은 매년 수입에 의존하고 있는 실정이다.
따라서 상기에서 언급한 젖산균 외에 외국에서 수입하지 않고서도 국내에서 원활한 공급이 이루어질 수 있는 신규의 젖산균 개발에 대한 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 원유 및 분변에 다양한 특성이 있는 젖산균이 존재할 것임에 착안하고, 면역활성 능력이 있는 발효유와 모짜렐라 치즈의 제조에 합당한 젖산균을 확보하고자 연구 노력한 결과, 원유로부터 신규의 젖산균인 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 (KACC91524P)을 분리하였다.
이에 본 발명자들은 이미 2010년 4월 22일자로 ‘면역활성능 및 우유응고력이 있는 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주’를 출원하였다(출원번호 : 10-2010 - 0037385).
본 발명자들이 이미 출원한 상기 균주에 대해 보다 상세하게 설명하면, 16S rRNA Gene Sequence를 토대로 판단한 결과 스트렙토코커스 마세도니커스로 판명되었고, 원유에서 분리한 탈지유 응고균주들 중 탈지유 응고속도와 면역생성 능력이 우수한 균주를 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743으로 명명하였다.
상기 균주의 Gene Sequence는 서열번호 1과 같고, 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하였으며, 2010년 2월 22일자로 미생물의 명칭은 Streptococcus macedonicus LC743이며, 수탁번호는 KACC91524P를 부여받았다.
본 발명은 상기 2010년 4월 22일자 출원의 이용발명으로, 보다 상세하게는 신규한 균주인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주의 면역활성능 및 우유응고력에 착안하여 상기 균주를 원유에 접종함으로써 제조한 발효유 및 그의 제조하는 방법에 관한 것이다.
종래기술로서 젖산균 스타터는 그램양성, 간상형 또는 구형, 호모젖산발효균으로서, 현재 발효유 또는 치즈의 스타터로서 이용되고 있으나 외국에서 수입된 종균을 사용하고 있으며, 국내에서 원유에서 분리하고, 면역활성 기능이 우수한 젖산균이 개발된 사례가 없었다.
이에 본 발명자들은 원유에서 분리한 신규의 젖산균이 젖산 및 면역활성 능력이 우수하여 발효유 제조에 적합함을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다. 결국, 본 발명의 주된 목적은 발효유 제조에 적합한 젖산 및 면역 활성능력이 있는 신규한 젖산균인 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743을 이용한 발효유의 제조방법 및 그에 의해 제조된 발효유를 제공함에 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 신규한 젖산균인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주(KACC91524P)를 이용하였다.
상기 균주는 면역분비능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 균주는 우유응고력을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 상기 균주인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 스타터로 이용하여 제조한 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 함유하는 발효유를 제공한다.
또한 본 발명은 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 원유에 접종하여 발효유를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법은 원유 또는 탈지분유를 180kgf/cm2∼250kgf/cm2의 압력으로 균질한 다음 85℃∼95℃에서 5분~30분간 살균시키는 단계; 상기 균질화 및 살균된 원유 또는 탈지분유를 35℃∼45℃로 냉각한 다음 원유에서 분리된 종균인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 0.5∼1.0중량부를 접종하여 최종 pH가 4.3∼4.6으로 될때까지 배양시키는 발효공정에 의해 발효액을 얻는 단계; 상기 발효액을 15℃∼20℃로 냉각하는 단계를 포함할 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 원유에서 채취한 젖산 발효균인 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743을 제공한다. 본 발명의 젖산균은 종래에 발견된 젖산 발효균보다 면역 생성 능력이 뛰어나며, 발효유를 제조하는데 매우 적합한 유리한 효과를 갖고 있다.
도 1은 7주간 실험식이 섭취한 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 7주간 실험식이 섭취한 마우스의 흉선지수과 비장지수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 7주간 실험식이 섭취한 마우스의 혈액과 복강 대식세포 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 7주간 실험식이 섭취한 마우스의 혈청과 복강 대식세포 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 상기 균주인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 스타터로 이용하여 제조한 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 함유하는 발효유에 관한 것이다.
