CN113582736B - 一种采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法 - Google Patents

一种采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法，所述方法包括以下步骤：农林废弃物的预处理步骤：将高木质素废弃物粉碎，投入筒式混料机与人畜禽粪便混拌协同配合，在混拌过程中加入酶菌复合发酵剂，调节农林废弃物备料的含水率、碳氮比、容重得到发酵原料；发酵原料的堆放步骤；原料发酵步骤：发酵周期为25‑35天，发酵分为四阶段：升温高氧阶段、高温低氧阶段、降温贫氧阶段及常温静置阶段，发酵完成。解决在堆肥制备过程中人畜禽粪便发酵产生的恶臭气味，高木质素废弃物难降解，碳氮气体的排放量高，堆肥质量低等技术难题，最终高效将农林废弃物还田利用增加土壤碳库，实现碳中和。

Description

一种采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法
技术领域
本申请涉及农业堆肥制备领域，具体涉及一种采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法。
背景技术
堆肥是一种好氧发酵处理有机废弃物的方法,主要是在人工控制下,在一定的水分、C/N比和通气条件下通过微生物的发酵作用,将有机物转变转变成肥料的过程。在这种堆肥化过程中,有机物由不稳定状态转化为稳定的腐殖质物质,用作肥料和改良土壤。研究表明，当前我国有机肥料基础资源每年超过50亿吨，其中畜禽粪尿约30亿吨(鲜)，秸秆约10亿吨(风干)，饼肥约0.2亿吨，餐厨垃圾约9000多万吨，园林废弃物约5000万吨。其中高木质素农林废弃物因为木质素含量高抗降解性强，目前常用的堆肥常用菌剂很难有效分解，而且由于呼吸作用加大了碳氮排放引起养分损失。
堆肥作为废弃物资源化利用的关键技术已经得到广泛应用，但好氧堆肥过程中仍然会产生和排放包括二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)、氧化亚氮(N2O)在内的多种有害气体，这不仅在一定程度上造成二次污染，而且造成资源的浪费，降低了堆肥的质量和得率。堆肥过程能形成腐植酸，但腐殖质类物质的合成需要低氧条件，目前采用的典型的好氧堆肥过程普遍分为3个阶段，每个阶段由不同的微生物优势种群降解不同的有机质成分，三个阶段均需要耗氧通气，微生物的过速过量分解不利于腐植酸类大分子物质的合成。因此常用堆肥发酵技术不能找到有效分解高木质素原料的微生物-酶复合堆肥发酵剂，原料发酵时间长，未能精准控制腐植酸大分子的合成，不能有效解决微生物分解过程中出现的碳氮气体高排放量、堆肥得率低、堆肥中腐植酸含量少的问题。
CN110423157A公开了一种生物有机肥加工工艺，本发明通过获取土霉素菌渣、自然堆放、前处理、好氧发酵、陈化、造粒、烘干、冷却、包衣和包装几个步骤完成生物有机肥的加工，采用好氧堆肥技术，利用微生物的作用先将固废中易腐化的有机物质进行分解，转变成富含有机质和含有一定量氮、磷、钾等营养元素的熟料。但是好氧发酵阶段并没有采用控温控氧操作，不能实现低排放、强腐殖化的效果。
CN102740986B公开了一种分解有机物的方法：准备作为分解对象的有机物的工序，以及对所述有机物施用母细胞溶解酶群的工序，其中所述母细胞溶解酶群是伴随者产孢子好氧细菌的孢子形成而细胞溶解中生成的。虽然公开了胞内酶对有机质具有降解能力，但是并没有针对木质素降解进行进一步的研究，也没有给出将胞内酶用于堆肥发酵的应用方法。
肠杆菌降解木质素机制的研究，朱盛伟，《北京化工大学硕士研究生论文》，2019年，研究了肠杆菌对木质素的降解能力。在不同碳源中研究了肠杆菌的生长特性,通过对木质素溶液降解和脱色的测定,酶活的测定,降解产物的检测,评价了肠杆菌降解木质素的能力,结果显示,胞内酶对木质素溶液的降解率可达75%,脱色达到85%,胞外酶活十分有限,胞内酶能检测到漆酶和过氧化物酶,后者活力较高,最高可达150U/L,降解产物中只检测到了少量的芳香族化合物,肠杆菌对木质素的降解能力有限。
