CN106834197B - 一种乳杆菌vbnc态的诱导方法 - Google Patents

一种乳杆菌vbnc态的诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳杆菌VBNC态的诱导及其检测方法，该方法包括乳杆菌的活化、乳杆菌VBNC态的诱导、乳杆菌VBNC态的检测、荧光显微镜检测样品前处理与荧光显微镜检测等步骤。本发明使干酪乳杆菌Zhang通过灭菌生理盐水4℃诱导成功获得了的该菌的VBNC态，保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中4℃诱导下进入VBNC态，且乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，依旧保持完整细胞结构。所述的乳杆菌VBNC态仍具有一定的活性，并在适当条件下会恢复至可培养态，为提高乳杆菌在生产应用过程中活性的研究奠定基础。同时，本发明采用荧光染料(SYTO‑9和PI)与Leica DM4000B正置荧光显微镜的结合建立了一种采用载玻片而非滤膜的方便、快速检测细胞活性的方法。

Description

一种乳杆菌VBNC态的诱导方法
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种乳杆菌的VBNC态诱导方法。
【背景技术】
目前，人们认为细菌通常有“活的可培养态”、“活的不可培养态”和“死亡态”三种状态，活性细菌应该指的是前两种。早在上世纪80年代初，徐怀恕等人(Survival andviability ofnonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in theestuarine and marine environment.)就首次提出活的不可培养态(Viable butnonculturable,VBNC)细菌的概念。这种活的不可培养态细菌在不良外界条件下会处于异常的生理状态，在常规培养基上不能生长繁殖，但细菌在这种状态下依然保持低水平代谢活性和一定的基因表达。当恶劣环境解除时，它又会回到可培养状态，所以VBNC态细菌也是有一定活性的。截止到2016年3月，已经发现了42个属的68种细菌存在VBNC态，但其中大部分为为革兰氏阴性致病菌，对革兰氏阳性菌的研究并不多见。检测某细菌是否具有VBNC态与细菌种类、诱导条件和检测方法等有关。
乳酸菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不产生芽孢、发酵糖类物质产生以乳酸为主要代谢产物的细菌总称。乳酸菌种类繁多，分布也极其广泛，目前已发现乳酸菌包括43个属，373个种和亚种，而且每年都有新乳酸菌种属被分离和发现(http://www.bacteria.cict.fr/)。乳酸菌根据形态可分为杆菌和球菌；根据生化特性主要分为乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、肠球菌属、片球菌属、链球菌属和双歧杆菌属等。乳杆菌是乳酸菌的一个属。
在研究我国少数民族地区自然发酵乳制品中乳酸菌多样性时，本发明人发现通过DGGE、焦磷酸测序等非培养技术方法检测到在平板培养法难以分离得到的乳酸菌种属，这证实了在传统发酵乳制品中确实存在着VBNC态的乳酸菌。有些乳酸菌是人和动物的肠道益生菌，它具有改善机体代谢，促进生长和提高免疫力等优点，并对维持肠道的生态平衡有重要作用。但乳酸菌在进入胃肠道系统时要面临胃酸和胆盐等不利自身生存的环境，可能会导致其进入VBNC态，这样不但影响了其自身的生长和代谢，还可能会直接影响其应用过程中益生功能的发挥。此外，在乳酸菌发酵剂的制备、生产和应用过程中不可避免的要耐受各种环境压力，诸如极端的温度、酸、高温、低温、冷、渗透压、氧和饥饿等，导致其可能进入VBNC态。
采用传统平板计数法不能对VBNC态细胞进行计数，随着荧光染料与显微镜结合法、RT-PCR法、流式细胞仪检测法等非培养技术的出现，使我们能有更好地去研究活性细胞，特别是VBNC态细胞。荧光显微镜观察法是研究VBNC态细菌最常见的方法，由于这种方法操作简单方便、节省时间，所以被广泛于细菌活性的检测。细菌活性检测常用的荧光染料包括吖啶橙、SYTO-9、PI(碘化丙啶)、萘啶酮酸、溴化乙啶等。SYTO-9是一种能穿透完整细胞膜的小分子核酸荧光染料，PI是一种能渗透到细胞膜破损细胞内的大分子核酸染料。细胞染色后在荧光显微镜下观察时，有完整质膜结构的活性细胞呈绿色，细胞膜结构被损坏的死细胞呈红色。
目前对乳源的乳杆菌VBNC态的研究并不多见。本发明采用多种条件对乳源的2株乳杆菌发酵剂进行VBNC态的诱导，摸索出采用两种荧光染料SYTO-9和PI与Leica DM4000B正置荧光生物显微镜结合检测乳杆菌活性的方法，检测了诱导过程中的乳杆菌活性，获得了乳杆菌的VBNC态，得到了乳酸杆菌在一定环境条件下的活菌变化规律。其中检测VBNC态的方法具有操作简单易操作、节约时间、检测范围广、成本低且可以检测多种乳杆菌样本，并可以广泛应用于乳杆菌在生产、贮藏、应用过程中活性检测，包括VBNC态的检测等领域。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种乳杆菌的VBNC态诱导方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种乳杆菌的VBNC态诱导方法。
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的乳杆菌接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养，传代培养三代，得到活化乳杆菌，离心分离，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，然后重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的乳杆菌菌悬液接入到诱导液体中，使乳杆菌终浓度106～107CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中的初始活菌数，然后对诱导液中乳杆菌进行VBNC态诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养，检测诱导过程中乳杆菌的可培养活菌数；
