CN110507672A - 一种高效微生态调整剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效微生态调整剂，属于生物制剂领域，主要由至少一种处于活的非可培养态的细菌，并添加其他辅助成分构成，所述处于活的非可培养态的细菌为不产芽孢的细菌，每克所述的高效微生态调整剂含有处于活的非可培养态的细菌数量为10³~10¹²个。该微生态调整剂可以作为制备治疗疾病的药物的应用，或作为制备防护目标部位微生态环境失衡的护理用品的应用。本发明提供的微生态调整剂，作用于目标区域更加高效，均匀，安全,在高效调整菌群的同时，对微生态中的真菌、病毒、原虫也可以有效调整，且避免了非原籍菌异位定植的风险。本发明使微生态制剂可选用的菌株范围也更广，具有广阔的应用前景。

Description

一种高效微生态调整剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体是指一种高效微生态调整剂及其应用。

背景技术

动物的体内和体外分布着数量巨大的微生物，这些微生物寄生在动物的各个器官，如皮肤、口腔、呼吸道、胃肠道、阴道、眼睛、外生殖器、前尿道、肛门等，这些微生物相互制约，相互协调，形成了一个动态平衡的微生态系统。当该微生态系统失衡时，会导致各种疾病。调整微生态系统能够防治这些疾病，由此，微生态调整剂应运而生。

微生态调整剂已经在动物(含人类)胃肠道疾病防治中获得了广泛的应用。如肠道菌群失衡时易导致腹泻。口服可培养的益生菌有助于平衡肠道菌群及恢复正常的肠道pH值，缓解腹泻症状。但是微生物调整剂在口服以外的应用(统称外用)一直未得到普及。主要原因如下：①现有的外用微生态调整剂一般采用内服微生态制剂相同的技术方案：通过选取至少一种大数量的可培养态肠道益生菌，直接作用于缺少细菌营养和接触空气的部位。厌氧的肠道益生菌，在使用过程中(涂覆后2-24小时)，会很快不均匀地失活、崩解；②动物肠道的微生态与其他部位的微生态存在较大差异，很多肠道益生菌菌株在其他部位并不是常驻菌(原籍菌)，这些“益生菌”菌株在上述其他作用部位超过一定数量后，对宿主的微生态反而有一定害处；③现有的微生态调整剂外用(非口服)时，不会像胃肠道里一样发生菌体较大范围的被迫交换和移动。由于可培养细菌存活率的极端不平均性，必然会导致不同作用位置微生态调整效果的巨大差异，这种不均匀的微生态调整容易带来宿主的不适和有害的条件反射；④现有的微生态调整剂外用时，可培养细菌初始数量越多，区域性不均匀越厉害，而引起宿主的不适也越强。因此，实际工作中现有的外用(非内服)微生态调整剂菌体含量不得不低于10³个/克，这反过来导致现有的外用微生态调整剂的实际功效普遍较低；⑤现有外用微生态调整剂选用的肠道“益生菌”并非很多(肠道以外)作用部位的原籍菌，这些可培养菌株如果发生异位定植，会带来该部位微生态永久不正常的未知风险。

可培养的益生菌具有更完整的结构，能定植占位和营养竞争，能代谢多种物质抑制有害病菌。采用可培养的益生菌调整微生态，传统理论上可以保持最强的微生态调整功效。这种技术方案一直以来是口服微生态调整剂的共识及(非口服)外用微生态调整剂的首选。

然而，可培养态的细菌，因为其菌体较大降低了其与免疫细胞接触的几率，提高了其被移动至免疫细胞(及附近)的难度。因此，无论是口服，还是外用，可培养态的菌通过影响宿主溶菌酶和抗菌肽的抗菌活性来对宿主微生态进行调节的作用就比较微弱。再考虑到现有的商业益生菌保活率不可靠、冻干包埋会进一步增大体积且影响菌体表面的事实，可培养活菌制备的现有口服微生态调整剂及外用微生态调整剂，功效和可靠性都还存在极大的提升空间。

鉴于上述原因，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够通过口服或外用直接作用于宿主的消化道、皮肤、口腔、呼吸道、阴道、眼表面、指甲、毛发、肛门、耳道、直肠、牙齿进行微生态调节，对宿主的微生态调整作用更强、更为均匀，不易产生异位定植风险，且更安全的微生态调整剂。

本发明申请文件中所指的“外用”概念都是指所有“口服以外的作用方式”，包括涂覆、雾化、灌洗、含漱、栓塞、点滴等。这是微生态制剂领域的习惯划分，并非仅仅是“用于身体外表”的字面意思。

本发明还有一个目的在于提供上述微生态调整剂的具体应用。

本发明通过下述技术方案实现：一种高效微生态调整剂，包括至少一种处于活的非可培养态的细菌，所述处于活的非可培养态的细菌为不产芽孢的细菌，每克所述的高效微生态调整剂含有处于活的非可培养态的细菌数量为10³～10¹²个。

活的可培养益生菌具有更完整的细胞结构，能定植占位和营养竞争，也能代谢多种物质抑制有害病菌。采用数量尽量多的可培养肠道益生菌，传统理论上可以保持最强且最安全的微生态调整功效。这种技术方案一直以来是口服微生态调整剂的共识，也是外用(非口服)微生态调整剂的首选。

活的非可培养态(VBNC，Viable But Non-Culturable)的细菌指的是某些不产芽孢的细菌在不良环境条件下，细胞会发生生理上和形态上的变化，用常规培养方法不能使其繁殖，但仍具有代谢活性的状态。