또한 본 발명은 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 원유에 접종하여 발효유를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은 원유 또는 탈지분유를 180kgf/cm2∼250kgf/cm2의 압력으로 균질한 다음 85℃∼95℃에서 5분∼30분간 살균시키는 단계; 상기 균질화 및 살균된 원유 또는 탈지분유를 35℃∼45℃로 냉각한 다음 원유에서 분리된 종균인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 0.5∼1.0중량부를 접종하여 최종 pH가 4.3∼4.6으로 될때까지 배양시키는 발효공정에 의해 발효액을 얻는 단계; 상기 발효액을 15℃∼20℃로 냉각하는 단계를 포함할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 원유에서 분리된 종균 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유를 제공한다. 본 발명의 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주(KACC91524P)는 면역 활성을 증가시킬 수 있어, 상기 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 포함하는 발효유는 면역 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주는 면역 활성능이 우수하여, 본 발명에 의한 발효유는 다른 균주에 의한 발효유보다 면역 활성능이 우수하다.
본 발명의 신규 미생물인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주는 원유에서 분리되었으며, 후술하는 실험예의 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 미생물의 동정은 그의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다. 원유에서 분리한 신규의 젖산균이 젖산 및 면역활성 능력이 우수하여 발효유 제조에 적합함을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명자들은 원유 내에 포함된 균주를 변형 MRS배지에서 배양한 다음, 각 균락을 순수분리하고 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하고, 선발된 균주를 전기 변형 MRS 배지에서 도말한 후, 호기배양하여 순수분리 하였다. 순수분리된 균주를 동정한 결과, 균주는 그램양성 연쇄상 구균이며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하고 카탈라제와 운동성에 대해서는 음성으로 밝혀졌다. 또한, 15℃와 45℃에서 생장하였으며, 글루코스(glucose)로부터 가스와 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 스트렙토코커스(Streptococcus)에 속하는 것으로 확인하였다.
한편, 20종의 당 발효 시험을 실시한 결과, 락토스 등 4종으로부터 산을 생성하였고, 균주의 종(species)을 정하기 위하여, 16S rRNA 유전자 염기서열(Gene Sequence)를 이용하여 얻어진 결과 스트렙토코커스 마세도니커스로 판명되었다.
따라서 본 발명은 원유에서 분리한 탈지유 응고균주들 중 탈지유 응고속도와 면역생성 능력이 우수한 균주를 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743으로 명명하였다.
본 발명의 신균주의 생균수와 pH를 측정하여 젖산균의 생장을 시험한 결과, 최적온도는 40℃이었으며, 항생제 내성시험을 통해 생장여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC)값을 측정한 결과, 타 계열의 항생제에 비해 아미노글리코사이드계와 린코마이신에 대해 내성이 있는 반면 노보바이오신과 리팜피신에 감수성이 높다. 효소활성시험을 통해 나타난 결과, 류신 아릴아미다제와 산 포스파타제에서 효소활성이 가장 높게 나타났다.
또한 벤조피렌(Benzopyrene)을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있었다. 담즙내성을 MRS배지에서의 젖산균 성장을 시험함으로써 측정하였는바 7시간 동안 배양 후에 0.3% oxgall을 첨가하지 않았을 때는 젖산균 log수가 9.09, 0.3% oxgall을 첨가하였을 때는 8.39로서 거의 억제되지 않음에 따라 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 신균주의 pH 내성을 시험한 결과, 대조구 pH인 6.4에 비해 pH 3과 pH 4는 영향이 없었으나 pH 2에서 1시간 이후 약간 영향을 받는 것으로 나타났다. 항균력 시험에서는 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해 80.0%, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 68.42%, 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 81.54%의 억제력을 보였다. 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 치즈 제조에 적합한 젖산균임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 분리된 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743은 2010년 2월 22일 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁번호는 KACC91524P로 기탁하였다. 이하, 본 발명에서는 상기 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743을 편의상 S. macedonicus LC743으로 칭하였다.
본 발명은 상기에서 언급한 신규한 젖산균인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 발효유의 제조에 있어서, 상기에서 언급한 신규한 젖산균인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주(KACC91524P)를 원유에 접종하는 단계를 포함하는 발효유의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 원유에 접종하여 발효유를 제조하는 방법을 공정별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
[제1공정] 종균 및 벌크 접종균(bulk starter) 제조
원유에서 분리된 종균인 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 탈지유 또는 환원탈지유에 0.5～1%(v/v)로 접종하고, 37～42℃에서 12～24시간 동안 배양한다. 그런 다음, 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)가 배양된 상기의 배양액 종균을 80～90℃에서 30분～60분간 열처리된 탈지유 또는 환원탈지유에 0.5～1%(v/v)로 접종하고, 37～42℃에서 12～24시간 동안 배양하여, 이 배양액을 벌크 접종균으로 사용한다.