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，离心收集菌泥，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
F.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL或50μL悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤E配制的荧光染料SYTO-9与PI，立即将菌液与荧光染料混匀后甩至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜，在激发波长450～490nm与发射波长515 nm下观察并计数；
G.荧光显微镜计数
在荧光显微镜计数时，随机选择至少10个不同的视野，且每个视野内的荧光细胞数在30～300个之间，最后取平均值；在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活性细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死菌细胞。细胞的具体计数按照以下公式：
式中：
E为样品中乳杆菌细胞数，个/mL；S1为载玻片面积，mm；S2为显微镜油镜视野面积，mm；V为样品稀释倍数；X为10个视野内平均细胞数，个。
根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，所述的乳杆菌是干酪乳杆菌Zhang与保加利亚乳杆菌ND02；该乳杆菌的活化是在温度37℃下活化培养18～24小时。
根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，收集活化乳杆菌菌泥是在转速10000r/min下离心分离5～10min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的诱导液体选自液体MRS培养基、pH2.0～3.0液体LB培养基、灭菌蒸馏水、灭菌生理盐水或pH2.0～3.0模拟人工胃液。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的VBNC态诱导是在室温、4℃或-20℃的温度下进行的。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，MRS琼脂培养基倾注平板在温度37℃的条件下恒温静置培养。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A和D中，在用灭菌生理盐水洗涤菌泥时，以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3～5。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤F中，向乳杆菌悬浮液中加入0.6倍体积的荧光染料SYTO-9与0.4倍体积的荧光染料PI。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤F中，所述的抗荧光淬灭封片剂是碧云天公司的P0126抗荧光淬灭封片剂。
本发明还涉及所述诱导方法获得的VBNC态乳杆菌，干酪乳杆菌Zhang在灭菌生理盐水中在温度4℃的诱导条件下第80天进入VBNC态；保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中在温度4℃的诱导条件下第190天进入VBNC态；所述乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，并保持完整细胞结构。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种乳杆菌的VBNC态诱导方法。
所述乳杆菌VBNC态诱导方法步骤如下：
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的乳杆菌接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养，传代培养三代，得到活化乳杆菌，离心分离，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，然后重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；
所述的乳杆菌都是目前从市场上可以获得的乳杆菌，例如由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的干酪乳杆菌Zhang，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的保加利亚乳杆菌ND02。这2株菌均为乳制品来源的乳杆菌，并制备了乳杆菌发酵剂用于工业化生产。
干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang)是从传统发酵酸马奶分离到的一株益生特性优异的乳杆菌，具有较强的耐酸耐胆盐及抗氧化等益生性能，目前已经实施了其产业化开发及应用。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center)，保藏号CGMCC 1697。
保加利亚乳杆菌ND02(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND02)分离自传统发酵的酸牦牛奶中，是一株具有优良发酵特性的乳杆菌，目前已实现了其及其乳制品的工业化生产。
在本发明中，乳杆菌活化的液体MRS培养基是由大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸钠2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.054g与1000mL蒸馏水组成，其pH值6.2～6.8。
在本发明中，乳杆菌是在液体MRS培养基中在37℃下培养18～24小时，并且以同样方式进行活化培养三代。
