CN112210517B - 干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导以及VBNC态细胞脂肪酸的检测方法 - Google Patents

干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导以及VBNC态细胞脂肪酸的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法以及VBNC态细胞膜脂肪酸的检测方法，属于微生物培养技术领域，所述诱导方法包括以下步骤：将所述干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中活化后接种到MRS诱导液中于3.5～4.5℃进行VBNC态的诱导，至平板菌落计数法计活细胞数为0，并且荧光显微镜法计活细胞数大于0，获得干酪乳杆菌Zhang的VBNC态。所述方法成功获得VBNC态细胞，丰富了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态诱导的诱导液种类。本发明还提供了提取干酪乳杆菌Zhang正常态、VBNC态的膜脂肪酸组分和含量的差异分析结果。

Description

干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导以及VBNC态细胞脂肪酸的 检测方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，尤其涉及干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法以及VBNC态细胞脂肪酸的检测方法。
背景技术
“益生菌”是指经口服足够数量后会改善宿主肠道微生物的平衡，进而对宿主健康产生有益影响的活的微生物。乳酸菌是益生菌中最具代表性的菌属。乳酸菌和益生菌不是一个概念，乳酸菌是指革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性、能利用可发酵碳水化合物产生50％以上乳酸的一类细菌总称。乳酸菌种类繁多，目前已发现乳酸菌包括43个属，373个种和亚种，而且每年都有新乳酸菌种属被分离和发现(https://lpsn.dsmz.de/domain/ bacteria。不是所有的乳酸菌都可以称为益生菌，或用做益生菌及其产品。筛选益生菌菌株、开发益生菌产品并使其商品化是国内外乳酸菌研究和科研成果转化的一大热点。
干酪乳杆菌Zhang(Lb.casei Zhang)(CGMCC No.1697)是从采集自内蒙古地区锡林郭勒盟自然发酵酸马奶样品中分离的、具有自主知识产权的、并经实验证明的具有益生特性的乳酸菌菌种(Zhang WY等，Journal of Bacteriology,2010,192(19):5268-5269)，该益生菌和我实验室研发的我国其他具有自主知识产权的菌株复合，推出了“益生和美”系列益生乳酸菌发酵剂和制剂产品，已应用于内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司和旗帜婴儿乳品股份有限公司、黑龙江完达山哈尔滨乳品有限公司、云南欧亚乳业有限公司等企业进行推广应用，并开发了益生乳酸菌饮料、中老年奶粉、酸奶、益生乳酸菌酸奶系列产品，产生了显著的经济效益。
益生乳酸菌被人体摄入后只有保持较高活性才能有效发挥其保健益生作用。研究表明益生菌进入消化系统后活菌含量必须达到1×106CFU/mL以上才能发挥其健康功效，因此要求新鲜益生菌乳制品中活菌数量不得低于1×107CFU/mL，只有这样才能补偿益生菌通过人体胃肠道时活菌数的损失。因此，益生乳酸菌发酵剂或其产品在制备、贮运和应用过程中能够保持高的细胞活力十分重要。
然而乳酸菌在生产和应用过程中不可避免的要耐受各种环境压力，诸如极端的温度、酸、高温、低温、冷、渗透压、氧和饥饿等，一旦受到外界环境压力或营养条件的剧烈改变，就会发生一些变化，导致活力下降，死亡率增加。上世纪80年代初期，徐怀恕等提出有些细菌在不良环境条件下会进入活的非可培养态(Viable but non-culturable,VBNC)。VBNC态是细菌在不良的环境条件下，用常规的平板培养方法无法使菌落生长繁殖，但细菌仍具有代谢活性的一种状态。VBNC态细菌一旦处于适宜的培养条件，仍能继续生长繁殖。有些致病菌仍然具有毒力。这一概念在微生物领域一提出就受到了极大的关注。
