CN103006713B - 降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于可以降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂的制备方法，该制剂可在常温条件下保存12个月。通过将长双歧杆菌NQ-1501菌株制成菌粉，并将菌粉与辅料混合制成制剂。该制剂可以达到单纯降低胆固醇而不影响其他营养物质吸收的效果，且克服了微生态制剂不能常温保存的缺点。

Description

降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种可以降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂，具有无毒、无副作用、无残留、易于肠道定植的特点，该制剂还可在常温条件下保存12个月。

背景技术

血清胆固醇水平偏高是世界上导致人类死亡率较高的心血管疾病的主要病因之一，通常传统药物治疗作用单一、副作用较多，而通过减少或降低外源性胆固醇的摄入量则是目前调节机体胆固醇水平偏高所普遍采用的措施；微生态制剂在发挥调节肠道等诸多功能的同时，可以达到单纯降低胆固醇而不影响其他营养物质吸收的效果，因此已引起世界相关领域的高度重视。

20世纪70年代，Mann和Spoerry先后通过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Masai人血清胆固醇的研究、对常饮酸乳的美国人的调查，以及直接对酸乳的研究均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。迄今，有大量实验证实不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇的效果。有关乳酸菌降胆固醇的研究主要集中于乳酸杆菌的不同种类，其中以双歧杆菌的材料最为丰富，所选用的菌株类型也最多。

国外对降胆固醇乳酸菌的研究较早。Gilliland(1977)对肠道乳杆菌的降胆固醇作用进行了研究，提出了乳酸菌在生长过程中通过降解胆盐促进胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点。Gilliland(1985)和其它研究人员进一步指出，在厌氧条件和含有适量胆盐的高胆固醇培养基中生长时，嗜酸乳杆菌菌体细胞可以吸收胆固醇而降低介质中胆固醇的含量。Rasic等证实了纯培养条件下部分乳酸菌和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)对胆固醇的吸收作用。Lin等人给血清总胆固醇水平偏高的患者服用嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌制剂，8个月后发现被测人群血清胆固醇含量均显著下降。

国际上对有微生态制剂的基本要求之一是耐久存。一般含未经基因工程改造活菌的微生态制剂放置于常温条件下，平均寿命大约30天左右，而通过基因改造的活菌菌虽然稳定性改善，但在应用安全方面存在很大争议。目前国内外微生态制剂保存条件多为低温保存，因此，微生态制剂的运输、保存及使用均很不方便。为了提高微生态制剂的利用率，方便其运输、保存及使用，人们正在积极探索提高微生态制剂耐常温保存能力的方法。

相关的现有技术包括：

CN1844352A

CN1219583A

CN101988039A

CN1566329A

这些现有技术均在保护剂上进行改进，保护剂组成复杂，其最终的效果不如人意，即使是在号称能保存12个月的现有技术中也是需要在低温下保存才能实现。

本发明利用长双歧杆菌NQ-1501菌株具有的降低人体血清胆固醇的能力，并通过特殊工艺将其制成微生态制剂，该制剂可在常温条件下保存12个月。

发明内容

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种可以降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂，具有无毒、无副作用、无残留、易于肠道定植的特点，该制剂还可在常温条件下保存12个月。

本发明使用的微生物学分析方法以证明长双歧杆菌NQ-1501菌株具有极强的降低胆固醇的能力，然后可以使用传统的菌粉生产工艺将长双歧杆菌NQ-1501菌株制成菌粉，而后摸索制剂的工艺过程及制剂剂型，最后用于人体，用以降低人体血清中胆固醇含量，并可达到常温保存12个月的效果。

为了方便公众获得，长双歧杆菌NQ-1501菌株可以通过国内商业渠道从双奇公司购买。

本发明的一个目的是提供一种用于可以降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂的制备方法，该制剂可在常温条件下保存12个月。具体步骤为：将长双歧杆菌NQ-1501菌株制成菌粉，并将菌粉与辅料淀粉按照1∶9的比例充分混合，制成片剂、胶囊及散剂。

特别地，本发明也对长双歧杆菌NQ-1501的菌粉的制备过程进行了优化，优选为：

长双歧杆菌NQ-1501的最佳发酵时间为8h，发酵温度为40℃，厌氧培养；将所得发酵液15000g离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌泥，加入保护剂，搅拌均匀，倾注进冻干机中冻干，得到白色粉末状菌粉；其中，长双歧杆菌NQ-1501的最佳发酵培养基：1.2％乳糖，0.8％牛肉膏，0.4％柠檬酸三胺，0.4％乙酸钾，0.04％硫酸镁，0.05％L-半胱氨酸盐酸盐，0.08％吐温-80。