在这个步骤中，使用由德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，让活化乳杆菌菌悬液在转速10000r/min下离心分离5～10min，得到的上清液弃去，得到的菌泥用灭菌生理盐水充分洗涤，其洗涤目的在于除去其中夹带的培养基，因为残留的培养基会不但会影响诱导结果，还会在荧光显微镜下自发荧光而干扰观察结果。在用灭菌生理盐水洗涤时，以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3～5。在本发明中通常需要以相同方式洗涤2～3次。所述的菌泥在每次洗涤后需要在转速10000r/min下离心分离3min。
洗涤的菌泥用灭菌生理盐水制备菌重悬液时，其中以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：5～10。如果菌泥与灭菌生理盐水的比大于1：5，则乳杆菌菌悬液的浓度较大，导致接菌量变小，容易产生误差；如果菌泥与灭菌生理盐水的比小于1：10，则乳杆菌菌悬液浓度小，体积大，接菌震荡混匀时不易操作；因此，菌泥与灭菌生理盐水的比为1：5～10是合理的，优选地是1：6～8。
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的乳杆菌菌悬液接入到诱导液体中，使乳杆菌终浓度约106～107CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后对诱导液中乳杆菌进行VBNC态诱导；
在本发明中，所述的诱导液体选自液体MRS培养基、pH2.0～3.0液体LB培养基、灭菌蒸馏水、灭菌生理盐水或pH2.0～3.0模拟人工胃液。
本发明使用的LB培养基是由胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g及1000mL蒸馏水组成。
本发明使用的pH2.0～3.0模拟人工胃液是用1mol/L HCl溶液将以重量计0.20％NaCl溶液的pH值分别调节至2.0、2.5和3.0，加入3.0g/L胃蛋白酶(3000U/mg)，经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后备用。
在这个步骤中，所述的VBNC态诱导是在室温、4℃或-20℃的温度下进行的。例如干酪乳杆菌Zhang在不同诱导条件下的诱导情况参见附图2，由附图2可见，干酪乳杆菌Zhang在液体MRS培养基中在温度4℃诱导的条件下在第220天时平板的特征菌落数为零，而其它条件能使干酪乳杆菌Zhang在第70～100天之间进入活但不可培养态。
保加利亚乳杆菌ND02在不同诱导条件下失去活性图参见附图5，图中横坐标为平板计数法检测Lb.bulgaricus ND02可培养活菌数为零的时间，纵坐标为荧光显微镜检测的活性细胞数为零的时间。由附图5可见，保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS培养基中在诱导温度4℃的条件下在第190天平板的特征菌落数才为零，而低pH值、寡营养及低温的复合诱导条件能使其迅速在第25～40天内可培养活菌数降为零，不同的诱导条件能在不同的时间内使保加利亚乳杆菌ND02进入活但不可培养态。
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养，检测乳杆菌诱导液中的可培养活菌数。当然，在培养后期需依据结果调整取样时间。
在这个过程中，采用平板菌落计数法检测在该乳杆菌诱导液中的可培养活菌数。所述的平板菌落计数法检测可培养细胞数是本技术领域技术人员熟知的方法。
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，离心收集菌泥，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
在这个步骤中，所述的离心分离是在转速8000～12000r/min下离心分离3～5min。
这个步骤使用的离心机与前面描述的离心机相同，因此不再赘述。
按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3～5，得到的菌泥用灭菌生理盐水进行洗涤。
洗涤的菌泥沉淀最好立即用于染色观察，以免影响最终结果。
E.荧光染料溶液配制
将荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
荧光染料SYTO-9能够对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活细胞和死细胞进行染色。SYTO-9可以穿过任何完整和破损的细胞壁，倾向于与双链DNA结合而呈现绿色荧光，其激发波长为480nm，发射波长为500nm。
荧光染料PI(碘化丙啶)是一种能渗透到细胞膜破损细胞内的大分子核酸染料，与SYTO-9竞争核酸着染位点。在嵌入双链DNA后释放20～30倍红色荧光，常用于细胞凋亡检测，尽管PI不能通过活细胞膜，却能穿过破损细胞膜而对核染色，其激发波长为490，发射波长为635nm。
本发明使用的荧光染料SYTO-9与荧光染料PI都是目前市场上销售的产品，例如由Thermo Fisher公司以9和Propidium Iodide销售的产品，或由Thermo Fisher公司以BacLightTM bacterial viability kit销售的产品。
根据本发明，两种荧光染料溶液在温度-20℃与避光下保存，并可以存放一年。
F.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL或50μL悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤E配制的荧光染料SYTO-9与PI，立即将菌液与荧光染料混匀后甩至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜观察并计数，其中激发波长450～490nm，发射波长515nm。
本发明中，向乳杆菌悬浮液中加入步骤E配制的0.6倍体积的荧光染料SYTO-9与0.4倍体积的荧光染料PI。
本发明中，Leica DM4000B正置荧光显微镜采用的是蓝色滤光块I3，且其激发波长为450～490nm，发射波长为515nm。
在这个步骤中，所述的抗荧光淬灭封片剂选自碧云天公司以P0126销售的抗荧光淬灭封片剂，以及Southern Biotech公司以0100-01销售的Fluoromount-G荧光封片剂。
G.荧光显微镜计数
