CN103382467B - 嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种原生质融合技术，具体为一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法。包括嗜酸乳杆菌原生质体制备，制备条件，菌龄为12-21h，溶菌酶浓度为5-10mg/mL，酶解温度为30-40℃，酶解时间为20-40min；地衣芽孢杆菌原生质体制备，条件，即菌龄为8-14h，溶菌酶浓度为0.5-2.5mg/mL，酶解温度为30-40℃，酶解时间为2-4h；最后使用融合剂，获得的原生质体融合子，所述的融合剂为PEG4000或PEG6000。而本发明技术方案是经嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌融合而成的融合子发酵而成的酸奶甜度较高，酸度较弱。所以，融合子发酵酸奶有很大的前景。如果能够将融合子广泛的运用到酸奶发酵生产中，将能对酸奶产业做出很大的贡献。
Description
技术领域
本发明涉及一种原生质融合技术，具体为一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法。
背景技术
原生质体技术包括原生质体诱变、融合、转化等多项内容。原生质体制备和再生是原生质体技术得以应用的基础和前提，即原生质体技术的关键是需要对细胞壁进行消化，形成大量的原生质体后，再对原生质体形成再生细胞壁，恢复到正常细胞状态。原生质体制备目前主要采用生物酶法制备原生质体，而原生质体再生，即重建细胞壁、恢复完整的形态，原生质体再生是原生质体遗传转化的必要条件。原生质体融合，就是将两亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理、化学或者生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，而后发生基因组间的交换重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从再生细胞中获得重组子的过程。原生质体融合开辟了育种工作的新途径。原生质体融合的关键步骤首先必须使亲株原生质体化，以便更好地制备原生质体，这是提高原生质体的再生率与融合率的基础。其次，融合后的原生质体必须顺利地再生出细胞壁，进而形成完整的营养体细胞，才可能顺利地筛选出稳定的高产重组子。融合条件也是不可忽视的，因为只有通过这一环节才能实现遗传物质的交换与重组，形成融合子与稳定重组子。
制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为溶菌酶或蜗牛酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有不同的适当的形成条件。培养及成分，培养方式，酶解时间，温度，pH等条件都会通过影响酶的活性而影响到制备原生质体的效果。
乳酸菌是一类对人类健康极其有益的益生菌。它的生理功能与机体的生命活动息息相关，肠道中如果没有乳酸菌，人和动物就难以健康生存。乳酸菌发酵制备而成的酸乳，由于具有改善胃肠道功能、提高免疫能力、改善机体营养状况等特殊的生理功能而越来越受到消费者的欢迎。但由于乳酸菌在正常发酵结束后。贮存、运输、销售直至食用前这一过程菌体仍会生长繁殖。使pH值持续下降。出现消费者不可接受的过酸味及感官质量下降等后酸化现象。因此，控制酸乳的后酸化，提高酸乳质量、延长保质期是目前急需解决的问题。发酵工业中的各种优良高产菌株绝大部分都是以生物育种和诱变选育方法获得的。诱变育种和细胞融合生物选育除了能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。
目前，国内外对乳酸菌的益生功能主要集中在对乳酸乳杆菌、双歧杆菌和干酪乳杆菌等菌属的研究。而嗜酸乳杆菌具有令人满意的特性并且在临床拥有良好记录。目前，嗜酸乳杆菌是乳酸菌中极为重视研究与开发的益生菌之一，被视为第三代酸乳发酵剂菌种。
地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 属于厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌属(Bacillus)，是一种常见的G+细菌，广泛分布在空气、土壤和腐败有机物上。工业上主要用来生产蛋白酶及淀粉酶。
地衣芽孢杆菌用于饲料，适用于细菌原因引起的肠道菌群失调症以及肠道需要保健的养殖动物。可以促进肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，对肠道细菌感染具有特效，对轻型或重型急性肠炎，轻型及普通型的急性菌痢等，均有明显疗效。目前，还没有发现地衣芽孢杆菌对动物方面有不良影响。
此外，地衣芽孢杆菌也可用于人的疾病防治，目前地衣芽孢杆菌已有医药制品，如整肠生（地衣芽孢杆菌胶囊），主要用于细菌或真菌引起的急、慢性肠炎、腹泻。也可用于其他原因(如长期服用广谱抗生素)引起的肠道菌群失调的防治，在剂量范围内，未见不良反应。
地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中具有应用潜力的菌种之一。在自然界中分布非常广泛，是植物和土壤微生态中的优势种群之一。它能够产生多种抗生素，包括肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、核酸类、氨基酸类物质，对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用，而且地衣芽孢杆菌蛋白酶、淀粉酶活性都很高。因此，地衣芽孢杆菌广泛应用于医药、农药、饲料加工、纳米技术等方面。最后，目前地衣芽孢杆菌在食品领域的研究报道还很少。
发明内容
本发明提供了一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法。
本发明的技术方案是，一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法，
包括嗜酸乳杆菌原生质体制备，制备条件，菌龄为12-21h，溶菌酶浓度为5-10 mg/mL，酶解温度为30-40 ℃，酶解时间为20-40 min；
