CN101366734A - 合生素药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生态调节剂,属于微生态制剂的范畴。该产品中含有两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜酸乳杆菌以及低聚果糖、低聚半乳糖、维生素等。具体的生产工艺如下:1.将各菌株分别或混合培养进行液体深层高密度培养,得到发酵液;2.发酵液经过离心处理后收集菌泥,加入保护剂制成冻干粉;3.将冻干粉混加微胶囊囊材经过空气悬浮处理制成微胶囊;4.将微胶囊和低聚糖、维生素等混合后制成合生素药物组合物。此产品通过直接补充人体肠道内双歧杆菌和嗜酸乳杆菌,同时提供益生元使有益菌进入肠道后能够快速激活并增殖,调整和改善肠道微生态系统,从而达到调节机体免疫力、延缓衰老、抑制肿瘤、调节血脂、改善肠胃的目的。本产品的制备方法能解决现有益生菌类药品不易在常温下维持益生菌的稳定性和在酸性条件下不稳定的技术问题,提供一种常温稳定贮存的药物组合物。
Description
技术领域:
本发明涉及一种肠道微生态调节剂,属于微生态制剂的范畴。微生态调节剂是用可以调整微生态平衡、提高宿主的健康水平或增进其健康状态的益生菌及其代谢产物以及其它促进剂合成的制剂。按构成微生态制剂可分为益生素(Probiotic)、益生元(Prebiotic)、合生素(Synbiotic)三种,本发明是一种合生素,是用一种或一种以上的双歧杆菌与一种或一种以上的肠道有益菌分别发酵或混合发酵后,配合一种或一种以上的益生元以及维生素制备而成。此产品通过直接补充人体肠道内双歧杆菌和嗜酸乳杆菌,同时提供益生元使有益菌进入肠道后能够快速激活并增殖,调整和改善肠道微生态系统,从而达到调节机体免疫力、延缓衰老、抑制肿瘤、调节血脂、改善肠胃的目的。
背景技术:
微生态学作为一门新兴的生命科学分支,是研究正常微生物与其宿主间相互依赖、相互制约的边缘学科。随着近年来微生态学的迅猛发展,以微生态调节剂为主的新类药品,及其保健品、饲料添加剂、植物生长促进剂方面正在形成产业,创造出可观的经济和社会效益。
益生菌的现代定义最早在1965年被(Lilliy,Stillwell)阐述为“由一种微生物分泌刺激另一种微生物生长的物质”。Fuller在(1989-1991)经过大量的研究工作,将益生菌定义为“益生菌是以活菌形式提供补充,通过促进肠道内微生物的平衡对宿主产生有益影响”。1994年,在德国Herbom召开的益生菌研讨会又对其进行了修订,定义为:“益生菌是活菌和(或死菌)包括组分和产物的微生物制剂,供口服或者经由其他粘膜途径投入,旨在粘膜表面处改善微生物和酶的平衡或刺激特异性和非特异性免疫机制”。1998年(Guarmer)提出了更精练的定义:“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。关于益生菌的精确定义,虽众说纷纭,但基本内涵是一致的。国际权威机构FAO/WHO(2001)和EFFCA(2002)给出的益生菌定义基本一致,都包含了以下两个性质:一是益生菌是活的微生物;二是通过摄入充足的数量,对宿主产生经论证的功能性健康益处。目前益生菌应具备这两种性质的观点已被国外大多数学者接受。
益生菌应用标准为:①来源于人体的常居微生物;②具有耐受胃酸和肠道胆汁的能力;③能够粘附在人的消化道黏膜细胞上;④能够在人的消化到内定植;⑤能够产生抗菌物质;⑥能够影响新陈代谢(如胆固醇吸收、乳糖酶的活性、维生素的产生,蛋白质的分解),能够调节免疫应答;⑦能够在生产加工和保存过程中成活并具有一定数量的活菌;⑧无副作用和安全无害的食品或药品。
益生菌的主要作用可概述如下:
(1)拮抗、屏障作用:利用益生菌具有的定植性、排他性和繁殖性,通过与肠黏膜上皮细胞相互作用而密切结合,与正常菌群一起占据肠黏膜表面,共同形成一道生物学屏障,提高上皮细胞的防御能力,而其代谢产物如小分子酸、过氧化氢和细菌素等活性物质形成了一个化学屏障,阻止致病菌、条件致病菌的定植和入侵。
(2)免疫调节作用:益生菌通过激活巨噬细胞可提高非特异性及特异性免疫反应、自然杀伤细胞活力,增强细胞因子表达水平,促进免疫球蛋白特别是分泌性IgA的表达。同时增强体液免疫和细胞免疫,提高巨噬细胞的吞噬活性。
(3)代谢营养作用:益生菌通过促进糖类、脂类、酶类、氮的代谢和合成维生素产生有益机体的营养作用,并防治有些疾病的产生,如乳糖不耐症、高胆固醇血症、高血脂、大肠癌等。
G.R.Gibson等在1995年提出了益生元这一概念。益生元是指一类非消化性的物质,能够选择性地刺激肠内一种或是几种有益菌生长和繁殖,抑制有害菌生长,对宿主健康具有有益的作用,因其可以促进双歧杆菌生长和/或繁殖,故也称为“双岐因子”。