活的非可培养态的细菌，是不产芽孢细菌的一个特殊形态。与活的可培养细菌相比，具有更少的DNA和RNA，更小的体积，更低的代谢水平和营养需求。这就意味着，与活的可培养态细菌相比，同等数量下活的非可培养态的细菌产生的微生态调整功效(按照传统的微生态调整机制)比可培养态的活菌要低很多。尽管活的非可培养态的细菌也可以通过特定的条件复苏，变为活的可培养状态。但是这与冻干可培养细菌简单的活化复壮相比，总成本更高，制约条件更加苛刻。因此，活的非可培养态的细菌与死菌一样，目前不被所有的口服和外用微生态调整剂厂商考虑。

但是，发明人在研制呼吸道微生态调制剂和皮肤微生态调制剂的漫长过程中，却惊讶的发现了完全相反的事实：不仅活的非可培养态的细菌用于制备外用微生态调整剂时，实际功效比可培养的活菌更高。即使是传统的口服微生态调整剂，活的非可培养态的细菌产生的微生态调整功效常常也高于可培养的活菌。发明人已用多个试验证实：非培养态的活菌通过与免疫细胞更有效率的作用，更大地提高了作用部位溶菌酶和/或抗菌肽的抑菌活性。由宿主的溶菌酶和/或抗菌肽反身调整微生态的作用，要比可培养态细菌制备的微生态调整剂显著得多。当然，外用微生态调整剂这种反身调整效应的差异则更加巨大。

目前的实际外用实践中，可培养态的肠道益生菌始终存在均匀保活的困难。当其离开低温和低氧环境时就会逐渐死亡。发明人进一步发现，肠道益生菌在常温大气中的死亡，即便是同一批产品中的细菌也不是均匀地同时发生。在所有的情况下，任何批次的肠道益生菌都只是部分菌体不断失活，而残留部分菌体继续存活。随着时间推移，死亡崩解的细菌越来越多，而存活的细菌越来越少。因此，当这种微生态调整剂投放在胃肠道以外的身体部位时，上述可培养的活菌会在可预见的作用时间内(2-72小时)，变成大量的死菌和极少数生命力特别顽强的可培养活菌，而不均匀地分布在目标作用部位。死亡崩解的细菌调整微生态及其他同步发生的作用都是很低的(死菌的代谢活动为零，拮抗有害菌的能力也聊胜于无)；而活下来的益生菌则会在其所处的位置形成远远强于其他部位的调整功效，甚至开始生长繁殖，完成定植形成生物膜。这对于流动频繁，直接作用时间很短(秒过)的胃肠道，当然不是问题，但是对于几乎没有交流驱动且直接作用时间为2-72小时的其他身体部位，这就意味着持续的细菌聚集和不均匀作用分布。经过一段时间的不均匀作用以后，最终的状况就是：在具有存活下来的益生菌的位置，是一种大大加强的作用效果，而在其他没有残存活菌的区域则是几乎为零的作用效果。

发明人还发现，这种不均匀现象随着外用微生态调整剂中可培养活菌初始含量的增加而更加严重，作用不均匀的反差也更为巨大。不幸的是，非胃肠道的身体表面，比如皮肤，呼吸道，肛门都分布了非常丰富敏锐的触觉神经，这种不均匀的作用势必造成大量的不适，而诱发抓挠、咳嗽、喷嚏等条件反射。尤其是在人的面部，不均匀的作用后果更加让人难堪。基于这种技术问题的存在，外用微生态调整剂中限制可培养细菌的初始菌体含量，以减轻这种作用不均匀的后果就是必然的操作。

发明人将可培养态的活菌诱导成非可培养的活菌时，依据传统理论，同等含量细菌的调整功效会降低7-300倍。但非可培养的活菌在整个作用的范围，都保持了基本一致的代谢水平，而包含DNA和RNA的完整菌体在可预见的作用时间里，也始终数量恒定地均匀分布在作用区域。这就意味着整个目标作用部位，微生态不仅可以得到均匀的直接调整效应，而且溶菌酶和抗菌肽的抑菌活性提高效果的分布也是整体均匀的——宿主的微生态因此也可以得到均匀的间接调整效果。可见，非可培养的活菌在整个作用的区域，调整微生态的总的效果都是均匀的。因此，前述因为可培养态细菌的不均匀调整后果导致的对菌体初始含量的限制显然就不再存在。

通过非可培养态的活菌的大量使用及对可培养态活菌的限制，发明人解决了外用微生态调整剂在目标调整部位作用不均匀的技术问题。这既不会带来神经敏感部位的不适，更不会出现外观不均难看的尴尬。

尽管从(不考虑微生态反身调整机制的)传统理论看来：相同数量的非可培养的活菌相比(刚培养出来的)可培养的活菌，调整微生态的功效要小7-300倍。但是，区域作用不均匀的危险实际上限制了可培养活菌初始含量不宜超过10³个/克。而非可培养的活菌，因为不受此限制，却能将菌体初始含量增加到10¹²个/克以内的任意值。即便按照传统的微生态调整理论计算，菌体含量大了千倍以上的非可培养态的活菌，外用调整微生态的实际功效也远远强于现有的可培养活菌制剂。

本发明提供的技术方案，由于不用担心异位定植的风险，微生态调整剂所用菌株的选择也可以更加广泛。除了作为肠道益生菌的乳酸菌外，菌株还可以选择非乳酸菌的、各作用部位的原籍菌，尤其是数量需要控制在一定范围的条件致病菌作为微生态调整剂的作用菌株。

对于皮肤等特殊部位，普遍具有微生态中某些菌存在数量即不能太多，也不能太少的要求，这就需要更加精确的微生态调整。这是现有可培养菌微生态调整剂不可实现的技术要求，而非可培养态的微生态调整剂则可轻松实现。

基于上述发明人的研究发现，本发明的微生态调整剂主要通过非可培养态细菌提高宿主溶菌酶和/或抗菌肽的抑菌活性后，反身影响微生态(抑制有害菌、病毒、原虫，增殖有益菌)的机制，将其作为调节微生态的制剂来使用。