特别地，所述保护剂成分及添加比例优选为：在300ml体系中加入20ml 60％脱脂奶粉，5ml 5％淀粉。

在本发明的一个具体技术方案中，将长双歧杆菌NQ-1501菌粉和辅料淀粉，按照1∶9的比例充分混合，用压片机压制成两面扁平的片剂，平均片重0.4g，片剂1g重，活菌数为200亿左右，成年人的用量为1日2片，30日为1疗程。

在本发明的一个具体技术方案中，将长双歧杆菌NQ-1501菌粉和辅料淀粉，按照1∶9的比例充分混合，装在以明胶为主要原料制成的圆筒状胶壳中的胶囊中，胶囊体积为0.48ml，1胶囊体积活菌数为200亿左右，成年人的用量为1日2粒，30日为1疗程。

在本发明的一个具体技术方案中，将长双歧杆菌NQ-1501菌粉和辅料淀粉，按照1∶9的比例充分混合，制成的粉末状散剂，装在铝塑袋中，每袋1g，活菌数为200亿左右，成年人的用量为1日2g，30日为1疗程。

本发明的另一个目的是提供一种前述方法制备出来的可以降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂，该制剂可在常温条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供了前述微生态制剂在制备降低人体血清胆固醇含量的药物中的用途。

本发明的另一个目的是提供了长双歧杆菌NQ-1501在制备降低人体血清胆固醇含量的药物中的用途。

本发明的优点在于：

1、长双歧杆菌NQ-1501菌株性能优良，发酵用时短，冻干稳定性较好，菌粉活菌数较多，且无毒、拮抗效果明显，降低胆固醇效果明显；

2、采用了简单的制剂工艺以及简单的制剂原料，能使制剂达到常温保存12个月的效果；

3、制备方法实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理，具有成本低、产率高、适宜规模化生产等优点。

附图说明

图1为本发明胆固醇标准曲线图。

具体实施方式

以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。

实施例1.长双歧杆菌NQ-1501菌株菌粉的生产工艺

选取双奇公司的长双歧杆菌NQ-1501菌株作为制剂的唯一菌株。长双歧杆菌NQ-1501菌株的最佳发酵时间为8h，发酵温度为40℃，厌氧培养；

长双歧杆菌NQ-1501菌株的最佳发酵培养基：1.2％乳糖，0.8％牛肉膏，0.4％柠檬酸三胺，0.4％乙酸钾，0.04％硫酸镁，0.05％L-半胱氨酸盐酸盐，0.08％吐温-80。

将所得发酵液15000g离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌泥，加入保护剂，搅拌均匀，倾注进冻干机中冻干，得到白色粉末状菌粉。

保护剂成分及添加比例为：

名称       浓度(％)       添加量(/300ml)

脱脂奶粉   50％           20ml

淀粉       5％            5

实施例2.可常温保存的降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂的制作

将长双歧杆菌NQ-1501菌粉和辅料淀粉，按照1∶9的比例充分混合，制成片剂、胶囊及散剂。

a、将长双歧杆菌NQ-1501菌粉和辅料淀粉，按照1∶9的比例充分混合，用压片机压制成两面扁平的片剂，平均片重0.4g，片剂1g重，活菌数为200亿左右，成年人的用量为1日2片，30日为1疗程。

b、将长双歧杆菌NQ-1501菌粉和辅料淀粉，按照1∶9的比例充分混合，装在以明胶为主要原料制成的圆筒状胶壳中的胶囊中，胶囊体积为0.48ml，1胶囊体积活菌数为200亿左右，成年人的用量为1日2粒，30日为1疗程。

c、将长双歧杆菌NQ-1501菌粉和辅料淀粉，按照1∶9的比例充分混合，制成的粉末状散剂，装在铝塑袋中，每袋1g，活菌数为200亿左右，成年人的用量为1日2g，30日为1疗程。

实施例2、长双歧杆菌NQ-1501菌株制剂常温条件下保存稳定性试验结果表

实施例3、长双歧杆菌NQ-1501菌株降胆固醇功能体外验证试验

一、实验材料

1、供试菌种：长双歧杆菌NQ-1501菌株双奇药业拥有。

2、主要试剂

包括牛胆盐、胆固醇、邻苯二甲醛、正己烷、冰醋酸、氢氧化钾

3、降胆固醇筛选培养基的配制

适宜菌株的胆固醇液体培养基：在TPY液体培养基中添加0.3％(W/V)牛胆盐，121℃灭菌20min后，添加2％的(1.0g/100ml)无菌胆固醇溶液。(胆固醇溶解液配制：精确称取1.0g胆固醇溶于无水乙醇中并用100ml容量瓶定容，滤菌器过滤即可获得1.0g/100ml的胆固醇溶液)

4、邻苯二甲醛溶液的制备

精确称取0.100g邻苯二甲醛，用冰醋酸定容于200ml的容量瓶中，现用现配，避光保存。

二、实验方法

1、邻苯二甲醛法测定胆固醇含量标准曲线的绘制

(1)胆固醇标准液的配制

精确称量胆固醇50.0mg，用无水乙醇定容于50ml的容量瓶中，配成1mg/ml的胆固醇标准液。精确吸取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml的标准液于50ml容量瓶中，用无水乙醇定容，进而得到10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL的梯度溶液。