地衣芽孢杆菌原生质体制备，条件，即菌龄为8-14h，溶菌酶浓度为0.5-2.5 mg/mL，酶解温度为30-40 ℃，酶解时间为2-4h；
最后使用融合剂，获得的原生质体融合子，所述的融合剂为PEG4000或PEG6000。
一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法，其最佳制备条件为： 嗜酸乳杆菌原生质体制备，制备条件，菌龄为16h，溶菌酶浓度为10 mg/mL，酶解温度为36 ℃，酶解时间为30 min；
地衣芽孢杆菌原生质体制备，条件，即菌龄为10h，溶菌酶浓度为2 mg/mL，酶解温度为37 ℃，酶解时间为3h；
最后使用融合剂，获得的原生质体融合子。所述的融合剂为PEG6000。
本发明技术方案制备得到的融合子可以应用于食品加工行业，尤其是酸奶制备中，众所周知，酸奶的酸度直接影响成品的质量、风味和口感；酸度主要取决于乳酸菌产酸的能力。酸度过高的产品，其风味和口感往往不佳，很难被消费者接受和喜爱。在生产和贮藏过程中产生过多的酸而导致强烈的酸味是酸奶常见的问题。冷藏贮藏条件下，酸奶在贮藏期的酸度越来越高，是酸奶后酸化现象导致的。在贮藏过程中，乳酸菌继续生长繁殖，菌体的生长消耗掉残存的乳糖产生乳酸，产酸也逐渐增多，导致贮藏前期乳酸菌含量和酸度进一步升高。而本发明技术方案是经嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌融合而成的融合子发酵而成的酸奶甜度较高，酸度较弱。所以，融合子发酵酸奶有很大的前景。如果能够将融合子广泛的运用到酸奶发酵生产中，将能对酸奶产业做出很大的贡献。
而且根据实验，单一菌株发酵时，融合子发酵酸奶的风味仅次于实验室使用菌种。经过融合子与实验室菌种进行配比之后风味很理想，酸甜度正好，奶香味浓郁。
附图说明
图1 嗜酸乳杆菌的生长曲线
图2地衣芽孢杆菌的生长曲线
图3 菌体培养时间对嗜酸乳杆菌原生质体形成率与再生率的影响
图4 溶菌酶浓度对嗜酸乳杆菌原生质体制备率和再生率的影响
图5 酶解时间对嗜酸乳杆菌原生质体制备率和再生率的影响
图6 酶解温度对嗜酸乳杆菌原生质体制备率和再生率的影响
图7菌体培养时间对地衣芽孢杆菌形成率与再生率的影响
图8酶浓度对地衣芽孢杆菌原生质体形成率和再生率的影响
图9 酶解时间对地衣芽孢杆菌原生质体形成率和再生率的影响
图10酶解温度对原生质体形成率和再生率的影响
图11 嗜酸乳杆菌（L:10×100）（MRS液体培养基中）
图12地衣芽孢杆菌（L:10×100）（液体培养基中）
图13融合子（L:10×100）（液体培养基中）
图14地衣芽孢杆菌（L:10×100）（固体培养基中）
图15融合子（L:10×100）（固体培养基中）
图16地衣芽孢杆菌（L:10×100）（孔雀绿染色）
图17融合子（L:10×100）（孔雀绿染色）
图18 嗜酸乳杆菌、融合子及地衣芽孢杆菌的产酸量情况
图19各菌株的胆固醇清除性能
图20各菌株在pH=2的选择培养基中不同处理时间后的存活率
图21各菌株在胆盐浓度0.3 %的选择培养基中不同处理时间后的存活率
图22各菌株蛋白酶活力
图23为产淀粉酶性能试验图片
图24 各菌株的产丁二酮量
图25 融合子产乳酸能力的遗传稳定性
图26胆固醇清除能力遗传稳定性检验
图27融合子耐酸耐碱盐遗传稳定性检验
图28产蛋白酶能力遗传稳定性检验
图29融合子产淀粉酶能力的遗传稳定性
图30融合子的产丁二酮能力遗传稳定性。
具体实施方式
实施例1、一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法，具体步骤为，嗜酸乳杆菌原生质体制备，制备条件，菌龄为16h，溶菌酶浓度为10 mg/mL，酶解温度为36 ℃，酶解时间为30 min；地衣芽孢杆菌原生质体制备，条件，即菌龄为10h，溶菌酶浓度为2 mg/mL，酶解温度为37 ℃，酶解时间为3h；最后使用PEG6000作为融合剂，获得的原生质体融合子。
以下为嗜酸乳杆菌及地衣芽孢杆菌的原生质体制备及融合的具体实验操作方法。
本实施例对嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的原生质体制备、再生以及融合进行了初步的探讨，通过考察菌体培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度等因素对原生质体形成率和再生率的影响，从而获得原生质体制备、再生及融合的最优条件。
1材料与方法
1.1 菌株、仪器及培养基
1.1.1 试验菌株
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）从整肠生胶囊中分离纯化。整肠生的主要成分地衣芽孢杆菌简称BL20386无毒菌株，经先进的生物工程精制而成。
1.1.2 主要试剂
蛋白胨；牛肉膏；葡萄糖；酵母浸膏以上均为生化试剂。
硫酸镁（MgSO4）；磷酸氢二钾 (K2HPO4)；吐温80；琼脂粉；氯化钠(NaCl)；柠檬酸三铵；硫酸锰(MnSO4)；醋酸钠(CH3COONa)； 顺丁烯二酸；溴甲酚紫以上均为分析纯
1.1.3 主要仪器设备
LRHS-150恒温恒湿培养箱；HH-4数显恒温水浴锅；SW-CJ-2F洁净工作台；万用电炉（220V-AC）；WFJ 2100 型可见分光光度计；HZQ-F160 全温振荡培养箱；DF205电热鼓风干燥箱； YXQ-LS-18SI不锈钢手握式蒸汽灭菌器；电子天平（BS2202S）；移液枪（eppendorf research 1000）；usb数码成像显微镜。YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器；数字酸度计PHS-25C型；WFJ 2100型可见分光光度计；LRHS-150 恒温恒湿、培养箱；万用电炉（220V-AC）；漩涡混合器（XW-80A）；WFJ 2100 型可见分光光度计；HZQ-F16全温振荡培养箱；DF205电热鼓风干燥箱；电子天平。
1.1.4 培养基及其制备
MRS培养基
参照GB 4789.35-2010《食品微生物学检验乳酸菌检验》
蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，Tween-80 1mL，醋酸钠5 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，蒸馏水 1000mL，MnSO4·4H2O 0.2 g （固体培养基加入15-20g琼脂） pH 6.2~6.6，将MgSO4·7H2O 、MnSO4·4H2O，葡萄糖，Tween-80以外的成分溶解，冷至50℃。
然后加入MgSO4·7H2O 、MnSO4·4H2O，最后加入葡萄糖和Tween-80。过滤分装，121℃高压灭菌 15 min。 在MRS 液体培养基中添加 1.5 %琼脂制备固体培养基。
CM培养基（地衣芽孢杆菌培养基）
蛋白胨10g，葡萄糖5g，酵母膏3g，牛肉膏3g， MgSO4.7H2O 2g， 蒸馏水1000mL，pH7.2。固体培养基琼脂粉用量为2%（15-20g）。
按照所需剂量，将配制好的培养基分装在三角瓶中，在0.1MPa下灭菌30 min，备用。
培养基（地衣芽孢杆菌高渗再生培养基）
蛋白胨10g，葡萄糖5g，酵母粉5g，牛肉膏5g，NaCl 5g, 蔗糖0.5 mol/L, MgCl2 20 mmol/L，顺丁烯二酸0.02mol/L（有或无），琼脂粉2%；蒸馏水1000mL，pH7.0，0.1MPa灭菌30min。
乳酸菌原生质体再生培养基
在不含Tween-80的MRS培养基，补充淀粉0.5%，脱脂乳2.5%，葡萄糖1%，氯化镁25 mmol/L，氯化钙25mmol/L。先配制不含Tween-80的MRS培养基，然后依次加入淀粉、脱脂乳、琼脂，边加热边搅拌直至完全溶化，调pH 6.2~6.6，0.06MPa灭菌30 min，备用。
（高渗MM）培养基
KNO3 3g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，微量元素液2mL，葡萄糖20g，蔗糖0.6M，1.6％~1.8％琼脂粉，蒸馏水1000mL，pH6.5~6.8，121℃灭菌20min。
1.1.5 溶液
0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.0）
123mL 0.2mol/L K2HPO4，877mL 0.2mol/L KH2PO4 高渗缓冲液于上述PBS缓冲液中加入0.8 mol/L甘露醇。
原生质体稳定液（SMM）：
0.5mol/L 蔗糖，20 mmol/L MgCl2，0.02mol/L顺丁烯二酸，调pH至6.5。
溶菌酶溶液
酶粉活力为4000U/g，用SMM液配制，浓度为200 U/mL，过滤除菌-20℃储存备用。
的孔雀绿染液
1.2 实验方法
1.2.1菌体活化及菌种保藏
将嗜酸乳杆菌冻干菌种在无菌条件下接入 MRS 液体培养基，37 ℃培养 2～3d 后，按 5 %（V:V）接种量接种于 MRS 液体培养基中传代活化 3 次即为活化的菌种。将少量整肠生胶囊中的粉末在无菌条件下接入CM液体培养基中，37 ℃培养 2～3d 后，按 5 %（V:V）接种量接种于CM 液体培养基中传代活化 3 次即为活化的菌种。在将地衣芽孢杆菌的斜面菌种和乳酸菌分别至于-80℃冰箱中保存菌种。
1.2.2制作生长曲线
将活化好的菌液以0.5% (V:V)接种量接入新鲜的培养基中，混匀后分别装于33只试管，37℃2h 后定时取样测定OD570值和OD600，绘制生长曲线，确定对数生长中、后期的OD值范围。
1.2.3制备菌悬液
以0.5% 接种量接种新鲜的培养基，培养至对数生长期中期时，停止培养，取1.5mL 3500 r/min 离心10min, 收集菌体，生理盐水洗涤2次，最后用1.5mL SMM制成菌悬液。
1.2.4酶解前活菌计数
取0.1mL菌悬液，用生理盐水10倍递减稀释，用平板法计数。地衣芽孢杆菌用涂布法，乳酸菌用浇注法或双层琼脂法，将稀释至10－5时的菌数计为A。
1.2.5原生质体制备（酶解）
菌悬液中加入适量溶菌酶，温和振荡后，于42℃水浴恒温酶解。期间每20min取样一次，用0.5 mol/L蔗糖液制片，美兰或结晶紫染色，镜检观察，当大部分菌体形成球形原生质体后，停止酶解，进行原生质体计数。于3500 r/min 离心15 min 收集原生质体，并用高渗液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮在高渗缓冲液中。
1.2.6裂解计数
取0.1mL酶解后的菌液，用无菌蒸馏水稀释至10－5，地衣芽孢杆菌和乳酸菌分别在CM或MRS培养基平板上计数，菌落数记为B，代表未脱壁菌数。等量吸取酶解后的菌液，用高渗缓冲液稀释至10－5，在再生培养基平板上计数，菌落数计为C，代表再生平板上的总菌数。
1.2.7原生质体制备率和再生率的计算
原生质体制备率=
原生质体再生率=
1.2.8原生质体融合
在无菌条件下，分别取0.1ml悬浮在高渗缓冲液的原生质体融合，3500 r/min 离心5min，重悬于0.1ml高渗缓冲液中，加0.9ml40% PEG6000，混匀，室温下放置2min，加1.5ml高渗缓冲液混匀后，离心，洗涤2次，适当稀释后涂布HMM培养基中，37℃培养，7天后观察结果，计数D。
原生质体融合率=
1.2.9融合子的形态特征观察
将两亲本菌株及融合子进行革兰氏染色、芽孢孔雀绿染色观察。
1.2.10 融合子产酸能力的初步判定
取10 mL液体培养基于小试管中并灭菌，之后将两种亲本菌株及融合子按5 %（V:V）的接种量接种于培养基中，之后再在试管中滴入少量的溴甲酚紫溶液，然后静置试管，37 ℃培养观察产酸情况，培养一段时间后，若试管中的培养液的颜色由紫色变为黄色则表明菌种产酸，否则不产酸。 能形成芽孢且产乳酸的细胞初步鉴定为融合子。
2结果与分析
2.1亲本菌株的生长曲线
微生物的生理状态对其原生质体的形成及再生均有较大影响。因此需要对菌株的生长规律进行测定和观察，绘制生长曲线。将传代活化的菌液进行培养，每隔2h取样，在600nm下测定嗜酸乳杆菌菌液OD值，在560nm无菌生长培养基为对照。以OD值为纵坐标，时间为横坐标，绘制出发菌株的生长曲线。嗜酸乳杆菌的生长曲线如图1所示。 地衣芽孢杆菌的生长曲线如图2所示：
由图1，2可以看出，嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌在液体培养基中经过一个较短的延迟期后进入对数期生长期。由于培养基中营养物质减少，嗜酸乳杆菌在培养18 h以后进入平衡期，菌体浓度基本保持不变。而地衣芽孢杆菌则在培养10 h以后进入平衡期，菌体浓度基本保持不变。