对微生态进行调整的细菌调整微生态环境的具体机制主要包括：

(a)通过受体占位、营养竞争抑制致病菌和条件致病菌的粘附定植和生长繁殖；

(b)产生有机酸、细菌素、H₂O₂、多种酶等代谢物，抑制致病菌和条件致病菌，并降解有害物质；

(c)作用于宿主的免疫细胞，调整宿主分泌的溶菌酶或/和抗菌肽的抑菌活性，反过来间接(反身)调整作用部位微生态环境。

最后一种调整机制，是传统微生态调整理论所忽略的。但发明人惊讶地发现，这种机制所产生的调整功效远比想象的强。甚至足以导致非培养态的活菌总体的调整功效强于可培养的活菌。而且这种机制的作用靶点为宿主自身分泌的溶菌酶和抗菌肽，因此，安全性和改善微生态的整体性(包括对真菌、病毒、原虫的抑制)也远远好于前两种机制。

其中，能够对目标部位微生态进行调整的细菌的选择资料能够从现有的文献或常规实验手段获得，这里不作为本技术方案核心技术要点，因此未对如何获得细菌的技术手段做过多说明，另外，将细菌制备成活的非可培养态的细菌的方法包括物理诱导法、化学诱导法、生物诱导法中的至少一种方法或者两者或两者以上结合使用的方法，这些方法均为能够通过普通手段可以获得的公知技术，因此如何将可培养态细菌制备成活的非可培养态的细菌的详细过程，这里不再过多赘述。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述微生态调整剂通过外用直接作用于目标部位，上述目标部位包括皮肤、口腔、呼吸道、阴道、眼表面、指甲、毛发、肛门、耳道、直肠、牙齿，且所述微生态调整剂中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。

为了更好地实现本发明，进一步地，还包括其他辅助成分，所述其他辅助成分包括以下成分中的一种或几种混合：油脂、水、营养素、盐、pH调节剂、植物提取物、微生物培养物、药学上可接受的辅料。由于能够对微生态进行调整的细菌种类繁多，因此，其他辅助成分会随着所用活的非可培养态的细菌及功效配合需求的不同，而发生相应改变。这里将可能使用到的主要辅助成分中的部分作为优选，其他能够配合活的非可培养态的细菌使用的辅助成分也可以选取。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述处于活的非可培养态的细菌为目标作用部位常驻菌的一种或多种。目标部位微生态失衡，一般都是目标部位常驻菌发生失衡所导致的，因此，可以从目标部位的常驻菌中选取一种或多种，将其制备成活的非可培养态的细菌，进行目标部位微生态环境的调整。当然，其他能够对目标部位微生态进行调整的细菌，而非目标部位的常驻菌，也不排除可以制备成活的非可培养态的细菌，结合辅助成分，将其作为目标部位的微生态调整剂来使用。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述处于活的非可培养态的细菌为乳酸菌中的一种或多种组合。乳酸菌主要作为调节肠道微生态环境的益生菌来使用，将其制备成活的非可培养态的细菌后，因为其菌体缩小增大了其与免疫细胞接触的几率，降低了其被移动至免疫细胞及其附近的难度。非可培养态的乳酸菌通过作用于宿主的免疫细胞，可以使宿主的作用部位(不排除作用部位以外的其他部位)分泌的溶菌酶或/和抗菌肽的抑菌活性更高，使溶菌酶或/和抗菌肽发挥更大作用，更具效率地改善宿主消化道及其他作用部位的微生态环境。当然，其他非乳酸菌的细菌，也可以制备成活的非可培养态的细菌，结合辅助成分，将其作为肠道的高效微生态调整剂来使用。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述处于活的非可培养态的细菌为宿主的条件致病菌或致病菌。作用于目标调整部位或其他免疫细胞分布较多的部位。条件致病菌和致病菌一般是对人体有一定危害或风险的细菌，将其制备成活的非可培养态的细菌后，其危害和风险都将大大降低，就可以直接作用于宿主。这时，条件致病菌和致病菌的一些特异性的信息被宿主的免疫系统捕捉后还会另外产生特异性免疫反应。因此，即可作为微生态调整剂也可同时作为一种疫苗来使用。

本发明还公开了上述一种高效微生态调整剂的具体应用，包括作为制备治疗疾病的药物的应用，或作为制备防止微生态失衡的护理用品的应用。

为了更好地实现本发明的应用方法，进一步地，所述使用高效微生态调整剂制备成的药物和防止微生态失衡的护理用品作用的部位为皮肤或口腔或呼吸道或阴道或眼表面或指甲或毛发或肛门或耳道或直肠或牙齿。

为了更好地实现本发明的应用方法，进一步地，所述药物的剂型包括粉剂、水悬剂、膏剂、栓剂、喷雾剂、涂膜剂，所述护理用品包括护肤霜、牙膏、漱口水、清洗液、沐浴液、洗发水、饮料。

本发明还提供了一种用于皮肤的护理用品，，该护理用品的剂型为油剂或膏剂，

当该护理用品的剂型为油剂，其主要成分为：按重量份计，主要由权利要求1～6任一项所述的高效微生态调整剂0.001～20份，油脂80～99.999份、表面活性剂0.01～10份组成；

当该护理用品的剂型为膏剂，其主要成分为：按重量份计，主要由权利要求1～6任一项所述的高效微生态调整剂0.001～20份，油脂10～30份、表面活性剂0.1～20份、水60～80份组成。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