益生元包括低聚糖、微藻及天然植物等。低聚糖类如低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等,大多具有良好的水溶性,粘度低,不结合矿物质,口感清爽,甜度低,且酸稳定性、热稳定性和储存稳定性均较好,无不良风味;微藻类如螺旋藻、节旋藻等,分布于土壤、沼泽、淡水、温泉以及一些极端环境中,含有丰富的优质蛋白、微量元素和矿物质、酶和天然色素和大量不饱和脂肪酸,胆固醇含量很低、不含饱和脂肪酸,消化率高;天然植物包括蔬菜、中草药、野生植物等。低聚果糖是国际公认的双歧因子,通过服用可以促进体内益生菌生长和/或是繁殖,进一步可以改善人体消化吸收系统功能,有助于改善便秘和促进人体新陈代谢。
合生素(Synbiotics)是一种典型的微生态调节剂,是益生菌(Probiotic bacteria)和益生元(Prebiotics)的混合制剂。合生素既可以发挥益生菌的生理活性,又可选择性地增加这种菌的数量,使益生菌的作用更加显著、持久,还可通过益生元的加入提高益生菌的适应性。合生素正成为人们防止疾病,维护健康的重要生物调节剂。它既有见效快的近期效果,如预防治疗急慢性腹泻、便秘、改善胃肠道功能等功能;又有积极的远期效应,如通过降低人体内毒素水平,改善肝病症状,提高抗病毒、抗肿瘤能力,并且对人体无副作用。它将是微生态调节剂今后发展的一个方向。
目前,大多数微生态制剂存在以下问题:益生菌制品主要是活菌制剂,大多属专性厌氧菌,极易受到温度、氧气、水分及酸碱等外界环境因素的影响,通常情况活性保持较困难。目前市场上销售的益生菌产品,为保证其在有效期内的活菌数,一般采用2~8℃低温储存,但低温储存条件却限制了产品的储运及市场销售。除此之外,益生菌制品最大的问题是益生菌产品在口服时,容易受到胃酸的作用,在达到起效部位肠道之前活菌数会大幅度下降,从而影响益生菌产品的疗效或保健作用。
发明内容:
本发明的一个目的是提供一种含有活性益生菌的合生素药物组合物。
本发明的另一个目的是提供所述的含有活性益生菌的合生素药物组合物的制备方法。
本发明的目的是这样实现的,一种含有活性益生菌的合生素药物组合物,其特征是:该产品是用一种或一种以上的双歧杆菌与一种或一种以上的肠道有益菌分别发酵或混合发酵后,配合一种或一种以上的益生元以及维生素制备而成。
人的消化道包括空腔、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠;其中胃、十二指肠含菌量很少,绝大多数存在于直肠中。整个胃中的菌落计数低于103/g(内容物),这是由于胃内的高酸度决定的。而小肠的菌量则从每毫升内容物104个道回盲肠的106~107个,限制小肠内细菌生长的主要因素是肠内容物的排空速度及胆汁和胰液的分泌。直肠是一个密集的微生态系统,通常有几百种细菌,典型菌量为(1011~1012)/g,大部分为严格厌氧菌,其中双歧杆菌占最主要地位。
本发明中涉及的双歧杆菌的种类有:两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和嗜热双歧杆菌,用于本发明合生素药物组合物的菌种是两歧双歧杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌。
双歧杆菌(Bifidobacterium)是法国巴斯德研究所Tisser博士于1899年首次从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到的,是宿主(人和动物)肠道内的主要微生物种之一,呈多样形态:Y字形、V字形、弯曲状、刮勺状,典型形态为分叉杆菌。革兰氏染色阳性,亚甲基蓝染色菌体着色不规则。无芽抱、鞭毛和荚膜,不运动。菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳白或自色并具有柔软的质地。营养要求苛刻,生长繁殖需多种双歧因子。发酵葡萄糖通过果糖一6-磷酸支路生成摩尔比1:1.5的乳酸和乙酸及少量甲酸,能利用按盐作为氮源,不还原硝酸盐。专性厌氧,在好氧条件下他们不能在平板培养基上生长,某些菌种在CO2存在时能够增强对氧气的耐受性。过氧化氢酶反应阴性,对氧的敏感性存在不同菌种或菌株的差异。最适生长温度35-41℃,最低生长温度2528℃,最高生长温度4345℃。起始生长最适pH值6.5-7.0,pH值4.5以下或8.5以上不生长,酸性环境(pH=5.5)对菌体存活不利。DNA的G十C含量为摩尔分数55%-67%。由于它的许多特性与乳酸菌相同,因此多数学者将它认定为乳酸菌成员。
本发明中涉及的肠道有益菌的种类有:保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌、罗特氏乳杆菌、短乳杆菌,用于本发明合生素药物组合物的菌种是嗜酸乳杆菌。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)属于乳杆菌属(Lactobacillus),两端圆,通常为0.6~0.9?.5~6靘,以单个、成双或成链出现,无鞭毛,不运动,革兰氏染色阳性。最适生长温度为35℃~38℃,20℃以下不生长,最高生长温度43℃~48℃,耐热性差。最适pH为5.5~6.0,生长初始pH为5.0~7.0,耐酸性强,能在其它乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖。同型发酵乳糖,不液化明胶,接触酶阴性,G+C的含量为36.0%~37.4%,菌落较小,边缘不太整齐,是一类厌氧或兼性厌氧的微生物。