[제2공정] 발효액 제조
원유 0~100중량부와 탈지분유 0~10중량부를 첨가하고 55~65℃에서 배합하여 완전히 녹인 후 180~250kgf/㎠의 압력으로 균질한 다음 85~95℃에서 5~30분간 살균시킨다.
상기 과정을 통해 균질화시킨 원유를 35∼45℃ 정도로 냉각시킨 후 냉각시킨 균질화 우유 100중량부에 대하여 상기 제1공정에서 얻은 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)벌크 접종균을 0.5∼1.0중량부를 접종하여 최종 pH가 4.3∼4.6으로 될 때까지 배양시키는 발효공정에 의해 발효액을 얻은 다음 교반기로 교반하면서 발효액을 15∼20℃로 냉각하여 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효액을 얻는다.
[제3공정] 발효유 제조
상기에서 얻은 발효액에 부재료를 첨가하여 관능성을 향상시킬 수 있다.
상기 제2공정에서 얻은 발효액 70～90중량％와 부재료 10～30중량％를 혼합하고 교반하여 발효유를 제조한다.
상기에서 부재료는 당시럽, 과일 및 정제수의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 당시럽은 올리고당, 과당, 설탕, 포도당, 덱스트린의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상, 바람직하게는 올리고당과 과당을 사용할 수 있다.
상기에서 과일은 딸기쨈 또는 블루베리쨈을 사용할 수 있다.
상기에서 부재료는 올리고당 3.0～7.0중량％, 액상과당 1.0～5.0중량％, 딸기쨈 또는 블루베리쨈 4～10중량％ 및 정제수 1.0～10중량％를 사용할 수 있다.
상기에서 발효유를 제조한 후 용기에 충전한 다음 포장하여 저장할 수 있다.
상기에서 딸기쨈은 당도 55～65Brix, 딸기 함량 40～50%인 딸기쨈을 사용할 수 있다.
상기에서 딸기쨈은 당도 61.2Bx, 딸기 함량 45%인 딸기잼을 사용할 수 있다.
상기에서 블루베리쨈은 당도 55～65Brix, 블루베리 함량 40～50%인 블루베리쨈을 사용할 수 있다.
상기에서 블루베리쨈은 당도 62Brix, 블루베리 함량 40%인 블루베리잼을 사용할 수 있다.
상기에서 저장은 0~10℃, 바람직하게는 0~5℃의 온도에서 실시할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통해 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예 등은 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 등으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 미생물의 분리
서울우유 중부, 남부, 서부지도소 관할 원유검사소(경기도 및 강원도 일부), 전북 축산시험연구소, 경북 가축위생시험소에서 수거한 목장별 원유를 채취하여 브롬크레졸 퍼플(Bromcresol purple)과 소듐아자이드(sodium azide)가 첨가된 변형 MRS배지(이하 표 1 참조)에 0.3㎖씩 평면도말법으로 접종한 후 37℃에서 48시간 균주를 배양하였다. 배양 후 생긴 각각의 균락을 전기 변형 MRS 배지에서 순수분리하고, 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 3회 백금이로 도말한 후 호기배양 하여 순수분리 하였다. 순수분리 균주를 10% 환원 탈지유(Difco Laboratories, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 응고여부를 확인하였다. 하기 표 1은 본 발명의 균주 분리에 사용된 변형 MRS 배지의 조성에 관한 것이다.
성 분 성분비(그람/리터)
프로테오스 펩톤 #3 10.0
쇠고기 추출물 10.0
효모 추출물 5.0
락토스 20.0
트윈 80 1.0
암모늄 시트레이트 2.0
소디움 아세테이트 5.0
마그네슘 설페이트 0.1
망간 설페이트 0.05
디포타시움 포스페이트 2.0
소디움 아자이드 0.25
브로모크레졸 퍼플 0.04
[실시예 2] 면역 활성 젖산균주 선발
상기 실시예 1에서 순수분리된 젖산균주를 MRS 액체배지에서 5회 계대 배양하여 활성을 높인 후 10% 환원탈지분유에서 37℃에서 24시간 배양하여 응고된 균주만 선택하여 면역 활성 실험을 실시하였다. 상기 계대 배양은 2회 이상으로 할 수 있다.