在荧光显微镜计数时，随机选择至少10个不同的视野，且每个视野内的荧光细胞数在30～300个之间，最后取平均值；在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活菌细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死菌细胞；整个视野中红色荧光细胞与绿色荧光细胞之和为死活菌细胞总数；细胞的具体计数按照以下公式：
式中：
E为样品中活性乳杆菌细胞数，个/mL；S1为载玻片面积，mm；S2为显微镜油镜视野面积，mm；V为样品稀释倍数；X为10个视野内平均细胞数，个。
本发明还涉及所述诱导方法获得的VBNC态乳杆菌，干酪乳杆菌Zhang在灭菌生理盐水中在温度4℃的诱导条件下第80天进入VBNC态；保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中在温度4℃的诱导条件下第190天进入VBNC态；所述乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，并保持完整细胞结构。
采用本发明方法得到的乳杆菌VBNC态进行了形态的对比观察。
使用扫描电镜(SEM)在常规研究条件下对比观察本发明获得的乳杆菌VBNC态与不经诱导处理的正常态之间表观微形态变化。用双面胶将VBNC态与正常态乳杆菌固定于样品台上，喷金后采用扫描电镜观察细胞表观微形态变化，结果见附图1。这个结果表明乳杆菌VBNC态与正常态相比，细胞表面出现褶皱，长度缩短，并保持完整细胞结构。
[有益效果]本发明的有益效果如下：
I、本发明首次对有工业化应用前景的2株乳杆菌(干酪乳杆菌Zhang与保加利亚乳杆菌ND02)进行VBNC态的诱导，同时利用平板计数法与荧光显微镜检测法检测乳杆菌的VBNC态，最终通过灭菌生理盐水中温度4℃的诱导获得了VBNC态的干酪乳杆菌Zhang，通过液体MRS中温度4℃的诱导获得了VBNC态的保加利亚乳杆菌ND02，证实了乳杆菌在某些不利自身生长的条件下会进入VBNC态，且乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，依旧保持完整细胞结构。
II、本发明所述的乳杆菌VBNC态仍具有一定的活性，并在适当条件下会恢复至可培养态，为提高乳杆菌在生产应用过程中活性的研究奠定基础。
III、显微镜观察时应用了抗荧光淬灭封片剂，不但延缓了荧光淬灭时间，还增加了载玻片与盖玻片之间的吸附力，减少细菌在液体中漂动速度，使荧光样本制作更方便、快捷，拍照清晰。
IV、本发明同时采用荧光染料、载玻片与Leica DM4000B正置荧光显微镜结合建立了一种方便、快速检测细胞活性的方法。
V、鉴于干酪乳杆菌Zhang和保加利亚乳杆菌ND02在益生菌发酵剂制备企业、伊利乳业等大企业都有工业化生产应用，本发明对我国具有自主知识产权的、具有工业化应用前景的乳杆菌进行VBNC态诱导，对生产和应用有重要的指导意义。
【附图说明】
图1是干酪乳杆菌Zhang和保加利亚乳杆菌ND02扫描电镜观察图；
图中：
1-A为干酪乳杆菌Zhang正常态与VBNC态扫描电镜图，
1-B为保加利亚乳杆菌ND02正常态与VBNC态扫描电镜图；
图2是干酪乳杆菌Zhang在不同诱导条件下的诱导曲线；
图中：
●液体MRS培养基，诱导温度4℃；△液体LB培养基,pH2.0～3.0,诱导温度4℃；□灭菌蒸馏水，诱导温度室温；◆灭菌蒸馏水，诱导温度4℃；○生理盐水，诱导温度4℃；■生理盐水，诱导温度-20℃。
图3是干酪乳杆菌Zhang的荧光显微镜图片；
图中：
3-A为正常态荧光图片，图3-B为VBNC态荧光图片；
图4是干酪乳杆菌Zhang平板计数结果与荧光显微镜计数结果图；
图中：
●荧光显微镜计数结果；■平板计数结果；
图5是保加利亚乳杆菌ND02在不同诱导条件下失去活性图；
图中：
横坐标为平板计数法检测Lb.bulgaricus ND02可培养活菌数为零的时间，纵坐标为荧光显微镜检测的活性细胞数为零的时间。
图6是保加利亚乳杆菌ND02的荧光显微镜图片；
图中：
6-A正常态荧光图片，6-B VBNC态荧光图片；
图7为保加利亚乳杆菌ND02平板计数结果与荧光显微镜计数结果图；
图中：
▲荧光显微镜计数结果，■平板计数结果。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：干酪乳杆菌Zhang VBNC态的诱导
该实施例的实施步骤如下：
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养18小时，传代培养三代，得到活化干酪乳杆菌Zhang，使用由德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离5min，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，所述的菌泥在每次洗涤后需要在转速10000r/min下离心分离3min，然后按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：6，将洗涤菌泥重悬于灭菌生理盐水中，制成干酪乳杆菌Zhang菌悬液；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的干酪乳杆菌Zhang菌悬液接入到灭菌生理盐水的诱导液体中，使干酪乳杆菌Zhang终浓度约107CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后对诱导液中乳杆菌在4℃下进行VBNC态的诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，前期按照每隔10d时间采用MRS琼脂培养基倾注培养，采用平板菌落计数法检测诱导过程中乳杆菌的可培养活菌数，后期需根据结果调整取样时间。
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，使用由德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速8000r/min下离心分离5min，收集菌泥，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将由Thermo Fisher公司销售的荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