目前已经报道了42个属82种细菌存在VBNC态，其中大部分为革兰氏阴性致病菌，对革兰氏阳性菌的研究并不多见。乳酸菌属于革兰氏阳性菌，仅有少数乳酸菌被报道存在VBNC，研究益生菌的VBNC态的报道少之又少。细菌VBNC态的特性就是“活的”与“不可培养”，所以只有当细菌可培养活菌数为零，而“活细胞”数不为零时才可判断其进入了VBNC态。所以认为部分细菌通常有“活的可培养”、“活的非可培养”和死菌三种状态，有效活菌数应该指前二种。细菌的可培养活菌数可以根据常规平板计数法就能确定，而“活细胞”的确定就需要依靠各种非培养方法来检测细胞活性。检测VBNC态细菌的非可培养方法有活菌直接计数法、核酸染料检测法、基于DNA或者基于mRNA的分子生物学法、呼吸检测法、免疫学法、流式细胞仪检测法等。现有的益生菌干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法单一、能诱导成功的诱导液种类少，研究其细胞膜变化机理的未见报道。
另外，在微生物的细胞结构中，细胞膜是控制细胞进行物质交换的屏障，也是细胞承受外界环境压力的首个感知位点。细胞膜在细胞的生命活动(物质运输、代谢及维持正常的渗透压)中具有重要的作用细胞膜中含有丰富的脂肪酸。细胞的质膜结构是一个动态平衡体系。为维持个体正常生理功能，膜流动性与细胞膜的脂肪酸的种类和组成会发生改变，比如脂肪酸链的长度、结构、饱和度等，细胞膜的流动性受外界环境和细胞自身调控的影响。低温下的微生物会调节细胞膜中脂肪酸组成来适应低温环境，比如提高膜脂肪链中双键的数目，增加短链、分支和环状脂肪酸的含量等。采用增加不饱和脂肪酸含量增强流动性来抵抗低温等对其影响。
不同细菌细胞膜中含有不同的脂肪酸含量和构成比例，这也是一类或者一种特定微生物的特征属性。细菌在受到来自有机溶剂的刺激时，细菌在细胞膜脂肪酸水平上可能的调节反应有：调节细胞膜中饱和脂肪酸和不饱脂肪酸的比例和调节细胞膜中不饱和脂肪酸的顺-反异构化。细胞通过改变细胞膜流动性来应对压力，从而应对环境压力减少细胞受到的损伤，实现维持活性的自我保护。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以液体MRS为诱导液的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法以及VBNC态细胞膜脂肪酸的检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法，所述干酪乳杆菌Zhang保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1697，包括以下步骤：
1)将所述干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中活化获得活化的菌种；
3)将步骤1)中获得的菌悬液按体积比1.5～2.5％的接种量接种到诱导液中于3.5～4.5℃进行VBNC态的诱导，至平板菌落计数法计活细胞数为0，并且荧光显微镜法计活细胞数大于0，获得干酪乳杆菌Zhang的VBNC态；
所述诱导液为液体MRS培养基。
优选的，步骤2)中诱导的温度为4℃。
优选的，步骤2)中诱导的时间为160～210d。
优选的，步骤1)中所述活化的代数为2～3代，每一代活化的时间为18～24h。
优选的，步骤2)中所述接种后，诱导液中干酪乳杆菌Zhang的菌浓度为(1～10)×106CFU/mL。
本发明提供了所述诱导方法获得的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞脂肪酸的检测方法，包括以下步骤：A)取干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞的菌泥分别与甲醇-氯仿溶液混合、振荡10～20min，再加氯仿和超纯水，使得体系中氯仿、甲醇和水的体积比为2：2：1，震荡10～20min，离心收集氯仿层；所述甲醇-氯仿溶液中甲醇和氯仿的体积比为2:1；
B)采用EYELA MG-2200氮吹仪吹收集到的氯仿层25～30min获得浓缩脂肪酸，所用的惰性气体氮气的纯度为99.999％，氮吹仪的加热铝块恒温槽的温度为35～45℃；
C)将浓缩的脂肪酸加1mol/L甲醇钠-甲醇进行甲酯化获得脂肪酸甲酯；
D)用正己烷萃取脂肪酸甲酯；
E)取上层，采用有机过滤器过滤后获得干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞膜脂肪酸甲酯化的待测样品；
用气相色谱检测所述待测样品，检测条件：HP-88毛细管填充柱，规格60m×0.25mmi.d×0.25μm film；载气：氮气，纯度为99.999％；进样口温度：260℃；柱温升温程序：初始温度80℃，保持1min，随后以6.5℃/min速率增至170℃，以2.75℃/min速率增至215℃，并保持2min，以40℃/min速率增至230℃，并保持2min；氢气流量35mL/min、空气流量350mL/min、氮气流量35mL/min；检测器为氢火焰离子检测器，检测器温度260℃；进样量1μL，分流比1:5。