분리된 균을 MRS broth에 접종한 다음 37℃에서 12시간 배양한 후(약 109cfu/ml 이 될 때까지) 1,500×g, 15분간 원심분리 하여 cell를 수집하였다. MRS broth는 suction한 후 Hanks' buffered salt solution 1.5㎖로 부유 시킨 후, 100℃에서 50분 동안 열처리하여 NO 분비능, IL-1α 및 TNF 분비능 시험을 실시하였다. 이때 시료농도는 1,000㎍/㎖이었다. 하기 표 2는 상업균주, 한국식품연구원에서 보관 젖산균주 및 분리균주의 면역실험 결과에 관한 것이다.
보관 젖산균 출 처 IL-1α
(pg/㎖)		 TNF
(pg/㎖)		 NO
(uM)
Lactobacillus acidophilus ATCC11506, IFO3205 1080.33 ± 24.30 2582.03 ± 38.32 4.34 ± 2.17
Lactobacillus casei 196 ATCC393 1080.9 ± 20.54 2195.24 ± 26.38 4.21 ± 1.92
Lactobacillus lactis subsp. lactis ATCC 21053 1161.57 ± 36.95 2100.98 ± 29.01 13.04 ± 1.01
Lactobacillus fermentum ATCC14931 445.21 ± 19.87 2219.42 ± 81.57 6.52 ± 1.42
Lactobacillus bulgaricus ATCC33409 1110.94 ± 21.25 2204.91 ± 41.22 6.69 ± 2.03
Lactococcus cremoris KFRI349 370.05 ± 54.23 2599.03 ± 27.54 2.17 ± 1.85
Lactobacillus helveticus ATCC15009 1912.53 ± 62.34 2732.22 ± 36.04 4.49 ± 2.73
Lactobacillus casei KFRI 709 371.76 ± 12.11 3302.04 ± 19.21 21.73 ± 1.84
Lactobacillus brevis ATCC8287, IFO3345 695.04 ± 29.73 2995.12 ± 72.63 13.04 ± 1.77
Lactococcus lactis NRRL B-633 580.59 ± 60.01 3104.56 ± 51.93 6.52 ± 2.76
Lactococcus diacetylactis NRRL B-2356 960.74 ± 51.92 3021.24 ± 38.26 4.34 ± 2.99
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC7830, IFO3376 693.01 ± 21.28 2610.71 ± 45.94 6.61 ± 3.10
선발 젖산균 LC743 1160.38 ± 57.44 3310.29 ± 33.21 54.35 ± 3.43
상기 표 2에서 보는 바와 같이 분리된 젖산균 LC743 균주는 Lactobacillus helveticus를 제외하고 인터루킨-1α 분비능이 가장 높았고 NO 분비능과 TNF 분비능은 타 균주에 비해 가장 우수함에 따라 면역능이 우수한 균주로 선발되었다.
[실시예 3] 미생물의 동정
미생물의 분류학적 동정은 Hammes 등[The prokaryotes, 1563-1578, 2nd Edition, Springer-Verlag Co.(1992)]의 방법에 따라 수행하였으며, 그 결과는 표 3에서 보는 바와 같다. 이들 균주는 공히 그램 양성, 연쇄상 구균이며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하였고, 카탈라제와 운동성은 음성이었다. 또한, 15℃와 45℃에서는 생장하였으며 포도당(glucose)으로부터 가스(gas)와, 아르기닌(arginine)으로부터 암모니아를 생성하지 않아 Streptococcus 속(genus)에 속하였다. 상기 균주를 20STREP kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 20종의 당발효 시험을 실시하였을 때 락토스 등 4종으로부터 산을 생성하였고, 균주의 종(species)을 정하기 위하여, 16S rRNA Gene Sequence를 이용하여 얻어진 결과 스트렙토코커스 마세도니커스로 판명되었다. 원유에서 분리한 탈지유 응고균주들 중 탈지유 응고속도와 면역활성 능력이 우수한 균주를 Streptococcus macedonicus LC743로 명명하고, 2010년 2월 22일 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 91524P로 기탁하였다. 하기 표 3은 본 발명의 신규 미생물 S. macedonicus LC743의 생리적 및 생화학적 특성에 관한 것이다.
균 주 S. macedonicus LC743
그램 반응
세포 형태
포자 형성
운동성
호기적 성장
혐기적 성장
카탈라제 반응
15℃에서 성장
45℃에서 성장
포도당으로 부터 가스생성
알기닌으로 부터 암모니아 생성 		+
cocci
-
-
+
+
-
+
+
-
-
기질이용 능력
Sodium pyruvate
Hippuric acid
Esculin ferric citrate
Payroglutamic acid-β-naphthylamide
6-Bromo-2-naphthyl-αD-galactopyranoside
Naphthol ASBI-glucuronic acid
2-Naphthyl-phosphate
L-Leucine - β - naphthylamide
L-Arginine
D-Ribose
L-Arabinose
D-Mannitol
D-Sorbitol
D-Lactose(bovine origin)
D-Trehalose
Inulin
D-Raffinose
Starch(2)
Glycogen		 +
-
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
발효유 용 스타터로서 적합한지 여부를 확인하기 위하여 S. macedonicus LC743을 10% 환원탈지유에 배양하면서 시험에 사용하였다.