CN111072409A公开了一种低排放静态控氧强化腐殖化堆肥的方法，该方法仅采用的复合微生物菌剂做堆肥预处理，并且传统三阶段发酵方式，发酵时间较长，缺失促进大分子腐殖质类物质合成环节的工艺环境控制，对营养物质的利用不充分，在发酵第三阶段排气量较大，造成不必要的浪费。
因此，研究一种使用木质素降解速率更高的酶菌复合发酵剂进行农林废弃物预处理，配合精准控制各阶段的温度和通气的堆肥制备方法，解决在堆肥制备过程中解决人畜禽粪便发酵产生的恶臭气味，高木质素废弃物难降解，碳氮气体的排放量高，堆肥质量低等种种技术难题，最终有效将农林废弃物循环利用，对实现碳中和，促进农业可持续发展均具有重要意义。
发明内容
本申请的发明目的是：原料采用人畜禽粪便和高木质素废弃物协同配合，通过对堆肥原料采用酶菌复合发酵剂进行预处理，时间-温度-氧气通量的调节控制，减少人畜禽粪便原料发酵产生的恶臭气味，实现高木质素原料快速降解，能在发酵初期大量形成腐植酸前体物质-醌类物质，强化腐植酸类大分子有机物合成，大大提高了堆肥中腐植酸的含量。同时克服最终堆肥产品得率底、易氧化有机质和腐植酸含量低的缺点；解决传统高木质素原料难降解，堆肥过程中二氧化碳(CO2)、甲烷 (CH4)、氧化亚氮(N2O)等有害气体排放量高，营养物质流失的技术问题。
为实现上述发明目的，解决上述技术问题，本发明提供一种采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
农林废弃物的预处理步骤：将不同高木质素废弃物分别粉碎至粒径＜5cm的颗粒，投入筒式混料机与人畜禽粪便混拌10-15分钟，高木质素废弃物与人畜禽粪便的质量比为1:7-3:7，在混拌过程中加入占混料总量5-10‰的酶菌复合发酵剂，所述酶菌复合发酵剂包含木质素降解复合菌剂和地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液，混拌完成后，调节农林废弃物备料的55-65％、碳氮比为25-30：1、容重为500-700kg/m3，得到发酵原料；
发酵原料的堆放步骤：将发酵原料堆放在发酵容器内，在发酵容器的底部装有与气泵相连的高压曝气管，空气供气量通过空气流量计进行控制；
原料发酵步骤：堆肥发酵原料在发酵过程无翻抛和无转运，发酵周期为25-35天，发酵分为四阶段进行，分别对四个发酵阶段控制温度和高压供气量;A.升温高氧阶段：调节原料温度快速升高至65℃以上，高压曝气管的供气量为0.42-0.47m3/h/m3，发酵时间4-6天；B.高温低氧阶段：控制堆肥原料温度保持在70-80℃之间，调节曝气供气量为0.20-0.25m3/h/m3，发酵时间6-9天；C.降温贫氧阶段：控制堆肥原料温度逐渐下降至40℃以下，调节供气量为0.05-0.15m3/h/m3，发酵时间7-10天；D.常温静置阶段：控制堆肥原料温度降低至常温，停止曝气，静置，发酵时间7-10天，完成发酵。
进一步的，所述人畜禽粪便由人粪、牛粪、猪粪、鸡粪中的一种或多种组成；所述高木质素废弃物由树木修剪枝、树皮、椰壳、竹粉、菌棒、花生壳的一种或多种组成。
进一步的，所述酶菌复合发酵剂中木质素降解复合菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、白腐菌、克雷伯氏菌、甲苯单胞菌、假单胞菌、红色链霉菌、嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母菌中的一种或多种组合，木质素降解复合菌剂有效活菌数≥1.00×1010 cfu·g-1；所述地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的酶活力为≥5400 U·ml-1；木质素降解复合菌剂与地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的配比为1：2（g：ml）。
进一步的，所述木质素降解复合菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、白腐菌、克雷伯氏菌、甲苯单胞菌、假单胞菌、红色链霉菌、嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母菌，按质量比1.5：1:0.9:1:1:0.8:0.8:1.2:1 复配所得。