优选的，所述干酪乳杆菌Zhang的正常态或VBNC态细胞的菌泥与甲醇-氯仿溶液的混合比例为0.5g:1.9mL。
本发明的有益效果：本发明提供的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法，以液体MRS培养基为诱导液，在3.5～4.5℃低温诱导成功获得所述干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞，丰富了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导的诱导液种类，第一次在液体MRS培养基中代谢物积累胁迫下和低酸低温的条件下诱导出了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态，操作简单，同时也说明干酪乳杆菌Zhang的抗逆能力强。
生物保藏信息说明
干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间2006年4月21，保藏编号为CGMCC No.1697。
附图说明
图1为干酪乳杆菌Zhang正常态的脂肪酸检测结果；
图2为干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的脂肪酸检测结果；
图3为Lb.casei Zhang正常态和VBNC态的细胞膜脂肪酸成分中饱和与不饱和脂肪酸的百分含量结果。
具体实施方式
本发明提供了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法，所述干酪乳杆菌Zhang保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1697，包括以下步骤：1)将所述干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中活化获得活化的菌种；2)用生理盐水洗涤步骤1)中获得的活化的菌种后，用生理盐水重悬获得菌悬液；3)将步骤2)中获得的菌悬液接种到诱导液中于3.5～4.5℃进行VBNC态的诱导，至平板菌落计数法计活细胞数为0，并且荧光显微镜法计活细胞数大于0，获得干酪乳杆菌Zhang的VBNC态；所述诱导液为液体MRS培养基。
本发明将所述干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中活化获得活化的菌种。在本发明中，所述干酪乳杆菌Zhang优选为真空冷冻干燥保藏的干酪乳杆菌Zhang菌种，所述干酪乳杆菌Zhang是由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室乳酸菌菌种库(LABCC)提供，LABCC编号IMAU10048，同时保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1697。本发明中所述活化的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述活化的代数优选为2～3代，更优选为3代，每一代活化的时间优选为18～24h，更有选为20～22h。本发明中所述活化培养2代后优选的进行扩大培养至生长对数期获得活化的菌种。
本发明获得所述活化的菌种后，用生理盐水洗涤所述活化的菌种后，用生理盐水重悬获得菌悬液。在本发明中，在用生理盐水洗涤所述活化的菌种前，优选的对所述获得的活化的菌种进行离心，收集菌泥；所述离心的转速优选为3500～4500rpm，更优选为4000rpm；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。
本发明在获得所述菌悬液后，将所述菌悬液接种到诱导液中于3.5～4.5℃进行VBNC态的诱导。在本发明中，所述诱导液为液体MRS培养基；所述液体MRS培养基以1L计，包括以下组分:大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸钠2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.054g和余量的蒸馏水，pH值为6.0～6.8。本发明中，所述诱导的温度优选为3.8～4.2℃，更优选为4℃。本发明中，所述接种后，诱导液中干酪乳杆菌Zhang的菌浓度优选为(1～10)×106CFU/mL，最优选为1.0×106CFU/mL。本发明中所述诱导的时间以出现VBNC态细胞为准，至平板菌落计数法计活细胞数为0，并且荧光显微镜法计活细胞数大于0，获得干酪乳杆菌Zhang的VBNC态；优选为160～210d，更优选为170～190d。本发明对所述平板菌落计数法没有特殊限定，采用本领域常规的平板菌落计数法即可。本发明中，所述荧光显微镜法计活细胞数的染料优选为SYTO-9和PI。所述SYTO-9和PI均为荧光核酸染料；所述SYTO-9和PI与Leica DM4000B正置荧光生物显微镜结合能够区分死活菌，可以检测细菌活性。STYO-9是一种能穿透完整细胞膜的小分子，能对所有的细胞进行染色，而PI(propidium iodide)一种只能进入质膜结构破坏的细胞内染色的大分子，并会在一定程度上减弱STYO-9的染色能力。本发明中，细胞染色后在荧光显微镜下观察，有完整质膜结构的细胞呈绿色荧光，为活细胞，细胞膜结构被损坏的细胞呈红色荧光，为死细胞。