2.2嗜酸乳杆菌原生质体制备及再生条件优化
2.2.1菌龄对原生质体形成率与再生率的影响
分别收集为8h、12h、16h和18h的细胞培养液，用5 mg/ml溶菌酶液进行酶解，采用PBS溶液洗涤菌体。将原生质体稀释10-5后涂布于MRS培养基以及再生培养基上，计算原生质体的形成率和再生率。
从图3可以看出，随着菌体培养时间的延长，原生质体形成率呈下降趋势。菌体培养8-12 h(对数中期)，原生质体形成率较高，随后形成率呈缓慢下降趋势；再生率起初随着培养时间的延长而升高，在对数生长末期16 h时最高（16.26%），稳定期后，再生率快速下降，故对嗜酸乳杆菌来说，选择对数生长中期的菌体可兼顾较高的原生质体形成率和再生率。
2.2.2酶浓度对原生质体形成率与再生率的影响
收集对数生长期的细胞培养液，分别用1mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml的溶菌酶液进行酶解，采用PBS溶液洗涤菌体。将原生质体稀释适当的倍数后涂于MRS培养基以及再生培养基上，计算原生质体的形成率和再生率
图4显示，随着酶浓度的增加，原生质体的形成率提高，而再生率逐渐下降，由于融合是在再生的基础上进行的，所以在保证一定形成率的前提下，更多的应该考虑再生率。
2.2.3酶解时间对原生质体形成率与再生率的影响
收集对数生长期的细胞培养液，用5 mg/ml溶菌酶液分别酶解30 mim、40 mim、50 mim，采用PBS溶液洗涤菌体。将原生质体稀释适当的倍数后涂于MRS培养基以及再生培养基上，计算原生质体的形成率和再生率。
由图5可见，随着酶解时间的延长，菌体去壁程度越发完全，当酶解时间为40 min时，大多数的菌体细胞已形成原生质体，此时形成率达到91.76 %，随后随着时间的延长，形成率开始下降，说明原生质体形成后，溶菌酶进一步作用，会引起原生质体的死亡，故在原生质体制备时，酶解时间是一个很重要的因素。
2.2.4酶解温度对原生质体形成率与再生率的影响
收集对数生长期的细胞菌液，分别在30℃、36℃、42℃下用5 mg/ml溶菌酶液进行酶解，采用PBS溶液洗涤菌体。将原生质体稀释10-5后涂于MRS培养基以及再生培养基上，计算原生质体的形成率和再生率。
由图6可以看出，随着温度的升高，再生率持续下降。30-42℃，虽然形成率变化缓慢，但对再生率的影响却较明显。再生率由30℃时的5.35% 降至了0.32%以下。因此，考虑到脱壁与再生的共同效应，确定酶解温度为36℃，既获得了较高的形成率，又保证了一定的再生率。
2.2.5 正交试验选择影响原生质体制备因素的最佳组合
根据单因素试验结果，进行正交试验，确定嗜酸乳杆菌原生质体制备时各因素的最佳组合。
表1因素水平表
表2嗜酸乳杆菌原生质体制备影响因素最佳组合正交表L9(34)
| A | B | C | D | 原生质体 | |
| 试验号 | 菌 龄 | 酶浓度 | 酶解温度 | 酶解时间 | 制备率 |
| （h） | （mg/mL） | （℃） | （min） | （%） | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 28.45 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 47.67 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 20.24 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 45.87 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 43.97 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 61.42 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 73.73 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 71.98 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 81.35 |
| K1j | 96.36 | 148.05 | 161.85 | 153.77 | |
| K 2j | 151.26 | 163.62 | 174.89 | 182.82 | |
| K 3j | 227.06 | 163.01 | 137.94 | 138.09 | |
| 1 | 32.12 | 49.35 | 53.95 | 51.26 | |
| 2 | 50.42 | 54.54 | 58.3 | 60.94 | |
| 3 | 75.69 | 54.33 | 45.98 | 46.03 | |
| R j | 43.57 | 5.19 | 12.32 | 14.91 |
由表2可见，9号样在实验过程嗜酸乳杆菌原生质体形成率最高，组合为A3B3C2D1。即菌龄为16h，溶菌酶浓度为10 mg/mL，酶解温度为36 ℃，酶解时间为30 min。比较各因素极差发现，影响其原生质体制备的四因素主次顺序为：A＞D＞C＞B。但在之前的实验中预测影响原生质体制备最重要的因素应该是酶浓度和酶解时间。究其原因，可能是由于正交试验设计不合理。而在组合为A3B3C2D1的条件下，原生质体的形成率与再生率已经足够使用，所以依然选择在菌龄为16h，溶菌酶浓度为10 mg/mL，酶解温度为36 ℃，酶解时间为30 min下进行以下试验。
2.3地衣芽孢杆菌制备及再生条件优化
2.3.1菌龄对原生质体形成率与再生率的影响
分别收集为4h、6h、8h和10h的细胞培养液，用溶菌酶液进行酶解。将原生质体稀释适当的倍数后涂于CM培养基以及再生培养基上，计算原生质体的形成率和再生率。
从图7可以看出，随着菌体培养时间的延长，原生质体形成率呈下降趋势。菌体培养4-8h(对数中期)，原生质体形成率较高，形成率呈缓慢下降趋势；当培养时间在6 -8 h，再生率较高；超过8h， 随着时间的延长，即菌体进入对数生长末期和稳定期后，再生率快速下降，说明对于地衣芽孢杆菌来说，选择对数生长中期的菌体也较有利于再生。