更进一步的，所述地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的制备方法如下：准备种子培养基为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，NaCl 5g/L，pH为7.2；准备发酵罐培养基为：酪蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5 g/L，NaCl 5g/L，pH为7.3；挑取已活化的地衣芽孢杆菌菌株单菌落，接种于装有已灭菌的种子培养基三角瓶中，置于摇床振荡培养，在温度为40-45℃，转速为120-160r/min培养 10-13h作为种子液；种子液接种至发酵罐培养，发酵罐条件设置为压力0.05MPa、种子液接种量为1×107CFU/ml，pH值控制在6.8-7.0之间、培养温度为45-48℃和搅拌转速为150 r/min，发酵至4-6小时进入对数生长期，发酵10-11h使活菌和芽孢浓度达最大；此时收集菌液，在8000r·min-1条件下离心10min,收集芽孢杆菌,去除上清液为胞外物质，菌体用0.05mol·L-1磷酸盐缓冲溶液清洗细胞3次，悬浮细胞在超声波细胞粉碎机上破碎,破碎条件为:温度4℃,输出功率400W,时间为30min，同时每破碎8s,间隔4s；细胞破碎后经高速冷冻离心8000r·min- 1, 离心时间为20min,取上清液作为地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液。
本发明的有益效果：
1、本发明堆肥制备原料采用人畜禽粪便和高木质素废弃物协同配合使用，发酵过程减少人畜禽粪便原料发酵产生的恶臭气味，同时实现高木质素原料快速降解，能在发酵初期大量形成腐植酸前体物质-醌类物质，强化腐植酸类大分子有机物合成。
2、本发明采用酶菌复合发酵剂进行堆肥原料预处理，获得地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液，并发现其对木质素具有较强降解能力，选择木质素降解菌与地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液复配的发酵剂，促使难降解的高木质素原料降解效率更高。地衣芽孢杆菌胞内酶同时也为菌的生长进行有效调控，地衣芽孢杆菌胞内酶对木质素的快速分解也为微生物提供丰富营养物质，促进木质素降解菌的繁殖，提高木质素降解菌的生长及木质素降解能力，加快发酵速度。
3、本发明对各发酵阶段的时间-温度-氧气通量进行精准调节控制，升温阶段主要为酶对底物的作用及中温微生物为微生物自身生长繁殖阶段，发酵剂中酶对底物的快速分解为菌剂中的微生物提供丰富营养物质，有效促进微生物快速生长繁殖；高温阶段主要为高温阶段主要是发酵剂中的高温酶及嗜热真菌作用下，进步一堆对难降解物质如纤维素和半纤维素等复杂有机质的分解，中温微生物的生长受到抑制，嗜热性微生物上升为优势群类，堆料中可溶性有机质继续被分解的同时，复杂难分解的高分子脂肪、蛋白质及复杂碳水化合物如纤维素、木质素等及开始被强烈分解，堆体温度继续升高；降温阶段由于可溶性有机质的持续消耗和微生物活性的降低，堆体温度开始下降至环境温度，该阶段中温性微生物重新占据优势并对难降解有机质作进一步的分解；零通氧静置阶段，必要时可以采用膜覆盖，显著减少碳、氮气体排放，有效促进腐植酸类大分子物质的快速最大化合成，堆肥产品得率高、质量好。
4、本发明的堆肥制备方法抑制矿化、固定碳氮，减少恶臭和温室气体产生，显著提高腐殖化效率，减少二次污染、降低成本。相对于传统堆肥工艺，N2O、CH4和CO2的排放系数减少了30～60％，总腐植酸含量提高100-150%，易氧化有机质含量提高40-80%，易氧化有机质含量达到25％左右。
附图说明
图1是实验二堆肥过程中N2O的排放量（ppm）
图2是实验二堆肥过程中CH4的排放量（ppm）
图3是实验二堆肥过程中CO2的排放量（ppm）
具体实施方式
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