本发明的高效微生态调整剂，是通过非可培养态的细菌提高宿主的溶菌酶和/或抗菌肽的抑菌活性来调整微生态。由于宿主抗菌肽优秀的天然抑菌能力，本发明无论是作为口服还是外用的微生态调整剂，都比现有的微生态调整剂功效更强。且因为抗菌肽能够广泛抑制的微生物种类还包括病毒、真菌、原虫，因此，本发明的高效微生态调整剂对微生态的调整更全面。另外，因为非可培养态的活菌，并不会在宿主器官表面繁殖，对有益菌的增殖也是通过抗菌肽来实现，不同来源的菌株产生的基因迁移风险可降到更低，因此，本发明的高效微生态制剂更加安全、可控，而且没有异位定植的风险。非培养态的活菌还具有恶劣环境下更好的保活能力，因此，本发明的高效微生态调整剂即可制作为菌悬液也可制作为干粉，都更稳定。储运成本更低，更适合工业化大规模生产。

本发明的高效微生态调整剂应用于制备治疗疾病的药物和制备防止微生态失衡的护理用品，可以通过激发宿主本身的抗菌肽和溶解酶的微生物抑制活性，更全面的抑制各种致病菌、病毒、真菌、原虫。这种治疗和防护对使用者微生态的改善更加全面。另外，鉴于宿主抗菌肽极强的天然抑菌能力，这种治疗疾病和纠正微生态失衡也更加强效。由于避免了异位定植的风险，本发明的高效微生态调整剂应用于疾病治疗和防护时，选用菌株的范围得到了显著的扩大。尤其是外用时，因为无需顾忌菌株的不均匀作用，治疗和防护的功效比现有的技术，更加强效和可靠得多。

本发明的用于皮肤的护理用品，在整个作用区域均匀恒定。因此，不会导致使用者皮肤的不适，也不会带来皮肤外观的难看。本发明的皮肤的护理用品是通过皮肤抗菌肽来调控皮肤的微生态。出于宿主的调控不仅天然、高效，而且总是安全有益的。这对于目前皮肤微生态细节尚未研究透彻的现状，无疑是更加稳妥的技术方案。活的非可培养态细菌能耐受的温度更高且更加容易保存，降低了本发明用于皮肤的护理用品的生产难度，便于大规模的工业化生产，也大大便利了储运，延长了货架期。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

为使本发明的目的、工艺条件及优点作用更加清楚明白，结合以下实施实例，对本发明作进一步详细说明，此处所描述的具体实施实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

本实施例提供一种高效微生态调整剂，包括至少一种处于活的非可培养态的细菌，所述处于活的非可培养态的细菌为不产芽孢的细菌，每克所述的高效微生态调整剂含有处于活的非可培养态的细菌数量为10³～10¹²个/克。

所述处于活的非可培养态的细菌为乳酸菌中的一种或多种组合。优选为瑞士乳杆菌，含量优选为10⁷个/克。

本实施例提供的微生态调整剂直接作用于皮肤，所述微生态调整剂中可培养态细菌的含量低于10³个/克。

该微生态调整剂的制备过程如下：

1.1选取瑞士乳杆菌菌株(Lactobacillus helvencus，ATCC15009)进行培养；其中，培养条件：37℃，接种量为5％，厌氧培养；培养基：10％脱脂乳，0.1％乳糖，1.0％酵母膏，10％麦芽汁1.0g，100mL柠檬酸三钠；培养时间：10h左右；

1.2培养结束后，4500rpm离心10min，收取可培养态瑞士乳杆菌菌泥；

1.3将上述瑞士乳杆菌菌泥与灭菌生理盐水，按照质量计，以1：4混合，将收集的菌泥洗涤后，4500rpm离心10min，反复两次；将最后得到的瑞士乳杆菌菌泥与灭菌生理盐水，按照质量计，以1：6混合，将洗涤后的瑞士乳杆菌重悬于灭菌生理盐水中，制成瑞士乳杆菌菌悬液；

1.4将上述瑞士乳杆菌菌悬液接入到液体MRS诱导液体中，将菌体含量调整到10⁷CFU/ml，混匀，置于4℃的厌氧环境中进行诱导；

1.5每5天摇匀诱导液，取样，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中活的可培养态瑞士乳杆菌进行准确计数；

1.6当可培养态的细菌含量低于10³CFU/ml时，4500rpm离心10min，收取瑞士乳杆菌菌泥；

1.7将1.6收取的可培养态瑞士乳杆菌菌泥，按照质量计，以1：1.6加入海藻糖溶液保护剂，冷冻干燥；

1.8采用MRS琼脂培养基倾注培养法对冻干菌粉中的可培养态瑞士乳杆菌进行准确计数。并将上述冻干菌粉取样，加入生理盐水制作成菌悬液后，再加入0.6倍体积的荧光染料SYT0-9和0.4倍体积的PI溶液，混匀。在室温且避光条件下进行染色反应15分钟；吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光粉淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室使用正置荧光显微镜，采用蓝色滤光块，在激发波长450-490nm与发射波长515nm下观察，对观察到的绿色荧光细胞计数为非培养态的细菌。通过上述检测，确保所述冻干菌粉中活的非培养态的瑞士乳杆菌含量在10⁸个/克以上，最优为10¹¹个/克，另外，活的可培养态的瑞士乳杆菌含量比活的非培养态的菌体少一万倍以上。

1.9将凡士林加热到70℃融化后，停止加热，等凡士林温度降到55.3℃时，将非可培养态诱导瑞士乳杆菌的冻干菌粉加入到适量凡士林中，分散均匀，冷却凝固，制成成品，使成品中非可培养态瑞士乳杆菌含量为10⁷个/克。可培养态的瑞士乳杆菌含量低于10³个/克。

实施例2：

益生菌作用于宿主，在调整宿主微生态的同时还会形成一些同步的功效。通过这些同步的功效可以近似量度其微生态调整的功效。实施例1的高效微生态调整剂作用于皮肤时，调整皮肤微生态的同时也会同步影响皮肤丙二醛(MDA)含量变化。本实施例通过对紫外线伤害后皮肤丙二醛(MDA)含量的变化来推导和量度其对皮肤微生态的调整功效。