[실시예 4] 미생물의 생장시험
젖산균의 생장은 생균수, pH를 측정하여 시험하였다. 생균수는 10% 탈지분유 150㎖에 젖산균을 1㎖용 피펫으로 1방울 접종한 후 34, 37, 40℃에서 3시간 간격으로 24시간까지 배양한 각 시료를 0.1% 펩톤용액에 희석하여 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 35℃에서 48시간 배양하여 계수하였고, 온도 및 시간별로 pH 변화를 측정한바, 최적온도는 40℃이었다.
[실시예 5] 항생제 내성시험
항생제 내성시험은 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, Difco, USA)를 사용하여 2배 희석방법에 의해 생장여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC) 값을 정하였으며, 측정한 결과는 표 4에 나타내었다. 하기 표 4는 S. macedonicus LC743의 항생제 감수성에 관한 것이다.
항생제 최저억제농도(㎍/㎖)
아미노글리코사이드계
아미카신 640
겐타마이신 1250
가나마이신 400
네오마이신 400
스트렙토마이신* 400
β-락탐계
페니실린-G* 20
메치실린 160
옥사실린 4
암피실린 640
그램-양성 스펙트럼
바시트라신* 10
리팜피신 7.5
노보바이오신 2.5
린코마이신 800
그램-음성 스펙트럼
폴리마이신B* 75
광범위 스펙트럼
클로람페니콜 80
반코마이신* 100
* : units/㎖
표 4에서 볼 수 있는 바와 같이 S. macedonicus LC743은 타 계열의 항생제에 비해 아미노글리코사이드계와 린코마이신에 대해 내성이 있는 반면 노보바이오신과 리팜피신에 감수성이 높은 것으로 나타났다.
[실시예 6] 효소활성 시험
효소활성 시험은 MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 동안 배양한 균주를 생리식염수로 희석하여 105~106 cfu/㎖ 수준의 시료를 조제한 후, API ZYM kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 37℃에서 5시간 동안 배양한 다음 효소반응을 시켰다. 효소활성은 표준색상표를 비교하여 0~5의 수치로 표시한 결과는 표 5에 나타내었다. 표준색상표에 의거한 표 5에는 0에서 5까지 단계별로 표준색이 명시되어 있으며, 0은 음성이고 5는 최대의 강도를 나타낸다. 1은 5나노몰(nanomoles), 2는 10나노몰, 3은 20나노몰, 4는 30나노몰, 5는 40나노몰 이상의 효소활성을 나타낸다. 하기 표 5는 S. macedonicus LC743의 효소활성 비교에 관한 것이다.
효 소 효소활성
S. macedonicus LC743
알칼라인 포스파타제
에스테라제(C4)
에스테라제 리파제(C8)
리파제(C14)
류신 아릴아미다제
발린 아릴아미다제
시스틴 아릴아미다제
트립신
카이모트립신
산 포스파타제
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라제
α-갈락토시다제
β-갈락토시다제
β-글루크로니다제
α-글루코시다제
β-글루코시다제
N-아세칠-β-글루코스아민니다제
α-만노시다제
β-푸코시다제 		0
0
0
1
5
2
2
0
0
5
3
3
0
0
1
0
0
0
0
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이 S. macedonicus LC743이 류신 아릴아미다제와 산 포스파타제에서 효소활성이 가장 높게 나타났다. 벤조피렌(Benzopyrene)을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 담즙내성시험
담즙내성시험은 길리랜드와 월커의 방법(Gilliland & Walker, J. Dairy Sci., 73, 905, 1990)에 따라 S. macedonicus LC743 균주의 담즙내성을 측정한 결과 담즙첨가에 약간 억제를 받기는 하나 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다.
[실시예 8] pH 내성시험
pH 내성시험은 클라크 등의 방법(Clark et al., Cultured Dairy Products J., 28(4), 11, 1993)에 따라 측정한 결과는 표 6에 나타내었다. 즉 하기 표 6은 염산용액에서 3시간 후의 S. macedonicus LC743의 내성 비교에 관한 것으로 단위는 CFU per ㎖(Log number)이다.