实施例1
准备酶菌复合发酵剂步骤，酶菌复合发酵剂包含木质素降解菌复合剂和地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液：
木质素降解复合菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、白腐菌、克雷伯氏菌、甲苯单胞菌、假单胞菌、红色链霉菌、嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母菌，按质量比1.5：1:0.9:1:1:0.8:0.8:1.2:1 复配所得，木质素降解复合菌剂有效活菌数≥1.00×1010 cfu·g-1；
地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的制备方法如下：准备种子培养基为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，NaCl 5g/L，pH为7.2；准备发酵罐培养基为：酪蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH为7.3；挑取已活化的地衣芽孢杆菌菌株单菌落，接种于装有已灭菌的种子培养基三角瓶中，置于摇床振荡培养，在温度为45℃，转速为160 r/min培养 11h作为种子液；种子液接种至发酵罐培养，发酵罐条件设置为压力 0.05MPa、种子液接种量为1×107CFU/ml，pH值控制在7.0、培养温度为45℃和搅拌转速为150 r/min，发酵至4小时进入对数生长期，发酵10h使活菌和芽孢浓度达最大；此时收集菌液，在8000r·min-1条件下离心10min,收集地衣芽孢杆菌,去除上清液胞外物质，菌体用0.05mol·L-1磷酸盐缓冲溶液清洗细胞3次，悬浮细胞在超声波细胞粉碎机上破碎,破碎条件为:温度4℃,输出功率400W,时间为30min，同时每破碎8s,间隔4s；细胞破碎后经高速冷冻离心8000r·min- 1, 离心时间为20min,取上清液作为地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液；地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的酶活力为≥ 5400 U·ml-1；
木质素降解复合菌剂与地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的配比为1：2（g：ml）。
农林废弃物的预处理步骤：农林废弃物原料选择猪粪和树木修剪枝、树皮，将树木修剪枝、树皮分别粉碎至粒径＜5cm的颗粒，投入筒式混料机与猪粪混拌15分钟，树木修剪枝、树皮与猪粪的质量比为1:3，在混拌过程中加入占混料总量9‰的酶菌复合发酵剂，所述酶菌复合发酵剂包含木质素降解菌复合剂和地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液，混拌完成后，调节备料的含水率为63％、碳氮比为30：1、容重为690kg/m3得到发酵原料；
发酵原料的堆放步骤：将预处理后的发酵原料堆放在发酵容器内，在发酵容器的底部装有与气泵相连的高压曝气管，空气供气量通过空气流量计进行控制；
堆肥发酵步骤：发酵周期为28天，发酵分为四阶段进行，分别对四个发酵阶段控制温度和高压供气量，堆肥原料在发酵过程无翻抛和无转运;
A.升温高氧阶段：调节原料温度快速升高至70℃，高压曝气管的供气量为0.44m3/h/m3，发酵时间5天；
B.高温低氧阶段：控制堆肥原料温度保持在78℃，调节曝气供气量为0.23m3/h/m3，发酵时间8天；
C.降温贫氧阶段：控制堆肥原料温度逐渐下降至40℃，调节供气量为0.10m3/h/m3，发酵时间8天；
D.常温静置阶段：控制堆肥原料温度降低至常温，停止曝气，静置，发酵时间7天，完成发酵。
实施例2