2.3.2酶浓度对原生质体形成及再生的影响
将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期，制成菌悬液，然后用不同浓度的溶菌酶：0.25mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL酶解，温和振荡后于37℃水浴恒温酶解4h，计算其原生质体的形成率和再生率。
试验结果表明，酶浓度对原生质体化有极大的影响。由图8可以看出原生质体的形成率随酶浓度的增加而提高，但再生率则呈下降趋势。当溶菌酶浓度为2.0 mg/mL时，原生质体形成率为86.5%，再生率22.9%。说明在此浓度时，地衣芽孢杆菌对溶菌酶较敏感，不但其形成率很高，而且再生率也较高。因此确定溶菌酶的最佳作用浓度为2. 0 mg/mL。
2.3.3溶菌酶作用时间对原生质体形成及再生的影响
将地衣芽孢杆菌培养至对数生长末期，离心洗涤后制成菌悬液，在2.0 mg/mL溶菌酶分别作用不同时间:1h、2h、3h、4h、5h、6h后计算原生质体的形成率和再生率。
试验结果表明，地衣芽孢杆菌原生质体的形成率随酶解时间的延长而增加，而且这种趋势随着时间的延长，增长速度逐渐降低；而再生率呈现下降趋势，这是因为酶作用时间的延长对原生质体膜的破坏作用增强，使细胞不能保持完整性，从而不能再生细胞壁甚至脱落，另一方面，酶解时间的延长使其所制备的原生质体生理状态差，无核原生质体数量增加，再生能力弱。由图9可知，在酶解作用4h时，原生质体形成率很高，为85.8%，再生率也较高，为21.8%。因此可确定溶菌酶的最佳作用时间是4h。
2.3.4溶菌酶作用温度对原生质体形成及再生的影响
温度对酶解作用有双重影响，一方面随温度升高，酶解反应速度加快，但温度过高酶易钝化；另外一方面，随温度的增加，加大了酶对原生质体的毒害作用，影响原生质体的再生率，分别以25℃、30℃、37℃、42℃四个温度梯度酶解4h进行实验。
由图10可知，随温度的升高原生质体形成率逐渐升高，30℃之前由于酶反应速度的加快，表现为形成率快速增长，随着温度继续升高可能接近或达到了最适温度，表现为形成率增长缓慢。而随着温度的升高再生率持续下降，表明温度对再生率的影响较明显。因此，考虑到酶解时间过长，温度过高对原生质体的再生不利，确定地衣菌的最佳酶解温度为37℃，即可获得较高的形成率，又保证了一定的再生率。
2.3.5地衣芽孢杆菌原生质体形成和再生最佳条件的确定
表3 因素水平表
| A | B | C | D | |
| 水 平 | 菌 龄（h） | 酶浓度 （mg/mL） | 酶解温度 （℃） | 酶解时间 （h） |
| 1 | 6 | 1 | 35 | 3 |
| 2 | 8 | 1.5 | 37 | 4 |
| 3 | 10 | 2 | 40 | 5 |
表4地衣芽孢杆菌原生质体制备影响因素最佳组合正交表L9(34)
| A | B | C | D | 原生质体 | |
| 试验号 | 菌 龄 | 酶浓度 | 酶解温度 | 酶解时间 | 制备率 |
| （h） | （mg/mL） | （℃） | （h） | （%） | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 29.45 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 48.67 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 21.24 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 46.87 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 44.97 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 62.42 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 74.73 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 72.98 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 82.35 |
| K1j | 99.36 | 151.05 | 164.85 | 156.77 | |
| K 2j | 154.26 | 166.62 | 177.89 | 185.82 | |
| K 3j | 230.06 | 166.01 | 140.94 | 141.09 | |
| 1 | 31.12 | 50.35 | 54.95 | 52.26 | |
| 2 | 51.42 | 55.54 | 59.3 | 61.94 | |
| 3 | 76.69 | 55.33 | 46.98 | 47.03 | |
| R j | 45.57 | 5.19 | 12.32 | 14.91 |
由表3、4可知，地衣芽孢杆菌原生质体制备的最佳条件，即菌龄为10h，溶菌酶浓度为2 mg/mL，酶解温度为37 ℃，酶解时间为3h。比较各因素极差发现，影响其原生质体制备的四因素主次顺序为：A＞D＞C＞B。其中，菌龄对地衣芽孢杆菌原生质体再生影响最大，其次为酶解时间。但在之前的实验中预测影响原生质体制备最重要的因素应该是酶浓度和酶解时间。究其原因，可能是由于正交试验设计不合理。而在组合为A3B3C2D1的条件下，原生质体的形成率与再生率已经足够使用，所以依然选择在菌龄为10h，溶菌酶浓度为2 mg/mL，酶解温度为37 ℃，酶解时间为3h下进行以下试验。
2.4不同融合剂对融合率的影响
有多种化合物对原生质体的融合有促进作用，本实验选用（聚乙二醇）PEG4000和PEG6000作为嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌原生质体融合的融合剂做比较。两亲本菌株选用各自原生质体制备的最佳条件进行融合结果如下：
表5 不同融合剂对融合率的影响
| 融合剂 | 融合率 |
| PEG6000 | 4.8×10-6 |
| PEG4000 | 3.6×10-6 |