배양시간 (hr) pH 2 pH 3 pH 4 pH 6.4
0 7.14 7.15 7.14 7.16
1 6.76 7.15 7.16 7.17
2 6.19 7.05 7.15 7.19
3 5.33 7.05 7.18 7.22
상기 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이 대조구 pH인 6.4에 비해 pH 3과 pH 4는 영향이 없었으나 pH 2에서 1시간 이후 약간 영향을 받는 것으로 나타났다.
[실시예 9] 항균력 시험
항균력 시험은 길리랜드와 스펙(Gilliland & Speck, J. Food Prot., 40(12), 820, 1977)에 따라 측정한 결과는 표 7에 나타내었다. 즉 하기 표 7은 MRS 배지에서 S. macedonicus LC743 균주의 식중독균 억제결과에 관한 것이다.
식중독균 생 장 억제율(%)
식중독균a S. macedonicus LC743a
CFU/㎖ pH CFU/㎖ pH
Escherichia coli 7.0×106 6.41 1.4×106 5.66 80.00
Salmonella typhimurium 9.5×106 6.40 　3.0×106 5.79 68.42
Staphyloccous aureus 1.3×107 6.41 2.4×106 5.61 81.54
* : S. macedonicus LC743의 초기 수 : 6.0x106CFU/㎖
a : 37℃에서 6시간 배양 후 측정
상기 표 7에서 알 수 있듯이, 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해 80.0%, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 68.42%, 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 81.54%의 억제력을 보였다.
[실시예 10] 발효유의 제조(1)
원유 96.15중량부와 탈지분유 3.85중량부를 첨가하고 65℃에서 배합하여 완전히 녹인 후 215± 35kgf/㎠의 압력으로 균질화하였다. 90℃에서 5분간 살균하고, 40℃로 냉각시킨 다음 상기 냉각시킨 균질화물 100중량부에 대하여 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743(KACC91524P) 벌크 접종균 1.0중량부를 접종하여 최종 pH가 4.4로 감소할 때까지 배양시키는 발효공정에 의해 발효액을 얻은 다음 교반기로 서서히 교반하면서 발효액을 17± 2.5℃로 냉각하여 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효액을 얻었다.
상기에서 얻은 발효액 84중량％에 올리고당 5.0중량％, 액상과당 2.0중량％, 딸기쨈 4.0중량％, 정제수 5.0중량％를 첨가하여 혼합한 다음 교반하여 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유를 얻었다. 하기의 표 8에 상기 발효유의 성분을 나타내었다.
상기 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 (KACC91524P) 벌크 접종균은 원유에서 분리된 종균인 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 환원탈지유에 1％(v/v)로 접종하고, 39.5± 2.5℃에서 18± 6시간 동안 배양한 다음, 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)가 배양된 상기의 배양액 종균을 85± 5℃에서 45± 15분간 열처리된 환원탈지유에 1％(v/v)로 접종하고, 39.5± 2.5℃에서 18± 6시간 동안 배양한 것을 사용하였다.
[실시예 11] 발효유의 제조(2)
딸기쨈 4.0중량％ 대신에 6.0중량％, 정제수 5.0중량％ 대신에 3.0중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 10과 같은 방법으로 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유를 제조하였다.
[실시예 12] 발표유의 제조(3)
딸기쨈 4.0중량％ 대신에 8.0중량％, 정제수 5.0중량％ 대신에 1중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 10과 같은 방법으로 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유를 제조하였다.
[실시예 13] 발효유의 제조(4)
딸기쨈 4.0중량％ 대신에 블루베리쨈 4.0중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 10과 같은 방법으로 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유를 제조하였다.
[실시예 14] 발효유의 제조(5)
딸기쨈 4.0중량％ 대신에 블루베리쨈 6.0중량％, 정제수 5.0중량％ 첨가 대신에 3.0중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 10과 같은 방법으로 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유를 제조하였다.
[실시예 15] 발효유의 제조(6)
딸기쨈 4.0 중량％ 대신에 블루베리쨈 8.0중량％, 정제수 5.0중량％ 첨가 대신에 1.0 중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 10과 같은 방법으로 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 포함하는 발효유를 제조하였다.
하기 표 8은 실시예 10 내지 실시예 15의 발효유 성분을 비교하여 기재한 것이다. 단위는 중량％이다.