(2)胆固醇标准曲线

精确吸取各梯度溶液1.0ml于试管中，在真空条件下抽干，然后准确加入2.0ml邻苯二甲醛溶液振荡使之充分溶解，放置10min后加入1.0ml的浓硫酸，混合均匀，室温放置10min使之显色，在550nm波长下测定吸光值(2.0ml邻苯二甲醛溶液加入1.0ml的浓硫酸，室温放置10min调零)。以OD550值为横坐标，胆固醇浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

2、供试菌株的液体发酵培养

(1)将长双歧杆菌NQ-1501菌株分别接入一级(80mL)培养基中，待培养至终点后，测其pH并镜检。

(2)以4％接入二级(80mL)培养基中，待培养至终点后，测其pH、镜检，检测发酵液活菌数。

(3)以4％接入添加0.3％胆盐的三级胆固醇(80mL)培养基中(注：培养基中含有2％的无菌胆固醇溶液)，待培养至终点检测胆固醇含量。

3、邻苯二甲醛法测定胆固醇含量步骤

移取0.5mL样品于一洁净试管中，加入3mL 95％的乙醇和2mL 50％的KOH。振荡混匀，60℃水浴中皂化10min。冷却至室温后，加入5mL正己烷，完全混匀，萃取1min。再加入3mL蒸馏水混匀，室温下静置15min。待各项分离后，从己烷层准确吸取2.0mL至另一干净试管中。45～50℃恒温箱挥干正己烷，加入2mL新配制的邻苯二甲醛工作液，室温下显色10min。再加入1mL浓硫酸，立即完全混匀，室温静置10min。在90min内测定550nm处的OD值，根据标准曲线计算出胆固醇浓度。

4、菌株降胆固醇作用机理分析

将长双歧杆菌NQ-1501菌株在添加0.3％胆盐的TPY胆固醇培养基发酵培养，对终点发酵液取样，测其胆固醇含量。取20mL发酵液在4℃、8000rpm下离心10分钟，取其上清测定胆固醇含量以计算胆固醇总去除率。倾出上清液，再加入20mL生理盐水，震荡5min后8000rpm下离心10分钟，离心洗涤3次，取上清液即为菌体洗涤液，测定胆固醇含量以计算共沉淀作用胆固醇的吸附率。倾出菌体洗涤液，再加入20mL生理盐水，震荡5min后置于冰浴中并在超声波破碎仪中破碎(功率400W、工作5s间隔5s、工作80次)，镜检直至菌体细胞壁破碎，以8000rpm离心10min，上清液即为菌体破碎液，测定胆固醇含量以计算胆固醇吸收率，通过以上数据最后得出胆固醇降解率。

胆固醇的总去除率＝(胆固醇总量一培养液上清中的胆固醇量)/胆固醇总量×100％

共沉淀作用胆固醇的吸附率＝沉淀洗涤液中的胆固醇量/胆固醇总量×100％

胆固醇吸收率＝超声破碎液中的胆固醇量/胆固醇总量×100％

胆固醇降解率＝[胆固醇总量-(上清液+沉淀洗涤液+超声破碎液)胆固醇含量]/胆固醇总量×100％。

三、实验结果

试验结果为：

四、分析及讨论

试验结果表明，长双歧杆菌NQ-1501菌株具有极强的降低胆固醇的能力。

Claims (5)

1.一种用于降低人体血清胆固醇含量的微生态制剂的制备方法，包括将长双歧杆菌NQ-1501菌株制成菌粉，并将菌粉与辅料淀粉按照1∶9的比例混合，制成制剂；其中长双歧杆菌NQ-1501的菌粉的制备过程为：长双歧杆菌NQ-1501的发酵时间为8h，发酵温度为40℃，厌氧培养；将所得发酵液15000g离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌泥，加入保护剂，搅拌均匀，倾注进冻干机中冻干，得到白色粉末状菌粉；其中所述长双歧杆菌NQ-1501的发酵的培养基为：1.2％乳糖，0.8％牛肉膏，0.4％柠檬酸三胺，0.4％乙酸钾，0.04％硫酸镁，0.05％L-半胱氨酸盐酸盐，0.08％吐温-80。

2.权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其中所述制剂形式为片剂、胶囊或散剂。

3.根据权利要求1或2所述的微生态制剂的制备方法，其中保护剂成分及添加比例为：在300ml体系中加入20ml50％脱脂奶粉，5ml5％淀粉。

4.权利要求1-3任一所述的微生态制剂的制备方法制备的微生态制剂。

5.权利要求4所述的微生态制剂在制备降低人体血清胆固醇含量的药物中的用途。