农林废弃物的预处理步骤：农林废弃物原料选择牛粪和椰壳，将椰壳粉碎至粒径＜5cm的颗粒，投入筒式混料机与猪粪混拌15分钟，椰壳与牛粪的质量比为3:7，在混拌过程中加入占混料总量10‰的酶菌复合发酵剂，所述酶菌复合发酵剂包含木质素降解菌复合剂和地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液，混拌完成后，调节备料的含水率为62％、碳氮比为28：1、容重为650kg/m3得到发酵原料；准备酶菌复合发酵剂步骤，发酵原料的堆放步骤均与实施例1相同，堆肥发酵步骤：堆肥发酵原料在发酵过程无翻抛和无转运，发酵周期为33天，发酵分为四阶段进行，分别对四个发酵阶段控制温度和高压供气量;
A.升温高氧阶段：调节原料温度快速升高至67℃，高压曝气管的供气量为0.43m3/h/m3，发酵时间6天；
B.高温低氧阶段：控制堆肥原料温度保持在72℃，调节曝气供气量为0.20m3/h/m3，发酵时间9天；
C.降温贫氧阶段：控制堆肥原料温度逐渐下降至40℃，调节供气量为0.15m3/h/m3，发酵时间8天；
D.常温静置阶段：控制堆肥原料温度降低至常温，停止爆气，静置，发酵时间10天，完成发酵。
实施例3
农林废弃物的预处理步骤：农林废弃物原料选择猪粪和竹粉、花生壳，将竹粉、花生壳粉碎至粒径＜5cm的颗粒，投入筒式混料机与猪粪混拌15分钟，竹粉、花生壳与猪粪的质量比为1:4，在混拌过程中加入占混料总量10‰的酶菌复合发酵剂，所述酶菌复合发酵剂包含木质素降解菌复合剂和地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液，混拌完成后，调节备料的含水率为58％、碳氮比为28：1、容重为610kg/m3得到发酵原料；准备酶菌复合发酵剂步骤，发酵原料的堆放步骤均与实施例1相同，堆肥发酵步骤：堆肥发酵原料在发酵过程无翻抛和无转运，发酵周期为26天，发酵分为四阶段进行，分别对四个发酵阶段控制温度和高压供气量;
A.升温高氧阶段：调节原料温度快速升高至69℃，高压曝气管的供气量为0.47-m3/h/m3，发酵时间4天；
B.高温低氧阶段：控制堆肥原料温度保持79℃，调节曝气供气量为0.22m3/h/m3，发酵时间7天；
C.降温贫氧阶段：控制堆肥原料温度逐渐下降至38℃，调节供气量为0.12m3/h/m3，发酵时间7天；
D.常温静置阶段：控制堆肥原料温度降低至常温，停止爆气，静置，发酵时间8天，完成发酵。
实验一：木质素降解复合菌剂与外源酶混合物的木质素降解协同实验
实验例1酶菌复合发酵剂：酶菌复合发酵剂包含木质素降解菌复合剂和地衣芽孢杆菌胞外酶粗提液1：2（g：ml）混合，所用木质素降解复合菌剂与实施例1相同；地衣芽孢杆菌胞外粗提液的制备方式：准备种子培养基为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，NaCl 5g/L，pH为7.2；准备发酵罐培养基为：酪蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5 g/L，NaCl 5g/L，pH为7.3；挑取已活化的地衣芽孢杆菌菌株单菌落，接种于装有已灭菌的种子培养基三角瓶中，置于摇床振荡培养，在温度为45℃，转速为160 r/min培养 11h作为种子液；种子液接种至发酵罐培养，发酵罐条件设置为压力 0.05MPa、种子液接种量为1×107CFU/ml，pH值控制在7.0、培养温度为45℃和搅拌转速为150 r/min，发酵至4小时进入对数生长期，发酵10h使活菌和芽孢浓度达最大；此时收集菌液，在8000r·min-1条件下离心10min,收集地衣芽孢杆菌上清液为胞外粗提液。
实验例2酶菌复合发酵剂：木质素降解复合菌剂与市售过氧化物酶剂混合，市售过氧化物酶的酶活力为≥ 20000 U·ml-1 混合比例2：1（g：g），所用木质素降解复合菌剂以及酶菌复合发酵剂酶活与实施例1相同。
实验例3酶菌复合发酵剂：木质素降解复合菌剂与市售漆酶剂混合，市售过氧化物酶的酶活力为≥ 20000 U·ml-1 混合比例2：1（g：g），所用木质素降解复合菌剂以及酶菌复合发酵剂酶活与实施例1相同。
实验例4酶菌复合发酵剂：实施例1原料预处理采用的酶菌复合发酵剂；
对照例：采用实施例1所用木质素降解复合菌剂为发酵剂，不添加外源酶。
试验方法：