由图可知，PEG6000的促融效果明显高于PEG4000。因此，选用PEG6000作为本实验的融合剂。
2.5原生质体制备、再生与融合结果
在最佳条件下，使用PEG6000作为融合剂，嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的制备率、再生率和融合率如下表：
表6原生质体制备、再生与融合结果
| 菌株 | A（×10-8） | C（×10-7） | B（×10-5） | 制备率（%） | 再生率（%） | D（个） | 融合率（×10-6） |
| L.a | 2.0±0.9 | 2.3±2.0 | 2.2±1.4 | 80.35 | 19.5 | 90±5 | 4.6±0.4 |
| B.l | 2.1±1.1 | 2.5±1.3 | 1.8±0.5 | 86.5 | 21.6 | 83±3 | 3.8±0.2 |
注： A代表酶解前菌落数B代表未脱壁菌数C代表再生平板上的总菌数D代表融合子数
2.6融合子初步鉴定
嗜酸乳杆菌在MRS液体培养基中的形态如图11所示，地衣芽孢杆菌在液体培养基中的形态如图12所示，融合子在液体培养基中的形态如图13所示，地衣芽孢杆菌在固体培养基上的形态如图14所示，融合子在固体培养基中的形态如图15所示，地衣芽孢杆菌革兰氏染色结果如图16所示，融合子革兰氏染色结果如图17所示。 嗜酸乳杆菌，细胞成短杆状和球杆状，单个或成双排列，无荚膜，无分支，不运动。地衣芽孢菌的革兰氏染色呈阳性，有芽孢，且芽孢近中生，呈椭圆状。此外，视野中还可以看到营养体细胞、成熟菌释放出的游离芽孢以及芽孢囊。融合子的鉴定根据伯杰细菌鉴定手册，在显微镜下进行细胞形态鉴定可以看出，亲本整肠生菌在固体培养基中有明显的芽孢而且不成链状；但是在液体培养基中会成短链状。融合子在固体培养基中呈明显链状，而且芽孢生成率很高。与两亲本形态上都有明显的不同。
2.6.3产酸鉴定
分别将嗜酸乳杆菌、融合子和地衣芽孢杆菌菌悬液试管中滴入少量的溴甲酚紫溶液，然后静置试管，37 ℃培养观察产酸情况，培养一段时间后发现，嗜酸乳杆菌与融合子的菌悬液明显变黄，而地衣芽孢杆菌的菌悬液紫色明显变浅。则证明三株菌都能够产生酸，但地衣芽孢杆菌产酸量很少。
融合子性能分析
本实施例以产乳酸的嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌为亲本菌株，通过原生质体融合技术培养出融合子。分别对亲本菌株与融合子的以下性能进行分析：产乳酸能力、胆固醇清除能力、耐酸耐胆盐能力、产蛋白酶能力、产淀粉酶能力和产丁二醇能力。
1. 产乳酸能力分析
各菌株的产乳酸情况
从图18中可以看出，培养前期，融合子的产酸量稍低于嗜酸乳杆菌，随着培养时间的延长，融合子与嗜酸乳杆菌在48h以后，产酸量基本相同，培养液的pH值也基本相同。在68h时，酸生成量达到最大值，为10.52g/L，此后，两菌株酸生产量趋于稳定。产酸量的变化趋势与 pH 值的变化趋势基本相同，说明乳酸是引起 pH下降的主要原因。由图我们可以明显的看出，地衣芽孢杆菌也可以产生少量的乳酸，这与之前查过的资料是一致的。
2胆固醇清除能力分析
把融合子和亲本菌株以5 %的接种量分别接种到高胆固醇液体培养基中培养60 h
后测得各菌株的胆固醇最终清除率，以比较融合子和亲本菌株的胆固醇清除能力。结果如图19所示。从图19可以看出，嗜酸乳杆菌，地衣芽孢杆菌与融合子培养60 h后，各菌株的胆固醇平均清除率，嗜酸乳杆菌为15.2%，地衣芽孢杆菌的平均清除率为8.9%，融合子的平均清除率为19.7%。融合子的胆固醇清除率明显高于两亲本菌株。而嗜酸乳杆菌又高于地衣芽孢杆菌的清除率，由此可以看出，融合子具有较强的胆固醇清除能力。
3耐酸耐胆盐能力分析
嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子在pH=2的选择性培养基中培养不同时间后存活菌数结果如下表7所示。
表7各菌株在pH=2的选择培养基不同处理时间后的活菌数
由表7可知，各菌株的存活率随着处理时间的延长而降低，在处理1.5 h时，融合子较两亲本菌株存活率降低比较缓慢。而在处理时间为1.5 h-2.0 h时，嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌分别降低了四个数量级，而融合子仅下降了三个数量级。处理2.5 h 后 而地衣芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌保持在同一数量级102，而融合子是103.由此可以初步判断，融合子比嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的耐酸能力强。
如图20所示意， 处理1.5h时，嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子的存活率分别为5.3%、4.9%、4.7%；处理2h时，嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子的存活率分别为3.8%、3.6%、4%；处理2.5h时，三种菌株的存活率分别为3%、3.4%、3.8%；由图4-1可以看出，处理1.5h时，融合子的存活率低于两亲本菌株，随着时间的延长，融合子存活率降低的速率显然比两亲本菌株慢。实验表明，融合子的耐酸能力强于两亲本菌株。
3.2.2 各菌株的耐胆盐能力
嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子在胆盐浓度0.3 %的选择性培养基中培养不同时间后存活菌数结果如表8所示。
表8各菌株在胆盐浓度0.3 %的选择培养基不同处理时间后的活菌数
由表8可知，在胆盐浓度0.3 %的选择培养基中处理1.5 h后，嗜酸乳杆菌的活菌数降低的最快，数量级有108降低到106。处理2 h后，融合子的存活率依然保持在 7个数量级上，而嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌的存活率都降低了一个数量级，处理2.5 h以后，融合子的存活率分别多出两亲本菌株一到两个数量级。这也可以判断，融合子的耐胆盐能力相对两亲本菌株较高。