E.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL悬浮液，然后往该悬浮液中加入步骤E配制的0.6倍体积的荧光染料SYTO-9溶液和0.4倍体积的PI溶液，接着混匀，轻甩混合液至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜采用蓝色滤光块I3，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；观察结果参见附图3，其中图3-A为正常态荧光图片，图3-B为VBNC态荧光图片。在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死细胞。结果表明，经灭菌生理盐水4℃诱导的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞长度变短，虽然视野内红色死菌细胞数明显多于正常态，但仍有一定数量的绿色活菌细胞存在，有利于下一步VBNC态复苏的研究。
F.荧光显微镜计数
在荧光显微镜计数时，随机选择至少10个不同的视野，且每个视野内的荧光细胞数在30～300个之间，最后取平均值；在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活性细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死菌细胞；整个视野中红色荧光细胞与绿色荧光细胞之和为死活菌细胞总数；细胞的具体计数按照以下公式：
式中：
E为样品中活性乳杆菌细胞数，个/mL；S1为载玻片面积，mm；S2为显微镜油镜视野面积，mm；V为样品稀释倍数；X为10个视野内平均细胞数，个。
本实施例的干酪乳杆菌Zhang平板计数结果与荧光显微镜计数结果列于附图4；图中●为荧光显微镜计数结果，■为平板计数结果。这些结果清楚表明，干酪乳杆菌Zhang在灭菌生理盐水中4℃诱导过程中，经平板计数法检测的可培养活菌数一直呈下降趋势，并在诱导的第80天时降为零，此时结合荧光显微镜观察发现，视野内存在一定数量的绿色活菌细胞，表明此时干酪乳杆菌Zhang已经进入了VBNC态，且此条件下的VBNC态维持时间长适合进行下一步VBNC态复苏的研究。
实施例2：干酪乳杆菌Zhang VBNC态的诱导
该实施例的实施步骤如下：
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养24小时，传代培养三代，得到活化干酪乳杆菌Zhang，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离10min，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：4，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤3次，所述的菌泥在每次洗涤后需要在转速10000r/min下离心分离3min，然后按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：8，将洗涤菌泥重悬于灭菌生理盐水中，制成干酪乳杆菌Zhang菌悬液；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的干酪乳杆菌Zhang菌悬液接入到灭菌蒸馏水的诱导液体中，使干酪乳杆菌Zhang终浓度约106CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后使诱导液中乳杆菌在室温下进行VBNC态诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，按照每隔5d的时间采用MRS琼脂培养基倾注培养，采用平板菌落计数法检测诱导过程中干酪乳杆菌Zhang的可培养活菌数，后期根据结果调整为每隔10天取样检测。
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速12000r/min下离心分离3min，收集菌泥，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：5，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤3次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将由Thermo Fisher公司销售的荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
E.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成50μL悬浮液，然后往该悬浮液中加入步骤E配制的0.6倍体积的荧光染料SYTO-9溶液和0.4倍体积的PI溶液，接着混匀，轻甩混合液至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜采用蓝色滤光块I3，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；观察结果与附图3结果基本一致，经灭菌蒸馏水室温诱导的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞长度变短，视野内红色死菌细胞数远远多于正常态，只有少量的绿色活菌细胞存在，并不利于进一步的复苏研究。
F.荧光显微镜计数
其荧光显微镜计数与实施例1相同。
本实施例的干酪乳杆菌Zhang平板计数结果见附图2(□为灭菌蒸馏水中室温诱导)，这些结果清楚表明，干酪乳杆菌Zhang可以在灭菌蒸馏水中室温诱导的第100d进入VBNC态，但荧光显微镜检测的绿色活菌数量过少，并不利于进一步复苏的研究。
实施例3：干酪乳杆菌Zhang VBNC态的诱导
该实施例的实施步骤如下：
A.乳杆菌VBNC态诱导的前处理