本实施例提供实施例1的高效微生态调整剂对紫外线照射小鼠皮肤丙二醛(MDA)含量的影响实验：

2.1实验分组：

将12只体重20g左右的SKH-1无毛小鼠随机分成4组，每组3只，具体组别如下：

M组：模型组，使用双蒸水干预，作为空白对照组；

C3组：使用活的可培养态的细菌含量10³个/克的微生态调整剂干预；

C7组：使用活的可培养态的细菌含量10⁷个/克的微生态调整剂干预；

VBNC7组：使用实施例1制备得到的高效微生态调整剂干预。

2.2C3组和C7组中微生态调整剂的制备：

2.2.1选取瑞士乳杆菌菌株(Lactobacillus helvencus，ATCC15009)进行培养；其中，培养条件：37℃，接种量为5％，厌氧培养；培养基：10％脱脂乳，0.1％乳糖，1.0％酵母膏，10％麦芽汁1.0g，100mL柠檬酸三钠；培养时间：10h左右；

2.2.2培养结束后，4500rpm离心10min，收取瑞士乳杆菌菌泥；

2.2.3将步骤2.2.2中收取的活的瑞士乳杆菌，不进行诱导，按质量份计，以1：1.6加入海藻糖溶液保护剂，冷冻干燥，获得活的可培养态的瑞士乳杆菌冻干菌粉；

2.2.4采用MRS琼脂培养基倾注培养法对冻干菌粉的可培养态瑞士乳杆菌进行准确计数，获取冻干菌粉中活的可培养态瑞士乳杆菌的含量，通常在10⁸个/克～10¹³个/克，最优为10¹¹个/克；

2.2.5将凡士林加热到70℃融化，停止加热，等凡士林温度降到55.3℃时，将步骤2.2.3所述冻干菌粉加入到适量凡士林中，使成品的可培养态瑞士乳杆菌含量为10³个/克，得到活的可培养态的细菌含量10³个/克的微生态调整剂(C3组用)；

2.2.6将凡士林加热到70℃融化后，停止加热，等凡士林温度降到55.3℃时，将步骤2.2.3所述冻干菌粉加入到适量凡士林中，使成品的可培养态瑞士乳杆菌含量为10⁷个/克，得到活的可培养态的细菌含量10⁷个/克的微生态调整剂(C7组用)。

2.3实验过程：

2.3.1给予所有小鼠320nm紫外线照射，紫外线灯管距小鼠约25cm，UVB(320nm)每次照射剂量1J/cm²·d，共1周，累积剂量14J/cm²。照射前使用紫外线辐照度监视计检测紫外线光疗仪辐照强度，确保照射剂量精确；

2.2.2每天2次，使用双蒸水涂抹M组的所有小鼠背部皮肤；使用步骤2.2.5中得到可培养态的细菌含量10³个/克的微生态调整剂涂抹所有C3小鼠背部皮肤；使用步骤2.2.6中得到可培养态的细菌含量10⁷个/克的微生态调整剂涂抹所有C7组小鼠背部皮肤；使用实施例1制备得到的高效微生态调整剂涂抹VBNC7组的所有小鼠背部皮肤；

2.3.3小鼠被320nm紫外线照射14天后，观察M组的小鼠。小鼠背部皮肤明显松弛、干燥脱屑，皮肤粗糙，呈现一种光老化的表现。确定造模成功，将全部小鼠断颈处死。立即取下背部2.5x3.5cm的全层皮肤(不含皮下脂肪)。将每只小鼠的上述皮肤用预冷生理盐水(4℃)，除尽杂质，拭干。再将每只小鼠的皮肤块切分为大小均匀的9小块；

2.3.4将每组的每只小鼠的皮肤小块，分别放入有2ml预冷生理盐水的小试管内，用匀浆机10000rpm匀浆两次，每次10秒。匀浆完成后以3500rpm离心15min。取上清液采用硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量。

取每只小鼠不同小块皮肤MDA含量中的最大值和最小值，求各组的最大MDA含量平均值与最小MDA含量平均值。

2.4实验结果如表一所示：

表一 紫外线照射小鼠皮肤丙二醛(MDA)含量位置差异(nmol/mgprot)

*与M组比较p<0.05

2.5实验结论：

根据表一内容可知，外用益生菌微生态调整剂对紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化具有保护作用。但是，高含量活的可培养态的细菌微生态调整剂，在不同的位置极其不均匀，功效相差很大。事实上，高含量的可培养态益生菌，仅仅在少数局部产生作用。这种状况如果出现在人体面部，将是灾难性的。

低含量(菌体含量10³个/克)活的可培养态的细菌微生态调整剂，在不同的位置功效相差不大，但是作用较低，几乎不呈显功效。

高含量活的非培养态的细菌制备的微生态调整剂，对紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化具有均匀明显的保护作用，而且在九个作用区域都是基本均匀的。

益生菌对皮肤的保护作用是与其对微生态的调整是同步实现的，由此可见，非可培养态的益生菌对皮肤微生态的调整作用均匀而显著，而高含量的可培养态益生菌对皮肤微生态的调整作用不均匀，低含量的可培养态益生菌对皮肤微生态的调整作用则不显著。

实施例3：

本实施例提供实施例1所述高效微生态调整剂治疗日晒伤的疗效对比实验：

3.1实验分组：

选取164例患者,符合日晒伤临床诊断标准。将患者随机分为三组：M对照组54例，男15例，女39例。VBNC7治疗组56例，男19例，女37例。C3治疗组54例，男17例，女37例。(鉴于实例例2中C7组使用的活的可培养细菌数风险过高，因此不列入对照实验)三组患者的性别、年龄、病程和疾病严重程度等均具有可比性。