如图21，处理1.5h时，嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子的存活率分别为4.6%、5.2%、5.3%；处理2h时，嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子的存活率分别为2.3%、4.3%、4.8%；处理2.5h时，三种菌株的存活率分别为0.8%、3.6%、3.9%；由图4-2可以看出，融合子的存活率一直高于嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌。其降低的速率也明显低于两亲本。通过这组实验数据表明，融合子得耐胆盐的能力也高于两亲本菌株。
4产蛋白酶能力分析
亲本菌株与融合子产蛋白酶能力的比较
表9为嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子所测蛋白酶活的OD值及最终酶含量数据，嗜酸乳杆菌总蛋白酶含量为15.47U/mL，地衣芽孢杆菌总蛋白酶含量为27.23 U/mL，融合子总蛋白酶含量为18.67 U/mL。
表9 福林试剂保温发色后的OD560值及酶含量
由表9可知，无论是嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌还是融合子，其胞外蛋白酶中酸性蛋白酶活力均低于中性蛋白酶活力，而胞内蛋白酶中酸性蛋白酶活力较中性蛋白酶活力稍高一些。地衣芽孢杆菌的胞内蛋白酶与胞外蛋白酶明显高于嗜酸乳杆菌和融合子。而融合子遗传了地衣芽孢杆菌高产蛋白酶的特性，也具有较高的产蛋白酶活性。
图22为地衣芽孢杆菌，嗜酸乳杆菌和融合子产蛋白酶活力比较图，由图可直观看出地衣芽孢杆菌蛋白酶活力高于融合子和嗜酸乳杆菌。
5产淀粉酶性能分析
使用固体碘熏蒸着色后，观察菌苔周围透明圈情况和大小。结果见图23 。图上A为嗜酸乳杆菌，B为融合子。C为地衣芽孢杆菌。显色后测定水解透明圈直径（H）与菌落直径（C），计算H/C值。
表10亲本菌株与融合子的产淀粉酶能力
| 菌株 | 透明圈直径I（mm） | 菌落直径II（mm） | 有效值I/II |
| L. a | 2.5 | 1.12 | 1.38 |
| B.lich | 15.86 | 5.14 | 3.09 |
| Fusant | 14.52 | 5.37 | 2.7 |
由表10可见，地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和融合子周围均产生透明圈，则说明三种菌株都产淀粉酶，将淀粉水解而产生透明圈。其中地衣芽孢杆菌菌落直径与出现的透明圈直径之比嗜酸乳杆菌和融合子的大，说明地衣芽孢杆菌产生淀粉酶的能力比融合子的强，其产淀粉酶能力远大于嗜酸乳杆菌。
6产丁二酮性能分析
把融合子和嗜酸乳杆菌以5 %的接种量分别接种牛肉膏蛋白胨培养基和MRS培养基中培养12 h后测得两菌株的产丁二酮量，以比较融合子和嗜酸乳杆菌。结果如图24所示。从图24可以看出，接种量为5 %时，嗜酸乳杆菌与融合子培养12 h后，嗜酸乳杆菌产生丁二酮质量浓度为10.25μg/mg，融合子产生丁二酮质量浓度为8.21μg/mg。嗜酸乳杆菌的产丁二酮能力明显高于融合子，但融合子一定程度上也有产丁二酮能力，也能够在乳制品中产生香味物质。
7融合子遗传稳定性检验
7.1产乳酸能力
将融合子及两种亲本菌株在37℃下恒温培养传代5代，每次传代进行发酵培养24h测定培养液的乳酸含量，结果如图25所示。
由图 25可以看出，融合子各代发酵培养 24 h后产酸能力基本一致，变化不大，虽然略低于嗜酸乳杆菌的产酸能力，地衣芽孢杆菌的产酸能力也基本保持不变。这充分说明了融合子的遗传稳定性较好。
7.2胆固醇清除能力
取嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌及融合子以5 %的接种量接种到高胆固醇液体培养基中37 ℃培养60 h后测其胆固醇清除率，连续传代培养5次，其遗传稳定性如图26所示。从图26中可以看出嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子在连续传代5次后其胆固醇清除率基本稳定，可知其能够稳定的遗传。由图可以呈现出，融合子明显高于两亲本的胆固醇清除率。
7.3 耐酸耐胆盐能力
将嗜酸乳杆菌，地衣芽孢杆菌和融合子连续传代培养5代，每次传代都要在pH为2以及含0.3 %胆盐的选择性培养基中处理2.5 h测定其耐酸及耐胆盐能力，结果如图27所示。由图27可以看出，融合子传代 5 次后，其耐酸或耐胆盐能力基本保持稳定。
7.4产蛋白酶能力
取嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子以5 %的接种量接种到各自培养基中37 ℃培养后测其菌液中蛋白酶活性，连续传代培养五次，其遗传稳定性如图28所示。从图28中可以看出，融合子在连续传代5次后其菌液中蛋白酶活性基本稳定，可知该融合子的遗传稳定性良好，不容易退变。
7.5产淀粉酶能力
将嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子分别于37℃培养箱中连续传代培养5次，每次传代都要产淀粉酶能力的测定。结果如图29所示。
由图可以看出，融合子传代 5 次后，其产淀粉酶性能基本保持稳定。
7.6产丁二酮能力
取嗜酸乳杆菌、融合子以5 %的接种量接种到各自培养基中37 ℃培养12 h后测其菌液中丁二酮质量浓度，连续传代培养五次，其遗传稳定性如图30所示。
从图30中可以看出嗜酸乳杆菌和融合子在连续传代5次后其菌液中丁二酮质量浓度基本稳定，可知其能够稳定的遗传。
融合子发酵酸奶试验
嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌融合而成的融合子遗传了两亲本的优良特性，不仅能够生成乳酸、产生丁二酮而且和能够生成蛋白酶脂肪酶。并且融合子也有较强的耐酸、耐胆盐的能力。可以避免乳酸菌肠道定植时间短的缺点。
1材料与方法
1.1 菌株、仪器及培养基
1.1.1 试验菌株
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）从地衣芽孢杆菌活菌胶囊中分离纯化。融合子（经原生质体融合制备）
1.1.2 主要试剂
鲜牛奶（山西农业大学动科院提供）；其他同前。
1.1.3 主要仪器设备