对实验例1-4、对照例进行碱木质素液体培养，以对碱木质素溶液的降解率为标准量化酶菌复合发酵剂对木质素降解能力：分别按照10%的接种比将酶菌复合发酵剂接种到碱木质素降解培养基中，30℃、150 r/min 培养 15 d，测定每天碱木质素降解率。碱木质素降解培养基：碱木质素1.0 g，NH3Cl 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O0.2 g，CaCl2 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·7H2O 0.02 g，琼脂 15.0 g，补水至1000 mL，121℃灭菌 20 min。
实验结果：
相同条件下，对照例在第 1 d 碱木质素降解率为 26.66%，第5d碱木质素降解率31.72%；在第15 d可降解碱木质素 44.08%；实验例1在第 1 d 碱木质素降解率为 33.45%，第5d碱木质素降解率 42.80%；在第15 d可降解碱木质素 50.26%；实验例2在第1 d 碱木质素降解率为 36.25%；第5d碱木质素降解率 51.57%；第15d碱木质素降解率 59%；实验例3在第 1 d 碱木质素降解率为 27.45%，第5d碱木质素降解率 34.32%；在第15 d可降解碱木质素 48.08%；实验例4降解碱木质素能力最强，第1 d 降解速度最快，降解率为48.11%，5 d降解率为 59.06%，第15 d可降解碱木质素70.26%，降解效率远高于对照例以及实验例1-3。
结果显示，实验例4降解碱木质素速度更快，碱木质素15d降解率更高。由此说明，实施例1使用的酶菌复合发酵剂降解碱木质素速度更快，最高降解率更高；木质素降解复合菌剂与地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的组合产生协同作用，优于木质素降解复合菌剂与胞外酶粗提液、过氧化物酶或漆酶的组合。
实验二 控温控氧发酵工艺堆肥发酵阶段对比试验
对比例1：步骤一、步骤二与实施例1相同；步骤三的发酵工艺采用三阶段控温控氧发酵工艺：发酵周期为33天，分别对三个发酵阶段控制温度和高压供气量，堆肥原料在发酵过程无翻抛和无转运;
A.升温高氧阶段：发酵时间9天，高压曝气管的供气量为0.45m3/h/m3，堆肥原料温度迅速升高至65℃；
B.高温低氧阶段：发酵时间9天，堆肥原料温度保持在73℃之间，调节曝气供气量为0.33m3/h/m3，；
C.降温贫氧阶段：发酵时间15天高温阶段完成后，堆肥原料温度逐渐下降至39℃，调节供气量为0.15m3/h/m3，完成发酵。
对比例2：将实施例1中步骤一的酶菌复合发酵剂替换为实验例1，步骤一、步骤二的操作方法与实施例1相同。
对比例3：将实施例1中步骤一的酶菌复合发酵剂替换为实验例2，步骤一、步骤二的操作方法与实施例1相同。
对比例4：将实施例1中步骤一的酶菌复合发酵剂替换为实验例3，步骤一、步骤二的操作方法与实施例1相同。
上述对比例1-4与实施例1在发酵完成时，经检测发芽指数均为90%以上，达到较高堆肥腐熟度标准。
试验方法：
（一）分别对通过实施例1、对比例1-4发酵方法在堆肥过程中进行常见气体排气指标测定：在堆体20CM、80CM、140CM三个不同深度每日取样，测定发酵过程N2O、CH4和CO2的排放量:
气体样品中的N2O、CH4和CO2浓度采用气相色谱Agilent GC 7890测定，测定条件如下：本系统使用CA-5气体样品进样仪（中国科学院大气物理研究所专利产品，专利号分别为：ZL92100938.0和ZL96249356.2）进样，通过微机程序发出指令控制电磁阀开关，三个进样口同步进样一次分析气体中CO2、CH4和N2O浓度，每个进样口的有效进气量为5 ml。GC7890气相色谱使用高纯氮气作载气、氢气作燃烧气、空气作助燃气。气体样品中的CH4在色谱柱Col1中与其它成分分离后进入氢火焰离子化检测器（FID）检测，气体样品中的CO2经色谱柱Col2分离后推入镍触媒转化器在375℃高温下被H2还原定量转化成CH4后被FID检测，气体样品中的N2O经前置柱Col3和分析柱Col4处理后被电子捕获检测器（ECD）检测。
实验结果：