双歧杆菌和嗜酸乳杆菌是人体中固有的有益菌,占人体肠道内益生菌的95%以上,它们主要是通过维护肠道的微生态平衡而起到促进人体健康的作用。二者在肠道中的作用是相似的,但存在的部位不同,嗜酸乳杆菌在肠道的上半部,而双歧杆菌在肠道的下半部。因此,双歧杆菌和嗜酸乳杆菌相辅相成,共同维护着整个肠道的健康。
两者综合起来具有以下几个方面的作用:
(1)改善制品的风味,提高制品的营养价值:乳酸菌可利用可发酵糖,产生酸味柔和的乳酸。另外,发酵过程中还可产生醋酸、丙酸等有机酸及醇、醛、酮多种风味物质。它们在赋予制品以酸味的同时,使制品风味更佳。食品原料经发酵后,能使蛋白质、脂肪和糖类改性或分解为人体更易吸收的消化状态,同时还能增加可溶性钙、磷、铁和某些B族维生素的含量,提高它的消化吸收性能和营养价值。
(2)抗菌和整肠作用:乳酸菌进入人体消化道后,就在肠道内繁殖,产生乳酸、乙酸和一些抗菌物质,使肠道的pH值和氧化还原电位降低,从而能抑制致病菌和有害于人体健康菌的生长繁殖,可起到抗菌防病的作用。同时,乳酸菌的大量生长繁殖也维持了肠道菌群的平衡,起到了整肠作用。
(3)防癌和抗癌作用:乳酸菌在肠道内的繁殖可改善肠道菌群的组成,促进肠道的蠕动,从而减少了致癌物在肠道内的停留时间:乳杆菌和双歧杆菌还能发酵分解致癌物N亚硝基胺,起到了抗癌的作用;乳酸菌及其代谢产物能诱导干扰素和促细胞分裂剂的产生,活化自然杀伤细胞(NK)并产生免疫球蛋白抗体,从而活化巨噬细胞的功能,增强人体的免疫能力,提高对癌症的抵抗力。
(4)降低胆固醇:乳酸菌菌体成分或菌体外代谢物有抗胆固醇因子。乳酸菌的代谢能显著减少肠管对胆固醇的吸收,同时,乳酸菌吸收部分胆固醇并将其转变为胆酸盐排出体外
(5)抗辐射作用:乳酸菌及其发酵产物有保护造血系统和抗突变的作用。
(6)延缓衰老:现代医学认为,人体衰老是因为体内自由基积累而引起的。如果能够降低机体内的自由基水平,就可以延缓衰老过程。乳酸菌能够清除体内产生的自由基.从而具有延缓细胞衰老延年益寿的作用。
(7)抑菌物质的产生:乳酸菌具有一定的保藏作用。根据早期研究由糖发酵产生的有机酸,赋予产品良好的保藏效果。产品pH值的降低和产生的有机酸(乳酸和醋酸)起主要的抑制作用。很少的细菌能在如此低的pH值增殖。
本发明中所涉及的益生元有:低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖、低聚葡萄糖、大豆低聚糖、棉子糖、水苏糖和壳聚糖,用于本发明合生素药物组合物的是低聚果糖和低聚半乳糖。
低聚果糖为果糖和葡萄糖通过β-2,1糖苷键连接,平均果糖基4.8个,低聚果糖可以采用微生物酶法生产或水解菊粉获得,不被任何哺乳动物所消化。体内实验证明每天服用15g的低聚果糖,2周后双歧杆菌数量由6%升到22%,类杆菌由25%降到0.4%,肠内腐败物质明显减少。
低聚半乳糖由几个半乳糖基与一个葡萄基经β-1,6键连接。由乳糖为原料经曲霉产生的β-半乳糖苷酶酶法生产。低聚半乳糖是难消化的碳水化合物,几乎所有人体双歧杆菌和乳酸菌都利用它为碳源,而不被绝大多数的肠道有害菌利用,是一种很好的双歧杆菌增殖因子。每日摄取10克,一周后粪便中双歧杆菌大大提高,而肠道腐败细菌和由腐败细菌产生的致癌因子次胆汁酸减少,葡萄糖醛酸酶和硝基还原酶的活性液明显下降。
本发明的合生素药物组合物产品是采用如下方法制备的:
1、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的培养:
(1)菌种活化:将低温保存的菌种在室温下放置12-36小时,在无菌条件下吸取液体活化培养基加入安瓿管中,取菌物接种于液体活化培养基和琼脂平板上,36-38℃条件下厌氧培养48-72小时,再连续活化三代,作为母培养物。
双歧杆菌活化培养基:胰蛋白胨5.0g、酵母提取物10.0g、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温80 1.0mL、盐溶液40mL、加水定容至1000mL,调节pH6.8-7.0,121℃灭菌20min。其中盐溶液的成分为:氯化钙0.2g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠10.0g、磷酸氢二钾1.0g、氯化钠2.0g、加水定容至1000mL。
嗜酸乳杆菌活化培养基:酵母提取物5.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、醋酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、吐温80 1.0mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、磷酸氢二钾2.0g、加水定容至1000毫升,pH6.2-6.4,121℃灭菌20分钟。
(2)种子培养物的制备:将母培养物接入种子液体培养基中,接种量为1%-3%,在36-38℃条件下厌氧培养12-18小时,作为种子培养物。