排除：此前已有其他治疗者；晒伤处有大面积溃破水泡；半年内发生过变应性皮炎患者；妊娠或哺乳期妇女；有严重心、肝、肾或严重的系统性疾病者；晒伤部位患有其他皮肤病。

具体组别如下：

M组：模型组，使用凡士林干预，作为空白对照组；

C3治疗组：使用2.2.5得到的活的可培养态的细菌含量10³个/克的微生态调整剂干预；

VBNC7组：使用上述实施例1制备得到的高效微生态调整剂干预。

3.2实验过程：

3.2.1M对照组的患者，每天涂抹3次白凡士林；C3治疗组每天涂抹3次活的可培养态的细菌含量10³个/克的微生态调整剂。VBNC7治疗组每天涂抹三次活的非可培养态的细菌含量10⁷个/克的微生态调整剂。5天后观察疗效；

3..2.2根据皮损主要症状(烧灼感及疼痛程度)和体征(红斑、肿胀、干燥、脱屑)，临床按4级评分法进行评分，0分＝无，1分轻度，2分＝中度，3分＝重度；

疗效指数＝(治疗前总分一治疗后总分)/治疗前总分×100％。痊愈：疗效指数>90％；显效：疗效指数60％～9O％；好转：疗效指数20％～59％；无效：疗效指数<20％；

有效率＝(痊愈例数+显效例数)/总例数×100％；

3.3实验结果：

三组患者疗效评价见表二：

表二 三组日晒伤疗效比较(例，％)

3.4实验结论：

三组患者于治疗5天后进行疗效评价。VBNC7治疗组总有效率为98.21％。M对照组总有效率为68.51％。C3治疗组总有效率为74.07％。VBNC7治疗组在疗效上明显优于对照组和C3治疗组，有明显的优越性。可推断，实施例1所述高效微生态调整剂，调整微生态的功效也具有明显的优越性。

实施例4：

本实施例提供实施例1中所述的高效微生态调整剂对提高皮肤抗菌肽抑菌活性的对比试验。

4.1实验原因：

几乎所有动物身体的内外界面，都可以分泌抗菌肽抑制有害菌，限制条件致病菌。上述抗菌肽的抗菌活性会因为各种原因不断变动。

东北林蛙皮肤分泌物粗提物RP-HPLC肽谱显示，东北林蛙皮肤分泌物RP-HPLC分离获得26个洗脱峰。洗脱峰对应的多肽均具有较强的广谱抗菌活性。这说明东北林蛙存在较多种类的抗菌肽。进一步的研究显示，东北林蛙皮肤在较大量细菌的作用下，洗脱峰会发生变化。这又说明施加在皮肤的细菌，超过一定量时可以作用于皮肤免疫细胞，影响皮肤抗菌肽的分泌及活性发生变化，从而反过来间接调整皮肤的微生态。这种调整是由宿主自身形成的，而不仅仅是施加的细菌本身的代谢物与其定植拮抗形成，因此，对微生态的这种调整是整体性的、自发性的，理应更加安全，高效。

4.2实验分组：

取2～3龄，体重(19.01±0.63)g的健康雄性东北林蛙60只,分别用蒸馏水冲洗后置于冰浴托盘中。温和多点电刺激(6V，30s)蛙背部皮肤，以排空腺体中的分泌物。然后将上述东北林蛙分为三组，具体组别如下：

M组：每天涂刷凡士林两次，作为对照组；

C7组：每天涂刷两次2.2.6中得到的活的可培养态细菌制备含菌体量10⁷个/克的微生态调整剂；

VBNC组：每天涂刷两次实施例1制备得到的高效微生态调整剂。

4.3实验过程：

4.3.1三组林蛙饲养于曝气后的水环境(条件：室温16℃、容器底面直径30cm，水面高约10cm，5只/容器)中；

4.3.2于第3天，采用温和电刺激(6V，30s)蛙背部皮肤，分别用10mL0.5％乙酸溶液收集每只蛙的皮肤分泌物；冷冻干燥；

4.3.3每组取2mg皮肤分泌物冻干粉溶解于1mL去离子水中，采用纸片扩散法(纸片直径0.5cm)测定各组皮肤分泌物对大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)的抑菌活性，实验数据均以(平均值±标准差)表示，组间比较采用SPSS18.0软件统计分析。

4.4实验结果如表三所示：

表三 林蛙皮肤分泌物抗菌肽抑菌活性对比(抑菌环直径cm)

4.5实验结论：

根据表三内容可知，实施例1提供的高效微生态调整剂，提高皮肤分泌的抗菌肽的抑菌活性显著优于使用同等含量可培养态细菌的微生态调整剂。鉴于抗菌肽对细菌，真菌，原虫、病毒的广谱杀灭能力，非可培养态乳杆菌间接调整微生态的能力显著存在，而且显著强于可培养态的乳杆菌。

实施例5：

本实施例提供实施例1所述的高效微生态调整剂治疗效果比较实验。

5.1实验分组：

选取烂皮病发病早期的东北林蛙69只。筛选标准：皮肤局部充血，发炎，体表有1处溃疡。排除标准：溃疡处露出骨头，停止取食。将上述东北林蛙随机分为三组，每组23只，具体组别如下：

M组：模型组，每天涂抹5次凡士林，作为空白对照组；

C7组：每天涂抹5次2.2.6中得到的可培养态的细菌含量10⁷个/克的微生态调整剂干预；

VBNC7组：每天涂抹5次实施例1制备得到的高效微生态调整剂干预。

5.2实验过程：

将三组林蛙饲养于曝气后的水环境(条件:室温16℃、容器底面直径30cm，水面高约10cm，5只/容器)中。4天后，观察林蛙的表皮状况判断微生态调整效果：充血，发炎消失、溃疡平复为显效；充血，发炎减退、溃疡数量未增加为有效；充血，发炎未消退，溃疡数量增加，死亡则均为无效。