在本发明具体实施过程中，从菌悬液接种到诱导液中开始，每隔一段时间取样用平板菌落计数法进行菌落计数，同时进行所述荧光显微镜法计活细胞数。在本发明具体实施过程中，优选的在0h，6h，12h，24h，3天，7天，1-5个月每月一次，随后菌落数少时缩短检测时间，每周测一次。本发明中，优选的将所述取样获得的样品进行十倍梯度稀释后倾注MRS琼脂培养基进行平板菌落计数，计数结果用CFU/mL表示。本发明中，所述荧光显微镜法计活细胞数优选的将取样获得的样品进行稀释、经SYTO-9和PI避光染色后，在暗室中使用Leica正置荧光生物显微镜(DM 4000B)在激发波长480nm与发射波长635nm下观察计数。随机选择不少于10个视野进行计数，且保证每个视野内的总细胞数在30～300个之间，取平均值后按下式进行细胞数的计算(个/mL)：
式中：E为样品中细胞数(个/mL)；S1为所用盖玻片面积(mm2)；S2为显微镜油镜视野面积(mm2)；V为样品稀释倍数；X为10个视野内的平均细胞数(个)。
在本发明所述诱导过程中，如果平板菌落计数的结果为0，并且荧光显微镜法计活细胞数大于0时获得所述干酪乳杆菌Zhang的VBNC态。本发明为了提高检测的准确性，每次取样，所述平板菌落计数的次数优选为连续检测2～4次，若计数结果均为0，则认为细菌的可培养活菌数为0。
本发明提供了所述诱导方法获得的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞脂肪酸的检测方法，包括以下步骤：
A)干酪乳杆菌Zhang培养的正常三代对数末期的菌液和诱导液离心收集菌泥0.5克，加入1.9mL甲醇：氯仿(2:1，v/v)，室温振荡15min，加0.63mL氯仿以及0.63mL超纯水，室温振荡15min，离心(5000g，10min)，取下层氯仿相，B)采用氮吹仪(EYELA MG-2200)调温至40℃用纯氮气(纯度为99.999％)吹，约25分钟-30分钟获得浓缩脂肪酸。C)再加入1mL甲醇钠-甲醇(将甲醇钠溶解于甲醇中，甲醇钠的浓度为1mol/L)，放冰中1min，振摇5min进行甲酯化；D)用0.6mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，振摇5min，离心(5000g，5min)，取上层过滤后进行气相分析。
本发明中，取培养三代的干酪乳杆菌Zhang的正常态和诱导的VBNC态细胞，离心收集菌泥，然后洗涤菌泥；所述离心的转速优选为3500～4500rpm，更优选为4000rpm；所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。所述洗涤用的洗涤液优选为生理盐水，所述洗涤的次数优选为1次。
本发明将所述洗涤后的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞与甲醇钠-甲醇溶液混合进行脂肪酸的皂化获得皂化脂肪酸料液。本发明中所述甲醇钠-甲醇溶液优选的将甲醇钠溶解在甲醇中制备获得，本发明中，所述洗涤后的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞与甲醇钠-甲醇溶液的质量体积比优选为450～550mg:1.9mL，更优选为480～520mg:1.9mL，最优选为500mg:1.9mL；。
本发明中，所述浓缩优选为氮吹浓缩，所述氮吹仪的加热铝块恒温槽的温度优选为35～45℃，更优选为40℃；所述浓缩的时间优选为25～35min，更优选为30min。本发明中所述氮吹浓缩的仪器优选为氮吹仪EYELA-MG2200。
本发明在所述浓缩干燥后，用有机溶剂复溶所述浓缩的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞脂肪酸甲酯化待测样品，用气相色谱检测所述待测样品。本发明中所述有机溶剂优选为正己烷。本发明中所述气相色谱仪优选为气相色谱仪6850型，美国Agilent公司；色谱柱是定制的Agilent公司毛细管填充柱，填充物为(88％-氰丙基)芳基-聚硅氧烷，规格60m×0.25mm i.d×0.25μm film；所述检测条件：载气：氮气；进样口温度：260℃；柱温升温程序：初始温度80℃，保持1min，随后以6.5℃/min速率增至170℃，以2.75℃/min速率增至215℃，并保持2min，以40℃/min速率增至230℃，并保持2min；氢气流量35mL/min、空气流量350mL/min、氮气流量35mL/min；检测器为氢火焰离子检测器，检测器温度260℃；进样量1μL，分流比1:5。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.Lb.casei Zhang的活化