双歧杆菌种子培养基:植物胨5.0g、酵母提取物2.0g、水解酪蛋白10.0g、葡萄糖5.0g、吐温80 1.0mL、5%半胱氨酸盐10.0mL、磷酸氢二钾2.0g、氯化镁0.5g、硫酸锌0.25g、氯化钙0.15g、氯化铁微量,加水定容至1000毫升,pH6.4-6.6,115℃灭菌20分钟。
嗜酸乳杆菌种子培养基:番茄汁50mL、酵母提取物5.0g、牛肉膏10.0g、乳糖20.0g、葡萄糖2.0g、醋酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、吐温801.0mL、加水定容至1000毫升,pH6.6-7.0,121℃灭菌20分钟。
(3)单菌/混菌发酵培养:将种子培养物接入发酵液体培养基中,接种量为5%-10%,在36-38℃条件下厌氧培养12-18小时进行发酵罐高密度培养,发酵过程中维持罐压0.1kg/m3以上,流加氨水和葡萄糖保持pH=5.5,葡萄糖浓度=4g/L,发酵8-14小时进行补料后继续培养6-8小时。
发酵培养基:蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨5.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母提取物5.0g、牛肉膏10.0g、水解酪蛋白10.0g、葡萄糖20.0g、醋酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、可溶性淀粉0.5g、吐温801.0mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g,加水定容至1000毫升,pH6.0-7.0,115℃灭菌30分钟。
2、离心分离:将上述发酵液用离心机在4℃条件下5000~8000r/min进行离心,用无菌水洗涤2~3次,取下层沉淀即为活性菌泥。
3、添加冻干保护剂冻干:在无菌操作条件下,称取一定量的活性菌泥与冻干保护剂混合,彻底搅拌均匀,在真空度0.5Pa,冷冻温度-40℃,冻干时间为7-10小时的条件下冻干得到混菌冻干粉,其中保护剂的用量为菌泥重量的30%-55%。
所述冻干保护剂的制备如下(重量百分比):脱脂奶粉35%-50%、乳糖10%-30%、谷氨酸钠10%-20%、维生素C钠0.5%-3%、淀粉20%-45%、无机盐0.5%-5%,加水定容至100ml,加热搅拌使其溶化,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
4、添加包埋液包埋:在无菌操作条件下,同时称取一定量的含有活性菌泥的保护液和包埋液,彻底搅拌均匀,囊材为心材重量的30%-50%。
所述囊材的制备如下(重量百分比):海藻酸钠10%-30%、明胶10%-20%、丙烯酸树脂10%-25%、脂肪酸30%-50%、硬化油脂25%-40%,加水定容至100ml,搅拌10分钟,静置2~6小时,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
5、包埋固化液的制备:称取氯化钙0.1~15.0克、氯化钾0.1~10.0克、加水定容至100ml,彻底溶解,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
6、微胶囊的制备:将保护液和包埋液的混合液灌入包埋喷射器中,高压注入固化液中,并需要不断搅拌,混合液与包埋固化液的比例按1:1-1:5,经2~8小时的包埋固化处理,过滤,并用无菌水洗涤1次,然后再用冷冻干燥技术进行冷冻干燥。
7、合生素药物组合物的制备:将上述益生菌微胶囊与低聚果糖、低聚半乳糖进行混合配比,同时添加一定量的维生素制成该药物组合物。
本发明与现有技术相比,具有以下优势:
(1)采用高密度培养技术(High Cell-Density Culture),也就是高密度发酵技术。一般来说,高密度培养是指应用一定的培养技术或装置提高菌体的发酵密度,使菌体密度较传统培养方式有显著的提高,从而达到减少培养体积,还可以缩短生产周期,最终提高特定产物的比生产速率,减少设备投资从而降低生产成本,提高在市场上的竞争力。
与常规低密度培养相比,高密度高表达培养具有以下优点:1)使单位体积的生产能力提高几倍甚至几十倍。2)减小设备体积,有利于保证基因工程的安全性。3)对下游纯化有利,能减小纯化设备和纯化步骤。
(2)采用微胶囊技术:a.改变物料的存在状态和体积:将物料转化成微细可流动的固体粉末,使其稳定,便于贮存、运输与使用;b.隔离或保护活性成分:可以使易发生作用的配料相互隔离,使之可共存于同一物质中,同时也能保持活性菌的生物活性;c.控制心材的释放:利用微胶囊对芯材的释放时间和速率进行控制,使其在最佳条件下释放,以避免不良反应,改善品质、延长贮存期。
(3)益生菌与益生元的复配:既可发挥益生菌的生理活性,又可以激活体外补充益生菌、选择性地增加肠道益生菌的数量使益生菌的作用更显著持久。
附图说明:
附图为合生素药物组合物的生产工艺流程图。