5.3实验结果：

结果如表四所示：

表四 林蛙皮肤微生态调整效果比较(％)

5.4实验结论：

由表四可知，实施例1提供的高效微生态调整剂调整皮肤微生态的治疗效果显著大于对照组，也显著大于C7组。活地非可培养态的细菌调整皮肤微生态的总的效果比同等数量可培养态的细菌强很多。

实施例6：

本实施例提供一种直接作用于皮肤的护理用品，剂型为油剂，按重量份计，主要由实施例提供的微生态调整剂0.001～20份，油脂80～99.999份、表面活性剂0.01～10份组成；

具体包括基础油、主要成分为活的非可培养态的乳杆菌的微生态调整剂、植物提取物、营养素、皮肤脂质；其中，基础油为凡士林，皮肤脂质为胆固醇、神经酰胺、脂肪酸中的至少一种，微生态调整剂为含量为10⁷个/克的活的非可培养态的瑞士乳杆菌。

将微生态调整剂(活的非可培养态的瑞士乳杆菌菌粉)1份，黄芪提取物5份，APG2000表面活性剂5份，维生素E 2份，胆固醇2份，神经酰胺2份，橄榄油30份，凡士林953份，在55℃混合均匀，即可得到本实施例提供的皮肤的护理用品。这种益生菌护肤油，可以调整皮肤的微生态，还可以修复皮肤屏障，克服了现有的益生菌护肤品难以保存，难以生产，功效还极低的技术问题，为第三次皮肤护理革命(修复皮肤屏障为靶点)提供了有效的工具。

实施例7：

本实施例提供另一种直接作用于皮肤的微生态调整剂，具体包括水、增稠剂、活的非可培养态的细菌。

处于活的非可培养态的细菌为目标作用部位常驻菌的一种或多种。优选为皮肤的常驻菌-表皮葡萄球菌，其中，活的非可培养态的表皮葡萄球菌菌体含量为7x10³个/克，增稠剂为1％的羟丙基甲基纤维素。

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是定居于人体皮肤的一种常驻菌。作为皮肤菌群的一种重要构成菌，可影响皮肤的免疫应答，其在皮肤的数量过少可引起菌群失衡，导致皮肤疾病的发生。与此同时，表皮葡萄球菌如果在皮肤太多又会形成生物被膜样的结构参与致病。因此，提供给皮肤以表皮葡萄球菌，而不使其形成生物膜才是一个安全的皮肤治疗和护理手段。

该微生态调整剂的制备过程如下：

7.1标准株表皮葡萄球菌ATCC35984转种到血琼脂平板(BAP)上，选择BAP上分离的单个菌落接种于刚果红培养基，经37℃、150r/min培养24h，离心机12000r/min，离心5分钟收集表皮葡萄球菌可培养态菌体；

7.2在0.015mmol/LCu2+溶液中，将表皮葡萄球菌的浓度调整到10⁷CFU/ml，诱导4d以上；

7.3采样，在营养肉汤培养基平板上培养，当未出现菌落，确认表皮葡萄球菌已全部进入活的非可培养态(VBNC)，再离心机12000r/min，离心5分钟收集活的非培养态的表皮葡萄球活菌菌体；

7.4将非培养态的表皮葡萄球菌菌体分散在去离子水中，使其菌体含量为7x10³个/克。加入增稠剂使菌悬液浓稠。增稠剂可选用1％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)。

实施例8：

本实施例提供实施例6中所述直接作用于皮肤的护理用品关于兔皮霉菌病治疗效果的对比试验：

8.1实验分组：

新西兰獭兔，2.5～24月龄，体重1.5～3.0kg，确认感染皮霉菌病，随机分为2组，每组16只，具体组别如下：

空白对照组：每天3次涂抹含1％羟丙基甲基纤维素的去离子水；

治疗组：每天3次涂抹实施例6中所制备的直接作用于皮肤的护理用品。

8.2实验过程：

第7，14，21天用小刀刮取病健交界处的皮屑，取少量，置载玻片上，镜检。并接种于萨氏培养基，凡查不到病原霉菌者判为阴性。

8.3实验结果：

具体结果如表五所示：

表五 微生态调整剂治疗后兔真菌转阴率(％)

8.4实验结论：

由表五可知，涂抹实施例6制备的用于皮肤的护理用品三周后，能够有效抑制有害真菌感染，且未见表皮葡萄球菌本身形成定植生物膜，治疗效果显著。

实施例9：

本实施例提供实施例6所述的直接作用于皮肤的护理用品对治疗犬白色念珠球菌的对比实验，具体如下：

9.1实验分组：

宠物医院就诊的患犬52只，体重在3kg～15kg之间。表现为皮肤发红、水肿，有白色凝块状或块状膜样附着。刮取患处的皮肤屑在显微镜下可见明显黄色奶油状菌落，确定患有白色念珠菌皮肤病者作为试验用动物。随机分为2组，每组26只，两组动物每2天都洗浴一次。具体组别如下：

空白对照组：每天8次涂抹含1％羟丙基甲基纤维素的去离子水；

治疗组：每天8次涂抹实施例6所述用于皮肤的护理用品。

9.2实验过程：

第7，14，21天对所有患犬进行体检并刮取患处的皮肤屑镜检。被毛较为平顺整洁，皮肤红点大面积减少，皮肤上的糜烂与浅溃疡已明显好转，刮取病犬身上的结痂皮屑镜检，显微镜视野下看不到白色念珠菌的黄白色奶油状菌落，视为痊愈。