将真空冷冻干燥保藏的干酪乳杆菌Zhang(Lb.casei Zhang，CGMCC No.1697)接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养18-24h，连续传代3代后进行扩大培养至对数期末期，得到活化乳杆菌。所述的乳杆菌是干酪乳杆菌Zhang(Lb.casei Zhang)，该乳杆菌的活化是在温度37℃下活化培养18～24h。
注：益生菌Lb.casei Zhang是由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室乳酸菌菌种库(LABCC)提供，LABCC编号IMAU10048。
同时也保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)，保藏号为CGMCC No.1697。
2.诱导条件
将活化好的Lb.casei Zhang于4000rpm×5min离心获得菌泥，用灭菌生理盐水洗涤菌泥2～3次，然后重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；将Lb.casei Zhang菌悬液接到灭菌的诱导液液体MRS培养基中，并调整诱导液乳酸菌终浓度为106CFU/mL，静置于4℃低温诱导，在0h，6h，12h，24h，3天，7天，1-5个月每月一次，随后菌落数少时缩短检测时间，每周测一次。不同时间点取每个诱导条件的样本做下面试验。
对乳酸菌活性进行检测：检测Lb.casei Zhang是否进入VBNC态时，采用了传统的平板倾注计数法和荧光显微镜法(染料SYTO-9和PI)二种方法的结果做比较，检测菌株是否进入VBNC态。
具体检测方法如下：
首先采用传统的平板倾注计数法对诱导过程中的Lb.casei Zhang进行可培养活细胞数检测。取0.5mL充分混匀的Lb.casei Zhang诱导液，采用十倍梯度稀释法稀释至适当浓度，取1mL稀释液倾注MRS琼脂培养基后于37℃下恒温静置培养48h，进行平板上Lb.caseiZhang特征菌落计数，每个样每次做三个平行，结果用CFU/mL表示。
同时采用荧光显微镜法(染料SYTO-9和PI)计活性细胞数。这两种荧光核酸染料SYTO-9和PI与Leica DM4000B正置荧光生物显微镜结合能够区分死活菌，通常可以检测细菌活性。此方法中涉及的染料属于核酸染料，STYO-9能对所有的细胞进行染色，而PI(propidium iodide)只能进入质膜结构破坏的细胞内染色，并会在一定程度上减弱STYO-9的染色能力。细胞染色后在荧光显微镜下观察，有完整质膜结构的细胞呈绿色荧光，细胞膜结构被损坏的细胞呈红色荧光。
实验过程：取充分混匀后的Lb.casei Zhang诱导液稀释至适宜浓度，经SYTO-9和PI两种核酸染料室温避光染色后，在暗室中使用Leica正置荧光生物显微镜(DM4000B)在激发波长480nm与发射波长635nm下观察计数。随机选择不少于10个视野进行计数，且保证每个视野内的总细胞数在30～300个之间，取平均值后按下式进行细胞数的计算(个/mL)：
式中：E为样品中细胞数(个/mL)；S1为所用盖玻片面积(mm2)；S2为显微镜油镜视野面积(mm2)；V为样品稀释倍数；X为10个视野内的平均细胞数(个)。
当平板上无Lb.casei Zhang的特征菌落生长时(即可培养活细胞数<1CFU/mL)，仍要连续检测3次，如果依旧无特征菌落生长，则认为此时Lb.casei Zhang的可培养活细胞数为零，若荧光显微镜下仍能够观察到绿色细胞，表明此时Lb.casei Zhang已经进入了非可培养的VBNC态。
结果
Lb.casei Zhang在液体MRS培养基中4℃培养188d获得VBNC态。
实施例2
1.对Lb.casei Zhang的细胞膜脂肪酸进行提取
获乳酸菌菌泥：定期取实施例1中诱导液的菌(正常态、VBNC态过程中，VBNC态细菌)，4000rpm离心5min后生理盐水洗1次，称量约0.5g菌于10mL无菌、有螺旋盖的离心管中。
脂肪酸提取：取干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞的菌泥0.5g与1.9mL甲醇：氯仿(2:1)混合，室温振荡15min，加0.63mL氯仿以及0.63mL超纯水，使得氯仿和甲醇1：1，再震荡15min，充分破壁后离心，使氯仿层包含所有的脂质，而甲醇层不包含脂质，纯化的脂质提取物通过分离得到氯仿层。