将冷冻保存的干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养22小时，传代培养三代，得到活化干酪乳杆菌Zhang，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离8min，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：5，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，所述的菌泥在每次洗涤后需要在转速10000r/min下离心分离3min，然后按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：7，将洗涤菌泥重悬于灭菌生理盐水中，制成干酪乳杆菌Zhang菌悬液；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的干酪乳杆菌Zhang菌悬液接入到灭菌生理盐水诱导液体中，使干酪乳杆菌Zhang终浓度约107CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后对诱导液中乳杆菌在-20℃的温度下进行VBNC态诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，按照每隔5d的时间采用MRS琼脂培养基倾注培养，采用平板菌落计数法检测干酪乳杆菌Zhang诱导液中的可培养活菌数，后期根据结果调整为每隔10d取样检测。
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离4min，收集菌泥，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：4，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将由Thermo Fisher公司销售的荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
E.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL悬浮液，然后往该悬浮液中加入步骤E配制的0.6倍体积的荧光染料SYTO-9溶液和0.4倍体积的PI溶液，接着混匀，轻甩混合液至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜采用蓝色滤光块I3，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；其观察结果与实施例2的结果基本一致，VBNC态的乳杆菌长度变短，但视野内绿色活菌数量过少，不利于下一步复苏研究。
F.荧光显微镜计数
荧光显微镜计数结果与实施例1相同。
本实施例的干酪乳杆菌Zhang平板计数结果见附图2(■为灭菌生理盐水中-20℃诱导)，荧光显微镜计数结果与附图4的结果基本一致。这些结果清楚表明，干酪乳杆菌Zhang可以在灭菌生理盐水中-20℃诱导的第70d时进入VBNC态，但由于VBNC态细胞数量过少并不利于进一步复苏研究。
实施例4：保加利亚乳杆菌ND02VBNC态的诱导
该实施例的实施步骤如下：
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的保加利亚乳杆菌ND02接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养18小时，传代培养三代，得到活化保加利亚乳杆菌ND02，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离7min，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：5，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，所述的菌泥在每次洗涤后需要在转速10000r/min下离心分离3min，然后按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：8，将洗涤菌泥重悬于灭菌生理盐水中，制成保加利亚乳杆菌菌悬液；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的保加利亚乳杆菌ND02菌悬液接入到液体MRS诱导液体中，使保加利亚乳杆菌ND02终浓度约107CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后对诱导液中乳杆菌在4℃的温度下进行VBNC态诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，按照每隔10d的时间采用MRS琼脂培养基倾注培养，采用平板菌落计数法检测诱导过程中保加利亚乳杆菌ND02的可培养活菌数。
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速9000r/min下离心分离3min，收集菌泥，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将由Thermo Fisher公司销售的荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
E.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL悬浮液，然后往该悬浮液中加入步骤E配制的0.6倍体积的荧光染料SYTO-9溶液和0.4倍体积的PI溶液，接着混匀，轻甩混合液至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜采用蓝色滤光块I3，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；观察结果参见附图6，其中图6-A为正常态荧光图片，图6-B为VBNC态荧光图片。在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死细胞。6-A中的绿色细胞(正常态)比6-B的绿色细胞(VBNC态)长些，说明保加利亚乳杆菌ND02进入VBNC态的过程中细胞变短。附图6的结果清楚表明，通过液体MRS中4℃诱导的保加利亚乳杆菌ND02的VBNC态虽然仍保持杆状但长度有所缩短，而显微镜视野内也存在一定绿色活菌数量，比较适宜进一步VBNC态复苏的研究。
F.荧光显微镜计数
在荧光显微镜计数时，随机选择至少10个不同的视野，且每个视野内的荧光细胞数在30～300个之间，最后取平均值；在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活菌细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死菌细胞；整个视野中红色荧光细胞与绿色荧光细胞之和为死活菌细胞总数；细胞的具体计数按照以下公式：