具体实施方案:
实施例1:合生素药物组合物的成分及含量(单菌发酵/100g)
两歧双歧杆菌(1.0×109cfu/g) 5g
长双歧杆菌(1.0×109cfu/g) 5g
青春双歧杆菌(1.0×109cfu/g) 5g
嗜酸乳杆菌(1.0×1010cfu/g) 5g
低聚果糖 30g
低聚半乳糖 25g
麦芽糊精 10g
蔗糖 10g
VB1、VB2、VC、VB6、VB12 各1.0g
实施例2:合生素药物组合物的成分及含量(混菌发酵/100g)
两歧双歧杆菌(2.0×109cfu/g)
长双歧杆菌(3.0×109cfu/g)
青春双歧杆菌(2.0×109cfu/g)
嗜酸乳杆菌(2.0×1010cfu/g) 共20g
低聚果糖 25g
低聚半乳糖 25g
麦芽糊精 10g
蔗糖 10g
VB1、VB2、VC、VB6、VB12 各1.0g
实施例3:合生素药物组合物的制备
1、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的培养:
(1)菌种活化:将低温保存的菌种在室温下放置12小时,在无菌条件下吸取液体活化培养基加入安瓿管中,取菌物接种于液体活化培养基和琼脂平板上,37℃条件下厌氧培养72小时,再连续活化三代,作为母培养物。
(2)种子培养物的制备:将母培养物接入种子液体培养基中,接种量为2%,在37℃条件下厌氧培养18小时,作为种子培养物。
(3)发酵培养:将种子培养物接入发酵液体培养基中,接种量为5%,在37℃条件下厌氧培养18小时进行发酵罐高密度培养,发酵过程中维持罐压0.1kg/m3以上,流加氨水和葡萄糖保持pH=5.5,葡萄糖浓度=4g/L,发酵12小时进行补料后继续培养6小时。
2、离心分离:将上述发酵液用离心机在4℃条件下8000r/min进行离心,用无菌水洗涤2次,取下层沉淀即为活性菌泥。
3、添加冻干保护剂冻干:在无菌操作条件下,称取一定量的活性菌泥与冻干保护剂混合,彻底搅拌均匀,在真空度0.5Pa,冷冻温度-40℃,冻干时间为10小时的条件下冻干得到混菌冻干粉,其中保护剂的用量为菌泥重量的40%。
所述冻干保护剂的制备如下(重量百分比):脱脂奶粉40%、乳糖15%、谷氨酸钠15%、维生素C钠2%、淀粉25%、无机盐3%,加水定容至100ml,加热搅拌使其溶化,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
4、添加包埋液包埋:在无菌操作条件下,同时称取一定量的含有活性菌泥的保护液和包埋液,彻底搅拌均匀,囊材为心材重量的30%。
所述囊材的制备如下(重量百分比):海藻酸钠15%、明胶15%、丙烯酸树脂15%、脂肪酸30%、硬化油脂25%,加水定容至100ml,搅拌10分钟,静置4小时,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
5、包埋固化液的制备:称取氯化钙10.0克、氯化钾5.0克、加水定容至100ml,彻底溶解,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
6、微胶囊的制备:将保护液和包埋液的混合液灌入包埋喷射器中,高压注入固化液中,并需要不断搅拌,混合液与包埋固化液的比例按1:3,经2~8小时的包埋固化处理,过滤,并用无菌水洗涤1次,然后再用冷冻干燥技术进行冷冻干燥。
7、合生素药物组合物的制备:将上述益生菌微胶囊20g与低聚果糖30g、低聚半乳糖25g进行混合,同时添加VB1、VB2、VC、VB6、VB12各1.0g以及麦芽糊精、蔗糖各10g制成该药物组合物。
实施例4:株系耐受生理胆汁盐含量和胃的低pH
将4株益生菌的对数生长期培养液以2500r/min离心5min,弃上清,以无菌PBS缓冲液洗涤菌体3次,调菌浓度为108CFU/mL,将4株菌分别接种于人工胃液中,用HCl和0.1mol.L-1的NaOH调pH为2.0、3.0、4.0,置37℃厌氧培养箱中孵育,分别于第10、60、90、180min,取1mL菌悬液作活菌记数,pH为6.2的菌悬液作为0min正常对照,计算在各pH条件下益生菌菌株的存活率。
由表1可以看出,在pH为2.0时,菌株的活菌数随着时间的延长呈渐进性降低,长双歧杆菌的活菌数下降最明显;在pH为3.0时,菌株的活菌数基本保持不变;在pH为4.0时,各株菌在3h内均保持较稳定的存活率。
表1 菌株在不同pH胃液中的存活情况
将4菌株的对数生长期培养液以2500r/min离心5min,弃上清,以无菌PBS缓冲液洗涤菌体3次,调菌悬液浓度为108CFU/mL;试验开始时,将4株菌分别接种至含人工肠液的MRS培养基中,并调胆盐质量分数分别为0.3%、0.5%;接种比例为5%,设不加人工肠液的MRS培养基为空白对照组,各做3只复管,置37℃厌氧培养箱中孵育。分别于第60、90和240min取样,平板计数法计数活菌数。0min的浓度为:菌悬液浓度×1/20(mL)。
由表2可见,四株菌在含胆盐质量分数为0.3%的MRS培养基中生长良好,与不加胆盐的对照组相比,4h内活菌数没有显著差异;在含胆盐质量分数为0.5%的MRS培养基中,各菌株的活菌数在4h后有轻微下降,说明该菌株能耐受高达0.3%的胆盐。