B)取下层氯仿相，采用日本东京理化公司EYELA MG-2200氮吹仪吹约25min-30min获得浓缩脂肪酸，所用的惰性气体纯氮气纯度为99.999％。
C)将浓缩的提取液加1mol/L甲醇钠-甲醇1mL进行甲酯化。因为脂肪酸是一种极性很强的物质，并且其挥发性和稳定性较低，通常在进样分析前需要进行脂肪酸甲酯化。
D)用0.6mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，取上清。
E)采用有机过滤器过滤后获得干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞膜脂肪酸甲酯化的待测样品，转至气相小瓶。
F)用气相色谱检测所述待测样品：
采用气相色谱仪(6850型，美国Agilent公司)对提取的脂肪酸样品进行检测，检测条件：色谱柱为定制Agilent公司毛细填充管，填充物为(88％-氰丙基)芳基-聚硅氧烷，规格60m×0.25mm i.d×0.25μm film；载气：氮气(纯度为99.999％)；进样口温度：260℃；柱温升温程序：初始温度80℃，保持1min，随后以6.5℃/min速率增至170℃，以2.75℃/min速率增至215℃，并保持2min，以40℃/min速率增至230℃，并保持2min；氢气流量35mL/min、空气流量350mL/min、氮气流量35mL/min；检测器为氢火焰离子检测器，检测器温度260℃；进样量1μL，分流比1:5。
结果
Lb.casei Zhang细菌细胞膜脂肪酸的组成分析
细菌面对不利于自身生长的环境时，会调节细胞膜的构成来维持细胞膜流动性，合适的细胞膜流动性能够保证细胞活动的正常进行。试验采用气相色谱法对Lb.caseiZhang诱导前期的细菌细胞膜脂肪酸进行检测。试验用37种脂肪酸甲酯标准品(CRM47885)定标，选择实际测量结果中脂肪酸甲酯的保留时间与标准品中脂肪酸甲酯保留时间差值小于0.1min的确认为是同一种脂肪酸甲酯，脂肪酸的出峰顺序是实际测量的出峰顺序。需要说明一点，由于气相测定成分为脂肪酸甲酯，所以计算Lb.casei Zhang正常态和VBNC态细胞膜中各组分脂肪酸含量时，要将气相测得脂肪酸甲酯峰面积乘以脂肪酸甲酯转换成为脂肪酸的系数Fi(表1)后才是膜中各组分脂肪酸峰面积。检测出的Lb.casei Zhang脂肪酸的种类见表1。
表1 Lb.casei Zhang的脂肪酸种类
注：Fi是脂肪酸甲酯转换成脂肪酸的系数。
表1中反应的是通过GC法检测出Lb.casei Zhang细胞膜中的几种主要脂肪酸，分别是肉豆蔻酸(C14:0)，棕榈酸(C16:0)，棕榈油酸(C16:1)，油酸(C18:1n9c)，亚油酸(C18:2)，花生酸(C20:0)。其中脂肪酸的出峰顺序与其碳链长度有关，碳链短的比碳链长的脂肪酸更早被检出(C14:0、C16:0和C20:0)；饱和脂肪酸比不饱和脂肪酸更早被检出(C16:0和C16:1)。细菌在进入新的环境后要对环境有适应的过程，在这个过程中细菌对细胞膜流动性进行调节来维持细胞正常的物质交换。
试验对MRS中4℃诱导的Lb.casei Zhang在诱导24h内的细胞膜脂肪酸进行了检测，并对诱导过程中不同时间点的细菌样品进行采集并提取脂肪酸，对细菌进入诱导液前期的细胞膜脂肪酸的变化和诱导过程中细胞膜脂肪酸的变化进行分析。
Lb.casei Zhang诱导24h内细胞膜脂肪酸变化结果
对MRS中4℃诱导条件下诱导的Lb.casei Zhang在24h内收集不同时间的细菌进行脂肪酸的提取，并通过GC对细胞膜脂肪酸进行检测，检测结果见表2。
表2 Lb.casei Zhang 24h内脂肪酸变化
注：字母abc不一样表示同一种脂肪酸在不同时间点内差异显著
(p<0.05)
从表2可知，Lb.casei Zhang在液体MRS中4℃诱导的最初24h内，共检测出了6种脂肪酸，其中肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)以及亚油酸(C18:2)在24h内的变化均不显著(p>0.05)，如棕榈酸(C16:0)的在4个时间点的相对百分含量分别为(22.38±0.58)％、(22.08±0.09)％、(22.32±0.06)％、(22.11±0.29)％；油酸(C18:1n9c)的相对百分比在6h内变化不显著，在6-12h内发生了显著的降低(p<0.05)，从6h的(17.38±0.02)％降为了(16.89±0.24)％，并在24h内维持稳定；花生酸(C20:0)的相对百分含量有明显的波动，在6h内变化不显著，在12h内显著降低(p<0.05)，从6h的(22.32±0.36)％降为了(21.64±0.03)％，之后在24h内增加为(22.16±0.20)％，此外从表中还可以看出，24h内Lb.casei Zhang的UFA的相对百分含量没有发生明显的变化。