由附图1可知，对比例1堆肥实验在堆肥第一阶段初期和第三阶段（第24天-33天）N2O排放量陡增，实施例1和对比例2-4在整个发酵过程的四个阶段都处于平稳排气状态，且对比例1-4的N2O的排放水平整体相对较高，实施例1的N2O的排放水平整体低于与对比例1-4。
由附图2可知，对比例1-3堆肥实验CH4排放量在整个发酵过程中出现多次峰值，其中对比例1的三阶段发酵过程中出现5次较高CH4排放，实施例1和对比例4在整个发酵过程的四个阶段都处于平稳排气状态，实施例1的CH4的排放水平整体低于与对比例1-4。
由附图3可知，实施例1与对比例1-4的CO2的排放水平在整个发酵过程中都未出现陡增和锐减，其中对比例1的CO2排放量整体最高，实施例1的CO2的排放水平整体较低。
由此可见，实施例1采用酶菌复合发酵剂预处理原料后，结合四阶段控温控氧发酵方法，在堆肥过程中N2O、CH4和CO2的排放水平明显低于对比例1-4。对比例1的三阶段控温控氧发酵整体排气量最高，耗时最久。
（二）分别对通过实施例1、对比例1-4发酵方法获得的堆肥产品进行堆肥产品堆体体积下降率、堆肥产品总腐植酸含量和易氧化有机质含量的测定。总腐植酸含量采用《中华人民共和国国家标准GB/T11957-2001》的焦磷酸钠碱抽提法测量，易氧化有机质含量采用《中华人民共和国农业行业标准NY/T2876-2015》高锰酸钾氧化法测量。
实验结果：
实施例1发酵方法堆体体积下降率35.3％，获得的堆肥产品中总腐植酸含量31.90%，易氧化有机质含量25%。
对比例1发酵方法堆体体积下降率47.8％，获得的堆肥产品中总腐植酸含量25.90%，易氧化有机质含量14%。
对比例2发酵方法堆体体积下降率35.0％，获得的堆肥产品中总腐植酸含量14.02%，易氧化有机质含量10.1%。
对比例3发酵方法堆体体积下降率34.8％，获得的堆肥产品中总腐植酸含量12.77%，易氧化有机质含量12.5%。
对比例4发酵方法堆体体积下降率30.8％，获得的堆肥产品中总腐植酸含量15.24.%，易氧化有机质含量14.2%。
结果显示，对比例1的堆体体积下降率最高，对比例1堆肥产品中腐植酸含量总腐植酸含量、易氧化有机质含量参数测定值高于对比例2-4，但是远低于实施例1。说明对比例1的原料降解效率高但物质损耗也高，结合气体排放量实验结果发现，对比例1的三阶段发酵方法碳氮气体排放量整体较高，营养物质流失严重。
对比例2-4的堆体体积下降率与实施例1数值接近，但是堆肥产品中总腐植酸含量、易氧化有机质含量参数测定值显著低于实施例1。说明对比例2-4的原料降解效率低，营养物质不能有效快速矿化，因此合成大分子腐植酸和易氧化有机质营养物质较少。
实施例1的堆肥产品中总腐植酸含量、易氧化有机质含量参数测定值高于对比例1，显著高于对比例2-4，堆体体积下降率低于对比例1，与对比例2-4接近，结合气体排放量实验结果可知：实施例1采用的酶菌复合发酵剂预处理原料后，结合四阶段发酵方法，控制碳氮气体排放量整体较低，有效的合成大分子腐植酸和易氧化有机质；这说明前期阶段形成了大量腐植酸前体物质，说明原料采用酶菌复合发酵剂预处理后，矿化速度快，降解充分。堆肥产品的得率虽与对比例2-4相接近，但是产品质量好，腐植酸含量高，营养物质流失较少。
由此可知，采用包含地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的酶菌复合发酵剂，对富含高木质素的原料进行预处理，可对堆肥原料快速分解，矿化为小分子物质后，在常规的三阶段堆肥发酵工艺基础上增加停止供氧的常温静置第四阶段，促进腐植酸类大分子有机质的合成，有效的解决了由于原料快速降解带来的高排气，不能有效合成腐植酸大分子的技术问题。酶菌复合发酵剂与四阶段发酵的改进工艺相配合，提高了高木质素堆肥原料发酵的速率和产品得率，减少碳氮气体的排放，减少营养物质的流失。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (2)

1.一种采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
农林废弃物的预处理步骤：