表2 菌株在人工肠液中的存活情况
实施例5:菌株生长过程中降胆固醇作用
高胆固醇培养基(MRS基本培养基中添加0.2%巯基乙酸钠,0.3%新鲜牛胆汁,20%马血清)10mL,取出2mL置于干净试管中,4℃保存作为空白对照,其余8mL按1%接种量接入新活化的细菌培养物,37℃厌氧培养适宜时间18~20h后,4℃,12 000g离心10min除去菌体细胞,取上清液测定其中的胆固醇含量,同时测定空白样品中的胆固醇含量,胆固醇含量的测定采用直接皂化比色法测定,两者的差值即为菌体在生长过程中代谢胆固醇的量。
表3 菌株生长过程中降胆固醇作用
菌株 | 降胆固醇量mg/L | 降胆固醇百分比% |
两歧双歧杆菌 | 114.34 | 49.47 |
长双歧杆菌 | 87.22 | 38.52 |
青春双歧杆菌 | 90.42 | 39.94 |
嗜酸乳杆菌 | 112.02 | 49.56 |
表3为各菌株在培养基中生长时降胆固醇的量。由表9可以看出,37℃厌氧培养16h后,所测菌株降解胆固醇的量在87.22~114.34mg/L(38.52%~49.47%)。其中两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌降解胆固醇的能力最强,降胆固醇的量在50%左右。本实验所测益生菌都具有一定降解胆固醇的能力,这也是益生菌有益于身体健康作用的重要方面。
实施例6:合生素药物组合物对肠道致病菌的体外抑菌和杀菌活性
以常见的肠道致病菌弗氏痢疾杆菌、多耐药性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为靶细菌,以倾注平板法检测本发明的合生素药物组合物对这些病原微生物的体外杀菌活性。
首先,在含有5ml按本发明方法制得的合生素药物组合物溶液的试管内加入约5μl致病菌悬液105CFU/ml,并于37℃保温24小时。预培养后,于实验的0、2、6小时分别取1ml试验样品加于15ml溶融的营养琼脂中,混合后倾注于培养平板上。将平板置于37℃培养箱中保温24小时后观察并记录所形成的细菌菌落数,使用生理盐水作为对照。
表4合生素药物组合物对肠道致病菌的体外抑菌和杀菌活性
从表4所示的结果可以看出,胃肠道致病菌与按本发明方法制备的合生素药物组合物接触约两小时后,分散于营养琼脂培养基中的所有弗氏痢疾杆菌、多耐药性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌几乎全部被杀死。接触6小时后,敏感性较低的金黄色葡萄球菌也被杀死。实验结果表明,本发明方法制备的合生素药物组合物表现有十分显著的体外杀菌活性。
实施例7:合生素药物组合物对小鼠非特异性免疫功能的影响
以体重约20-25g的健康小鼠作为动物模型,以鸡红细胞作为吞噬细胞,将动物随机分成实验组和对照组(每组10只),常规饲养3天后,对实验动物每天每只灌胃投用按本发明方法制备的合生素药物组合物溶液0.5ml,连续投用15天,对照组动物则饲以同体积的生理盐水。15天后,断颈处理动物并收集腹腔吞噬细胞,以生理盐水洗过的鸡红细胞作为靶细胞,高倍显微镜下计数并记录实验组和对照组动物腹腔巨噬细胞的红细胞吞噬数,并由之计算巨噬细胞的百分吞噬率(%)和吞噬指数,结果如下列表5所示。
表5合生素药物组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
组别(n=10) | 百分吞噬率(%) | 吞噬指数(X±SD) |
实验组 | 88.42±5.51 | 5.27±0.56 |
对照组 | 67.7±8.08 | 24.2±0.62 |
巨噬细胞吞噬异物的能力代表哺乳动物非特异性免疫功能之一,从表3所示数据可以看出,本发明的合生素药物组合物表现有良好的非特异性免疫功能增强活性,故在临床上有能用作为免疫增强及使用。
实施例8:酶含量的影响
类固醇和其它致癌化合物在肝内代谢,然后与葡糖醛酸酶缀合,胆汁将缀合的葡糖醛酸内脂化合物递送到小肠,再到达结肠,在结肠中葡糖醛酸酶能水解这些化合物,由此释放毒性化合物进入结肠。肠内菌能产生降解脲为氨的脲酶,高数量的氨对肠上皮细胞有毒。此外来源于蔬菜的糖苷在小肠内不被吸收,经过小肠到达结肠,在结肠它们可以通过β-葡糖苷酶作用水解,形成有毒或致诱变的苷元化合物。
在实验过程中,在益生菌摄取和合生素药物组合物摄取期间,β-葡糖醛酸酶、脲酶和β-葡糖苷酶的含量减少了,摄取后酶的水平恢复到正常,该合生素药物组合物比益生菌混合物对酶的水平有更强的降低作用。
表6 酶含量的变化(nmol/分钟/g粪便)
葡糖醛酸酶和葡糖苷酶的代谢产生了致癌化合物,通过本发明的合生素药物组合物产生的酶活性的显著降低清楚地证明了与致癌物质形成降低有关的积极效果。
实施例9:肠内脂的含量
作为合生素药物组合物摄取的结果,最初肠内脂水平<10nmol/l的受试者的肠内脂水平明显增加了,在试验期间,没有观察到在实验开始时血清肠内脂水平已经正常(10<X<30)的人的肠内脂水平有变化。