Lb.casei Zhang正常态细胞膜脂肪酸的组成分析的气相峰图结果见附图1，Lb.casei Zhang VBNC态的细胞膜脂肪酸的组成分析的气相峰图结果见附图2。分析Lb.casei Zhang正常态和VBNC态的细胞膜的脂肪酸成分，计算饱和与不饱和脂肪酸的百分含量结果见附图3。从附图3中可以看出，Lb.casei Zhang的VBNC态的不饱和脂肪酸相对百分含量高于正常态的不饱和脂肪酸(P<0.05)，其饱和脂肪酸低于正常态的饱和脂肪酸含量，这表明了Lb.casei Zhang在诱导VBNC态过程中不饱和脂肪酸的增加与饱和脂肪酸的减少在一定程度上调节了细胞膜的流动性，使细胞在逆境状态下能够保持细胞膜的完整性，从而更好地适应不利于Lb.casei Zhang生长的环境，以保持活性更长时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）Zhang的VBNC态的诱导方法，所述干酪乳杆菌Zhang保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1697，其特征在于，由以下步骤组成：
1)将所述干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中活化获得活化的菌种；所述活化的代数为3代，每一代活化的时间为18～24h；所述活化的温度为37℃；
2)将步骤1)中获得的活化的菌种按体积比1.5～2.5％的接种量接种到诱导液中于4℃进行VBNC态的诱导，至平板菌落计数法计活细胞数为0，并且荧光显微镜法计活细胞数大于0，获得干酪乳杆菌Zhang的VBNC态；所述诱导前，将活化好的菌种于4000rpm×5min离心获得菌泥，用灭菌生理盐水洗涤菌泥2～3次，然后重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；
所述步骤2)中诱导的时间为188d；
所述诱导液为液体MRS培养基；所述液体MRS培养基的pH值为6.0～6.8；
所述步骤2)所述接种后，诱导液中干酪乳杆菌Zhang的菌浓度为106CFU/mL；
干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞脂肪酸同时含有肉豆蔻酸、棕棡酸、棕棡油酸、油酸、亚油酸和花生酸组成。
2.权利要求1所述诱导方法获得的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞脂肪酸的检测方法，由以下步骤组成：
A)离心收集干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞的菌泥，分别与甲醇-氯仿溶液混合、振荡10～20min，再加氯仿和超纯水，使得体系中氯仿、甲醇和水的体积比为2：2：1，震荡10～20min，5000g离心10min，取下层氯仿层；所述甲醇-氯仿溶液中甲醇和氯仿的体积比为2：1；
B)采用EYELA MG-2200氮吹仪吹收集到的氯仿层25～30min获得浓缩脂肪酸，所用的惰性气体氮气的纯度为99.999％，氮吹仪的加热铝块恒温槽的温度为35～45℃；
C)将浓缩的脂肪酸加1mol/L甲醇钠-甲醇进行甲酯化获得脂肪酸甲酯；
D)用正己烷萃取脂肪酸甲酯；
E)取上层，采用有机过滤器过滤后获得干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞膜脂肪酸甲酯化的待测样品；
F)用气相色谱检测所述待测样品，检测条件：定制Agilent公司毛细管色谱柱HP88，填充物为(88％-氰丙基)芳基-聚硅氧烷，规格60m×0.25mm i.d×0.25μm film；载气：氮气，纯度为99.999％；
进样口温度：260℃；柱温升温程序：初始温度80℃，保持1min，随后以6.5℃/min速率增至170℃，以2.75℃/min速率增至215℃，并保持2min，以40℃/min速率增至230℃，并保持2min；氢气流量35mL/min、空气流量350mL/min、氮气流量35mL/min；检测器为氢火焰离子检测器(FID)，检测器温度260℃；进样量1μL，分流比1:5。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述干酪乳杆菌Zhang的正常态或VBNC态细胞的菌泥与甲醇-氯仿溶液的混合比例为0.5g:1.9mL。
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