式中：
E为样品中活性乳杆菌细胞数，个/mL；S1为载玻片面积，mm；S2为显微镜油镜视野面积，mm；V为样品稀释倍数；X为10个视野内平均细胞数，个。
本实施例的保加利亚乳杆菌ND02平板计数结果与荧光显微镜计数结果列于附图7；图中●为荧光显微镜计数结果，■为平板计数结果。这些结果清楚表明，保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中4℃诱导过程中，经平板计数法检测的可培养活菌数一直呈下降趋势，并在诱导的第190天时降为零。此时结合荧光显微镜观察发现，视野内存在一定数量的绿色活菌细胞，表明此时保加利亚乳杆菌ND02已经进入了VBNC态，且VBNC态细胞的数量及其维持时间适宜于进一步VBNC态复苏的研究。
实施例5：保加利亚乳杆菌ND02VBNC态的诱导
该实施例的实施步骤如下：
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的保加利亚乳杆菌ND02接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养19小时，传代培养三代，得到活化保加利亚乳杆菌ND02，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离6min，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤3次，所述的菌泥在每次洗涤后需要在转速10000r/min下离心分离3min，然后按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：6，将洗涤菌泥重悬于灭菌生理盐水中，制成保加利亚乳杆菌菌悬液；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的保加利亚乳杆菌ND02菌悬液接入到pH值2.5的液体LB(LysogenyBroth)诱导液体中，使保加利亚乳杆菌ND02终浓度约106CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后使诱导液中乳杆菌在4℃下进行VBNC态诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，按照每隔5天的时间采用MRS琼脂培养基倾注培养，采用平板菌落计数法检测诱导过程中保加利亚乳杆菌ND02的可培养活菌数，后期需根据结果调整取样检测时间。
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，使用德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速11000r/min下离心分离4min，收集菌泥，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：5，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤3次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将由Thermo Fisher公司销售的荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
F.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL悬浮液，然后往该悬浮液中加入步骤E配制的0.6倍体积的荧光染料SYTO-9溶液和0.4倍体积的PI溶液，接着混匀，轻甩混合液至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜采用蓝色滤光块I3，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；观察结果与附图6列出结果基本一致。
G.荧光显微镜计数
荧光显微镜计数结果与实施例4基本一致。
本实施例的保加利亚乳杆菌ND02平板计数结果与荧光显微镜计数结果与附图5列出结果基本一致。这些结果清楚表明，保加利亚乳杆菌ND02在pH值2.5的液体LB中4℃诱导的第35d进入VBNC态，通过荧光显微镜观察发现，视野内存在一定数量的绿色活菌细胞，保加利亚乳杆菌ND02维持该状态10天后直接进入死亡态。
实施例6：保加利亚乳杆菌ND02VBNC态的诱导
该实施例的实施步骤如下：
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的保加利亚乳杆菌ND02接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养2318小时，传代培养三代，得到活化保加利亚乳杆菌ND02，使用由德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离9min，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：4，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，所述的菌泥在每次洗涤后需要在转速10000r/min下离心分离3min，然后按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：6，将洗涤菌泥重悬于灭菌生理盐水中，制成保加利亚乳杆菌菌悬液；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的保加利亚乳杆菌ND02菌悬液接入到不同pH值模拟人工胃液诱导液体中，使保加利亚乳杆菌ND02终浓度约106CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后对诱导液中乳杆菌在4℃温度下进行VBNC态诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，按照每隔5d的时间用MRS琼脂培养基倾注培养，采用平板菌落计数法检测有的过程中保加利亚乳杆菌ND02的可培养活菌数。