表7试验期间肠内脂的含量(根据最初的水平分组)
10<X<30nmol/l | <10nmol/l | |
最初的水平 | 24.4 | 3.2 |
益生菌 | 19.8 | 2.6 |
合生素药物组合物 | 23.9 | 11.2 |
已经证明肠内脂含量与患癌症的风险明显相关:含量越高,风险越低,因此,该结果也表明本发明的合生素药物组合物对降低癌症风险具有有益的效果。
实施例10:治疗实验性结肠炎肠道炎症
6~8周龄小鼠,体重18~22g,分为正常对照组、DSS组、SASP组和合生素药物组(Syn组),每组各8只,按Cooper等的方法建立小鼠急性DSS结肠炎模型。自实验开始的第1~7天,DSS组、SASP组和Syn组小鼠喂含5% DSS的蒸馏水,对照组小鼠喂蒸馏水,实验第8天处死小鼠。SASP组小鼠于实验第1天开始至实验结束时,每天予20mg/kg体重SASP溶于0.1ml蒸馏水灌胃。Syn组小鼠自实验开始前7天至实验结束,每天予0.1ml 108cf u/ml合生素药物灌胃。实验结束后检测各组小鼠炎症肠段肿瘤坏死因子(TNF)2α、核因子(NF)2 κ BP65、髓过氧化物酶(MPO)等的表达。
表8 各组结肠组织MPO活性、TNF2 α、LDH水平和NF2 κ BP65阳性细胞数
组别 | MPO活性(U/g组织) | TNF2 α(pg/mg/ml) | LDH(mU/mg/ml) | NF2κ B P65阳性细胞数 |
对照 | 1.63±0.21 | 1.82±0.25 | 250.1±19.7 | 8±2 |
DSS | 3.63±0.23 | 13.35±1.01 | 558.6±15.4 | 56±10 |
SASP | 3.21±0.20 | 10.01±1.11 | 491.5±22.3 | 34±12 |
Syn | 3.24±0.16 | 10.45±0.98 | 489.2±32.7 | 38±7 |
实验结果显示,小鼠DSS结肠炎的炎症肠组织高表达TNF2α,经合生素药物治疗的小鼠炎症肠组织表达TNF2 α明显减少。LDH是灵敏反映组织细胞损伤程度的指标,其检测结果也显示,该合生素药物能有效减轻实验性结肠炎结肠黏膜组织的损伤。给小鼠预先口服合生素药物后,结肠损伤程度明显减轻,黏膜层炎性细胞中P65阳性细胞数较DSS组明显减少,说明补充双歧杆菌能有效抑制炎症肠段炎性细胞因子的表达和肠黏膜免疫反应。
Claims (14)
1.一种合生素药物组合物,其特征在于:该合生素药物组合物是用一种或一种以上的双歧杆菌与一种或一种以上的肠道有益菌分别或混合高密度发酵培养后,配合一种或一种以上的益生元以及维生素制备而成。
2.根据权利要求1所述的合生素药物组合物,其特征在于:所述双歧杆菌为婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的合生素药物组合物,其特征在于:所述肠道有益菌为德氏乳杆菌保加利亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌和罗伊氏乳杆菌中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的合生素药物组合物,其特征在于:所述益生元为低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖、低聚葡萄糖、大豆低聚糖、棉子糖、水苏糖和壳聚糖中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的合生素药物组合物,其特征在于:所述合生素药物组合物中还配合有各种维生素。
6.根据权利要求1所述的合生素药物组合物,其特征在于:所述的一种或一种以上的双歧杆菌与所述的一种或一种以上的其他肠道有益菌可以分别发酵培养,也可以混合发酵培养。
7.根据权利要求1所述的合生素药物组合物,其特征在于:所述的一种或一种以上的双歧杆菌与所述的一种或一种以上的其他肠道有益菌采用的发酵培养方式为高密度发酵培养。
8.制备权利要求1所述的合生素药物组合物的生产工艺,其特征在于:该合生素药物组合物是经过下述方法制成的:
(1)两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的培养:
A.菌种活化:将低温保存的菌种在室温下放置12-36小时,在无菌条件下吸取液体活化培养基加入安瓿管中,取菌物接种于液体活化培养基和琼脂平板上,36-38℃条件下厌氧培养4872小时,再连续活化三代,作为母培养物。
B.种子培养物的制备:将母培养物接入种子液体培养基中,接种量为1%-3%,在36-38℃条件下厌氧培养12-18小时,作为种子培养物。
C.单菌/混菌发酵培养:将种子培养物接入发酵液体培养基中,接种量为5%-10%,在36-38℃条件下厌氧培养12-18小时进行发酵罐高密度培养,发酵过程中维持罐压0.1kg/m3以上,流加氨水和葡萄糖保持pH=5.5,葡萄糖浓度=4g/L,发酵8-14小时进行补料后继续培养6-8小时。