항목(중량％) 실시예 10 실시예
11		 실시예
12		 실시예
13		 실시예
14		 실시예
15
원 유 80.77 80.77 80.77 80.77 80.77 80.77
탈지분유 3.23 3.23 3.23 3.23 3.23 3.23
올리고당 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
액상과당 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
딸기쨈* 4.0 6.0 8.0 - - -
블루베리쨈** - - - 4.0 6.0 8.0
정제수 5.0 3.0 1.0 5.0 3.0 1.0
* 당도 61.2Bx, 딸기 함량 45%인 딸기쨈.
** 당도 62Brix, 블루베리 함량 40%인 블루베리쨈.
[실험예 1] 관능검사
발효유 관련분야에서 2년 이상 근무한 13명의 인원을 관능검사요원으로 하여 상기 실시예 10 내지 실시예 15의 방법에 의해 제조한 발효유 및 대조구 발효유의 색깔, 맛, 조직감 및 종합적 기호도와 같은 관능검사를 9점 평점법으로 실시하여 그 결과를 아래의 표 9에 정리하여 나타내었다.
항목 관능검사
색깔 맛 조직감 종합적기호도
실시예 10 6.97±1.59 6.36±1.77 6.48±1.25 6.41±1.48
실시예 11 6.90±1.27 7.14±1.12 6.67±1.26 7.13±1.11
실시예 12 6.79±1.56 7.33±1.28 7.12±0.87 7.20±0.95
실시예 13 6.47±1.34 6.54±1.45 6.59±1.79 6.54±1.36
실시예 14 7.14±1.35 6.68±1.58 6.91±1.29 6.85±1.42
실시예 15 7.51± 1.52 7.37± 1.52 7.16± 1.27 7.33± 1.14
대조구** 6.14± 1.50 6.39± 0.97 6.58± 1.79 6.45± 1.28
* 1 : 매우 좋지 않음, 5: 보통, 9: 매우 좋음
** 대조구는 서울우유사의 퓨오레 제품
상기 표 9에서처럼 본 발명의 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주를 함유한 발효유에 당시럽 및 과일쨈을 첨가하여 기호성이 우수한 발효유를 제조할 수 있었다.
[실험예 2] 동물실험 결과
젖산균주를 이용한 발효유의 면역 증진 효과를 알아보기 위하여 수컷 SPF C57BL/6 마우스 45두를 대상으로 하여 대조구로 10% 환원탈지유를 투입한 그룹(A), Streptococcus macedonicus LC743 균주를 포함하는 발효유 투입 그룹(B)와 상업균주(ABT-D : Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus로 구성된 혼합균주, Rhone-poulenc 사)로 제조한 발효유 투입한 그룹(C)을 각각 설정하고 경구투여 방법을 선택하여 각각의 발효유를 각각 5ml/kg/day씩 SPF C57BL/6 마우스 45두의 위내로 7주(week) 동안 직접 투여하였다.
시료 용량은 시판되고 있는 드링크 발효유 150ml 2개 용량/성인 체중 60kg을 1일 기준으로 결정하였다.
[실험예 2-1] 체중변화 측정
각 군의 마우스들의 성장 여부를 조사하기 위하여 체중변화를 조사하였다. 그 결과 도 1에서 보는 바와 같이, 실험군과 대조군 모두 유의적인 차이를 보이지 않았다.
[실험예 2-2] 장기무게 측정
전체 실험 기간 중 간 무게는 A 군과 C 군은 비슷한 반면 B 군은 상대적으로 낮았다(표 10 참조). 그러나 전체적으로 대조군에 비하여 유의성 있는 변화를 보이지는 않았고, 기타 장기에 있어서도 유의성 있는 변화가 인정되지 않았다. 따라서 Streptococcus macedonicus 743 균주 첨가한 발효유와 상업균주(ABT-D) 첨가한 발효유의 급여는 장기 무게에 유의성이 인정되지 않았다. 하기 표 10은 7주간 급여한 C57BL/6 마우스의 장기 무게 변화(g/mice) 에 관한 것이다.