LRHS-150恒温恒湿培养箱；HH-4数显恒温水浴锅；SW-CJ-2F洁净工作台；万用电炉（220V-AC）；DF205电热鼓风干燥箱；YXQ-LS-18SI不锈钢手握式蒸汽灭菌器；电子天平（BS2202S）；移液枪（eppendorf research 1000）；usb数码成像显微镜；冰箱。
1.2实验方法
1.2.1 实验流程
鲜牛奶→煮沸→过滤→均质→加入白砂糖→杀菌→冷却→接种→发酵→冷却→后熟→成品
1.2.2主要实验步骤
1.2.2.1预热均质：将调配好的料液加热到50～60℃左右，在15～20MPa下均质处理，防止脂肪上浮，增强酸奶凝胶体的稳定性。
1.2.2.2杀菌：将均质后的乳液加热至85～90℃，保温5min杀菌，杀菌温度不宜过高，以免营养成分损失，灭菌处理后，迅速冷却至45℃待接种。
1.2.2.3接种发酵：将嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子按4%接种量接种于冷却至42℃的乳液中，并充分搅拌，然后送入42℃恒温箱，发酵4h左右，迅速移至0～5℃冰箱中进行后发酵冷藏。
1.2.2.4感官鉴定
2 结果与分析
2.1酸奶感官鉴定
用地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、融合子和实验室菌种分别接种发酵酸奶，对其酸奶进行感官评价，结果如下：
表11酸奶感官鉴定
| 发酵菌种 | 感官评定 |
| 地衣芽孢杆菌 | 絮状凝块，乳酯香味浓，有油腻感，香味弥留时间长。 |
| 嗜酸乳杆菌 | 苦味重，入口后最后产生乳酯香味。有乳清析出。 |
| 融合子 | 甜、苦、酯香味同时入口，比较协调柔和，最终以甜味为主。少量乳清析出。 |
| 实验室菌种 | 刺激口水外流，酸味较大，可口、协调、柔和。无乳清析出。 |
由表11，可以看出融合子较嗜酸乳杆菌发酵的酸奶口味协调柔和，而且最终以甜味未主，很大程度上改善了酸奶风味。而地衣芽孢杆菌不产生乳酸，故不生成酸奶。为了改善发酵而成的酸奶品质，将地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和融合子分别与实验室菌种进行1:1配比，进而发酵酸奶。对其发酵而成的酸奶再进行感官评价，结果如下：
表12酸奶感官鉴定
| 发酵菌种 | 感官评定 |
| B.lich :（L. a : B.bul） =1:1 | 突出油酯味，有油腻感，但是没有单独地衣芽孢杆菌油脂味弥留时间长。絮状，较多乳清析出。 |
| L. a : (L. a : B.bul) = 1:1 | 有苦味，但是微苦，苦味被掩盖一些。有少量乳清析出。 |
| Fusant : (L. a : B.bul) = 1:1 | 口味最好，酸甜度正好，奶香味浓郁，无异味。基本无乳清析出。 |
由表12可以看出，经过与实验室菌种进行配比之后，酸奶风味都有了很大的改善。经过最终比较。得出结论，融合子与实验室菌种进行配比，风味很理想。酸甜度正好，奶香味浓郁。
实施例2、一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法，
包括嗜酸乳杆菌原生质体制备，制备条件，菌龄为12h，溶菌酶浓度为10 mg/mL，酶解温度为30 ℃，酶解时间为40 min；
地衣芽孢杆菌原生质体制备，条件，即菌龄为8h，溶菌酶浓度为2.5 mg/mL，酶解温度为30 ℃，酶解时间为4h；
最后使用融合剂，获得的原生质体融合子，所述的融合剂为PEG4000。
实施例3，一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法，
包括嗜酸乳杆菌原生质体制备，制备条件，菌龄为21h，溶菌酶浓度为5 mg/mL，酶解温度为40 ℃，酶解时间为20min；
地衣芽孢杆菌原生质体制备，条件，即菌龄为14h，溶菌酶浓度为0.5mg/mL，酶解温度为40 ℃，酶解时间为2h；
最后使用融合剂，获得的原生质体融合子，所述的融合剂为PEG4000。
Claims (1)
1.一种嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌融合子的制备方法，其特征在于：
嗜酸乳杆菌原生质体制备，制备条件，菌龄为16h，溶菌酶浓度为10mg/mL，酶解温度为36℃，酶解时间为30min ；
地衣芽孢杆菌原生质体制备，条件菌龄为10h，溶菌酶浓度为2mg/mL，酶解温度为37℃，酶解时间为3h ；
最后使用融合剂，获得的原生质体融合子，所述的融合剂为PEG6000。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Huo Nairui Inventor after: Cheng Zhiling Inventor after: Wang Yuhui Inventor after: Ren Zhiyuan Inventor after: Yang Lirong Inventor after: Wu Chaoxia Inventor after: Hou Hongping Inventor after: Wang Rufu Inventor after: Zhang Xinrong Inventor after: Zhang Ye Inventor after: Wang Yuanhui Inventor before: Huo Nairui Inventor before: Cheng Zhiling Inventor before: Wang Yuhui Inventor before: Ren Zhiyuan Inventor before: Yang Lirong Inventor before: Wu Chaoxia Inventor before: Hou Hongping Inventor before: Wang Rufu Inventor before: Zhang Xinrong Inventor before: Zhang Ye Inventor before: Wang Yuanhui |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20150520 Termination date: 20160701 |