(2)离心分离:将上述发酵液用离心机在4℃条件下5000~8000r/min进行离心,用无菌水洗涤2~3次,取下层沉淀即为活性菌泥。
(3)添加冻干保护剂冻干:在无菌操作条件下,称取一定量的活性菌泥与冻干保护剂混合,彻底搅拌均匀,在真空度0.5Pa,冷冻温度-40℃,冻干时间为7-10小时的条件下冻干得到混菌冻干粉,其中保护剂的用量为菌泥重量的30%-55%。
(4)添加包埋液包埋:在无菌操作条件下,同时称取一定量的含有活性菌泥的保护液和包埋液,彻底搅拌均匀,囊材为心材重量的30%-50%。
(5)微胶囊的制备:将保护液和包埋液的混合液灌入包埋喷射器中,高压注入固化液中,并需要不断搅拌,混合液与包埋固化液的比例按1:1-1:5,经2~8小时的包埋固化处理,过滤,并用无菌水洗涤1-2次,然后再用冷冻干燥技术进行冷冻干燥。
(6)合生素药物组合物的制备:将上述益生菌微胶囊与低聚果糖、低聚半乳糖进行混合配比,同时添加一定量的维生素制成该药物组合物。
9.根据权利要求8所述的合生素药物组合物的生产工艺,其特征在于:双歧杆菌活化培养基的配制方法如下:胰蛋白胨5.0g、酵母提取物10.0g、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、盐溶液40mL、加水定容至1000mL,调节pH6.8-7.0,121℃灭菌20min。其中盐溶液的成分为:氯化钙0.2g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠10.0g、磷酸氢二钾1.0g、氯化钠2.0g、加水定容至1000mL。嗜酸乳杆菌活化培养基的配制方法如下:酵母提取物5.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、醋酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、吐温801.0mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、磷酸氢二钾2.0g、加水定容至1000毫升,pH6.2-6.4,121℃灭菌20分钟。
10.根据权利要求8所述的合生素药物组合物的生产工艺,其特征在于:双歧杆菌种子培养基的配制方法如下:植物胨5.0g、酵母提取物2.0g、水解酪蛋白10.0g、葡萄糖5.0g、吐温801.0mL、5%半胱氨酸盐10.0mL、磷酸氢二钾2.0g、氯化镁0.5g、硫酸锌0.25g、氯化钙0.15g、氯化铁微量,加水定容至1000毫升,pH6.4-6.6,115℃灭菌20分钟。嗜酸乳杆菌种子培养基的配制方法如下:番茄汁50mL、酵母提取物5.0g、牛肉膏10.0g、乳糖20.0g、葡萄糖2.0g、醋酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、吐温801.0mL、加水定容至1000毫升,pH6.6-7.0,121℃灭菌20分钟。
11.根据权利要求8所述的合生素药物组合物的生产工艺,其特征在于:发酵培养基的配制方法如下:蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨5.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母提取物5.0g、牛肉膏10.0g、水解酪蛋白10.0g、葡萄糖20.0g、醋酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、可溶性淀粉0.5g、吐温801.0mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g,加水定容至1000毫升,pH6.0-7.0,115℃灭菌30分钟。
12.根据权利要求8所述的合生素药物组合物的生产工艺,其特征在于:所述冻干保护剂的制备如下(重量百分比):脱脂奶粉35%-50%、乳糖10%-30%、谷氨酸钠10%-20%、维生素C钠0.5%-3%、淀粉20%-45%、无机盐0.5%-5%,加水定容至100ml,加热搅拌使其溶化,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
13.根据权利要求8所述的合生素药物组合物的生产工艺,其特征在于:所述囊材的制备如下(重量百分比):海藻酸钠10%-30%、明胶10%-20%、丙烯酸树脂10%-25%、脂肪酸30%-50%、硬化油脂25%-40%,加水定容至100ml,搅拌10分钟,静置2~6小时,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
14.根据权利要求8所述的合生素药物组合物的生产工艺,其特征在于:所述的包埋固化液的制备如下:称取氯化钙0.1~15.0克、氯化钾0.1~10.0克、加水定容至100ml,彻底溶解,然后105℃灭菌15min,冷却至10~35℃。
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