Group A B C
Liver 1.03± 0.06 1.02± 0.05 1.03± 0.09
Spleen 0.06± 0.01 0.06± 0.02 0.06± 0.01
Kidney 0.31± 0.03 0.31± 0.04 0.31± 0.04
Lung 0.18± 0.03 0.18± 0.03 0.18± 0.03
Thymus 0.10± 0.02 0.11± 0.19 0.11± 0.15
Heart 0.14± 0.01 0.14± 0.02 0.14± 0.02
Testis 0.21± 0.02 0.20± 0.03 0.20± 0.02
Cerebrum 0.31± 0.03 0.31± 0.03 0.30± 0.01
Cerebellum 0.11± 0.02 0.12± 0.03 0.11± 0.02
[실험예 2-3] 비장지수와 흉선 지수
비장지수는 B, C그룹에서 유의성 있는 증가가 관찰되었으며(P<0.05) 특히 B 그룹에서 더욱 높게 나타났다(P<0.05)(도 2 참조). 이 결과는 Streptococcus macedonicus 743 첨가 발효유가 마우스의 면역활성에 영향을 미칠 수 있음을 보여주는 것이다.
[실험예 2-4] 발효유 식이투여가 마우스의 혈액과 복강 대식세포 활성
대식세포가 분비하는 사이토카인들 중 TNF-α와 IL-1β, IL-6 등은 대식세포가 활성화 되었을 때 분비하는 대표적인 사이토카인으로 널리 알려져 있다.
대식세포 활성화의 지표로 혈중 TNF-α와 IL-1β, IL-6의 함량을 ELISA 사이토카인 kit (R&D system, USA)를 사용하여 측정한 결과(도 3) IL-6는 그룹 B에서 유의성 있게 증가하였고(p<0.05) C 그룹에서도 증가하는 경향을 보였으며, TNF-α는 B 그룹에서 유의성 있게 증가하였다(p<0.05). 혈청중 IL-1β는 B, C 에서 약간 증가하는 경향을 보였으나 유의성은 관찰되지 않았다.
혈액 중 대식세포 활성에 관여하는 사이토카인의 검사결과 TNF-α와 IL-6는 B군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었다.
마우스의 대식세포 활성화의 지표로 혈청 중 TNF-α와 IL-1β, IL-6의 함량을 ELISA 사이토카인 kit (R&D system, USA)를 사용하여 측정한 결과(도 4) IL-1β는 그룹 B에서만 증가하는 경향을 보였고, TNF-α는 B, C 그룹에서 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였으며, 특히 S. macedonicus 743를 함유한 그룹 B에서 가장 높게 나타났다. IL-6는 그룹 B와 C에서 증가하였는데 그룹 B에서는 유의성 있는 증가를 보였다.
마크로파지 활성에 관여하는 사이토카인의 검사결과 TNF-α와 IL-1β, IL-6 모두 B군에서 유의성 있는 증가가 관찰되어 S. macedonicus 743를 함유한 발효유가 마우스의 면역기능을 증강시킬 수 있음을 시사하였다.
이상에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하였다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니고, 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물이 존재한다. 또한 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되고, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743를 통해 종래에 발견된 젖산 발효균보다 증진된 면역분비능 및 우유응고력을 얻을 수 있으므로 본 발명은 산업상 이용가능성이 우수하다.
또한 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743는 발효유 제조에 매우 적합하므로 유(乳)가공식품산업발전에 이바지 할 수 있을 것으로 사료된다.
농업생명공학연구원 KACC91524 20100222
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 함유하는 발효유.
  2. 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 원유 또는 탈지분유에 접종하고 배양시키는 발효공정에 의해 얻은 발효액과 올리고당, 과당, 설탕, 포도당, 덱스트린의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 당시럽; 딸기쨈 또는 블루베리쨈의 과일; 및 정제수 중에서 선택된 어느 하나 이상의 부재료를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효유를 제조하는 방법.
  3. 원유 또는 탈지분유를 180kgf/cm2∼250kgf/cm2의 압력으로 균질한 다음 85℃∼95℃에서 5분∼30분간 살균시키는 단계;
    상기 균질화 및 살균된 원유 또는 탈지분유를 35℃∼45℃로 냉각한 다음, 원유에서 분리된 종균인 스트렙토코커스 마세도니커스 LC743 균주(KACC91524P)를 원유 또는 탈지분유 100중량부에 대하여 0.5∼1.0중량부를 접종하고, 최종 pH가 4.3∼4.6으로 될 때까지 배양시키는 발효공정에 의해 발효액을 얻는 단계;
    상기 발효액을 15℃∼20℃로 냉각하는 단계;
    상기 냉각된 발효액 70∼90중량％와 올리고당, 과당, 설탕, 포도당, 덱스트린의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 당시럽; 딸기쨈 또는 블루베리쨈의 과일; 및 정제수 중에서 선택된 어느 하나 이상의 부재료 10∼30중량％를 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) LC743 균주(KACC91524P)를 원유에 접종하여 발효유를 제조하는 방법.
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