将不同高木质素废弃物分别粉碎至粒径＜5cm的颗粒，投入筒式混料机与人畜禽粪便混拌10-15分钟，高木质素废弃物与人畜禽粪便的质量比为1:7-3:7，在混拌过程中加入占混料总量5-10‰的酶菌复合发酵剂，所述酶菌复合发酵剂包含木质素降解复合菌剂和地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液，混拌完成后，调节农林废弃物备料的含水率为55-65％、碳氮比为25-30：1、容重为500-700kg/m3，得到发酵原料；
发酵原料的堆放步骤：
将发酵原料堆放在发酵容器内，在发酵容器的底部装有与气泵相连的高压曝气管，空气供气量通过空气流量计进行控制；
原料发酵步骤：
发酵原料在发酵过程无翻抛和无转运，发酵周期为25-35天，发酵分为四阶段进行，分别对四个发酵阶段控制温度和高压供气量；
A.升温高氧阶段：调节原料温度快速升高至65℃以上，高压曝气管的供气量为0.42-0.47m3/h/m3，发酵时间4-6天；
B.高温低氧阶段：控制堆肥原料温度保持在70-80℃之间，调节曝气供气量为0.20-0.25m3/h/m3，发酵时间6-9天；
C.降温贫氧阶段：控制堆肥原料温度逐渐下降至40℃以下，调节供气量为0.05-0.15m3/h/m3，发酵时间7-10天；
D.常温静置阶段：控制堆肥原料温度降低至常温，停止曝气，静置，发酵时间7-10天，完成发酵；
所述酶菌复合发酵剂中木质素降解复合菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、白腐菌、克雷伯氏菌、甲苯单胞菌、假单胞菌、红色链霉菌、嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母菌中的一种或多种组合，木质素降解复合菌剂有效活菌数≥1.00×1010cfu·g-1；所述地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的酶活力为≥5400U·ml-1；木质素降解复合菌剂与地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的配比为1：2(g：ml)；
所述木质素降解复合菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、白腐菌、克雷伯氏菌、甲苯单胞菌、假单胞菌、红色链霉菌、嗜热侧孢霉菌、酿酒酵母菌，按质量比1.5：1:0.9:1:1:0.8:0.8:1.2:1复配所得；
所述地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液的制备方法如下：挑取已活化的地衣芽孢杆菌菌株单菌落，接种于装有已灭菌的种子培养基三角瓶中，置于摇床振荡培养，在温度为40-45℃，转速为120-160r/min培养10-13h作为种子液；种子液接种至发酵罐培养，发酵罐条件设置为压力0.05MPa、种子液接种量为1×107CFU/ml，pH值控制在6.8-7.0之间、培养温度为45-48℃和搅拌转速为150r/min，发酵至4-6小时进入对数生长期，发酵10-11h使活菌和芽孢浓度达最大；此时收集菌液，在8000r·min-1条件下离心10min,收集地衣芽孢杆菌,去除上清液胞外物质，菌体用0.05mol·L-1磷酸盐缓冲溶液清洗细胞3次，悬浮细胞在超声波细胞粉碎机上破碎,破碎条件为:温度4℃,输出功率400W,时间为30min，同时每破碎8s,间隔4s；细胞破碎后经高速冷冻离心8000r·min-1,离心时间为20min,取上清液作为地衣芽孢杆菌胞内酶粗提液；
所述种子培养基为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，NaCl 5g/L，pH为7.2；所述发酵罐培养基为：酪蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH为7.3。
2.如权利要求1所述的采用酶菌复合发酵剂进行四阶段式发酵的堆肥制备方法，其特征在于，所述人畜禽粪便由人粪、牛粪、猪粪、鸡粪中的一种或多种组成；所述高木质素废弃物由树木修剪枝、树皮、椰壳、竹粉、菌棒、花生壳中的一种或多种组成。
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