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，使用由德国Eppendorf公司以商品名Centrifuge 5810R销售的离心机，在转速10000r/min下离心分离5min，收集菌泥，按照以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：4，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将由Thermo Fisher公司销售的荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜(DMSO)中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
F.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL悬浮液，然后往该悬浮液中加入步骤E配制的0.6倍体积的荧光染料SYTO-9溶液和0.4倍体积的PI溶液，接着混匀，轻甩混合液至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜采用蓝色滤光块I3，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；观察结果与附图6列出结果基本一致。
G.荧光显微镜计数
荧光显微镜计数与实施例4相同。
本实施例的保加利亚乳杆菌ND02平板计数结果与荧光显微镜计数结果与附图5的结果基本一致。这些结果清楚表明，保加利亚乳杆菌在不同pH值的模拟人工胃液中4℃诱导时，在短时间内可以进入VBNC态，但通过荧光显微镜观察发现，视野内只存在少量的绿色活菌细胞，且保加利亚乳杆菌ND02仅能维持该VBNC态3～5天后便直接进入了死亡态。

Claims (7)

1.一种乳杆菌VBNC态的诱导方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A.乳杆菌的活化
将冷冻保存的乳杆菌接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养，传代培养三代，得到活化乳杆菌，离心分离，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，然后重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；所述的乳杆菌是干酪乳杆菌Zhang；该乳杆菌的活化是在温度37℃下活化培养18～24小时；
B.乳杆菌VBNC态的诱导
将步骤A得到的乳杆菌菌悬液接入到灭菌生理盐水诱导液体中，使乳杆菌终浓度106～107CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后在4℃的温度下对诱导液中乳杆菌进行VBNC态诱导；
C.乳杆菌VBNC态的检测
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养，检测诱导过程中乳杆菌的可培养活菌数；
D.荧光显微镜检测样品处理
步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，离心收集菌泥，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；
E.荧光染料溶液配制
将荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；
F.乳杆菌荧光样品制备
步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL或50μL悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤E配制的荧光染料SYTO-9与PI溶液，立即将菌液与荧光染料混匀后甩至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；
吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；
G.荧光显微镜计数
在荧光显微镜计数时，随机选择至少10个不同的视野，且每个视野内的荧光细胞数在30～300个之间，最后取平均值；在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活性细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死菌细胞；细胞的具体计数按照以下公式：
式中：
E为样品中乳杆菌活性细胞数，个/mL；S1为盖玻片面积，mm；S2为显微镜油镜视野面积，mm；V为样品稀释倍数；X为10个视野内平均细胞数，个。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A中，收集活化乳杆菌菌泥是在转速10000r/min下离心分离5～10min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤C中，MRS琼脂培养基倾注平板在温度37℃的条件下恒温静置培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A和D中，在用灭菌生理盐水洗涤菌泥时，以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3～5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤F中，向乳杆菌悬浮液中加入0.6倍体积的荧光染料SYTO-9与0.4倍体积的荧光染料PI。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤F中，所述的抗荧光淬灭封片剂是选自碧云天公司的P0126抗荧光淬灭封片剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于干酪乳杆菌Zhang在灭菌生理盐水中在温度4℃的诱导条件下第80天进入VBNC态；所述乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，并保持完整细胞结构。
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