9.3实验结果如表六所示：

表六 治疗后犬皮肤病治愈率(％)

9.4实验结论：

由表六内容可知，对照组的患犬仅少数犬痊愈，其中还有犬只迅速复发。使用实施例6所述皮肤的护理用品治疗的患犬则大部分都痊愈，而且没有复发出现，由此可知，实施例6制备得到的皮肤的护理用品对犬白色念珠球菌皮肤病具有较好的疗效。

实施例10：

本实施例提供另一种直接作用于皮肤的护理用品，其剂型为膏剂，该护理用品通过外用直接作用于皮肤，且其中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。可以用于皮肤护理及皮肤疾病的治疗，也可将其作为面霜来使用，起到调整皮肤微生态，修复皮肤屏障，实现去皱纹，抗衰老，治疗和预防痤疮的生物功效。

该护理用品，其主要成分为：按重量份计，主要由微生态调整剂0.001～20份，油脂10～30份、表面活性剂0.1～20份、水60～80份组成。

进一步，可选的还包括盐0.2份，营养素0.2份，植物提取物0.05份，皮脂成分14份，微生物培养物5.8份，香精0.1份,防腐剂0.2份。其中，油脂为甘油、橄榄油、白油、椰子油、角鲨烷的组合，水为去离子水，营养素为维生素C和维生素E，植物提取物为甘草次酸，盐为氯化钠，低聚糖为低聚果糖，表面活性剂为烷基糖苷，细菌培养液为瑞士乳杆菌耗尽培养液上清，防腐剂为尼泊尔金丙酯、尼泊尔金甲酯，活的非可培养态的细菌为青春双歧杆菌、表皮葡萄球菌、瑞士乳杆菌的组合。

该用于皮肤的护理用品的制备过程如下：

10.1选用模式菌株青春双歧杆菌(ATCC15703)，培养基配方为：蔗糖2％、酪蛋白胨1％、大豆蛋白胨1％、酵母浸膏0.7％、低聚木糖0.3％、磷酸二氢钾0.05％、甘蓝汁8％。37℃厌氧培养16小时。12000r/min，离心5分钟，收取青春双歧杆菌可培养菌体；

10.2将青春双歧杆菌菌体悬浮于液体LB培养基，pH7，置于4℃的低温下厌氧静止培养15天以上，获得活的非可培养态的青春双歧杆菌，12000r/min，离心5分钟，收取青春双歧杆菌活的非可培养态的菌泥；

10.3制备瑞士瑞杆菌活的非可培养态的菌泥，具体制备过程在实施例1中有详细描述，这里不再赘述；

10.4制备表皮葡萄球菌活的非可培养态的菌泥，具体制备过程在实施例7中有详细描述，这里不再赘述；

10.5将步骤10.2中的青春双歧杆菌活的非可培养态的菌泥10000份、步骤10.3中瑞士乳杆菌活的非可培养态的菌泥10000份、步骤10.4中的非可培养态的表皮葡萄球菌的菌泥7份，与甘油30000份混合，研磨搅拌均匀，再加入适量甘油调整菌体含量，使其成为含非可培养态的青春双歧杆菌1x10⁹个/克，含非可培养态的瑞士乳杆菌1x10⁹个/克，含非可培养态的表皮葡萄球菌7x10⁵个/克的菌浆；

10.6将上述菌浆取样，进行细菌培养检验，确保菌浆中活的可培养菌的总数小于1x10⁵CFU/克；

10.7制备油相：分别称取橄榄油8kg、白油8kg、蜂蜡5kg、十八醇2kg、维生素E0.1kg、椰子油2kg、角鲨烷14kg、尼泊尔金丙酯0.1kg混合加热至75℃；

10.8制备水相：分别称取甘油5kg、尼泊尔金甲酯0.1kg、瑞士乳杆菌培养耗尽上清液5.8kg、甘草次酸0.05kg、维生素C 0.1kg、氯化钠0.2kg、低聚果糖0.5kg和去离子水50kg混合后加热至95℃，灭菌20分钟；

10.9在搅拌条件下，将步骤10.7所得的油相缓缓地加入步骤9.8所得水相中，在真空度0.07MPa，转速10000rpm下乳化15分钟，获得油包水乳化体系；

10.10待温度降至45℃，向上述油包水乳化体系中加入步骤10.6中所得的菌浆1kg和日用香精0.1kg，搅拌均匀即可出料，得到本实施例的微生态调整剂。其含活的非可培养态的青春双歧杆菌1x10⁷个/克以上，含活的非可培养态的瑞士乳杆菌1x10⁷个/克以上，含活的非可培养态的表皮葡萄球菌7x10³个/克以上，含活的可培养态的细菌总数1x10³个/克以下。

实施例11：

本实施例提供实施例9所述的护理用品对治疗面部痤疮的干预效果对比实验。

11.1实验分组：

选取111例门诊患者，符合寻常性痤疮诊断及分级标准。其中男48例，女63例；年龄17～36岁，平均20.7±3.51岁；病程1月～10年，平均2.67±1.95年。随机分为两组，治疗组54例，对照组57例。两组性别、年龄随机抽取，均表现为单纯颜面部皮疹，以炎性丘疹和脓疱为主，黑、白头粉刺及囊肿、结节均除外；既往未接受过治疗或已停药1月以上。过敏体质、系统性疾病、妊娠及哺乳期女性、皮损糠秕孢子菌镜检阳性者皆排除。

两组每天均洗脸2次。具体组别如下：

空白对照组：参与者洗完后涂抹凡士林，且每两小时补涂抹一次；

治疗组：参与者洗完后涂抹实施例10提供的微生态调整剂，且每两小时补涂抹一次。

11.2实验过程：

60天后，按下列标准检查干预结果：治愈为皮疹消退90％以上，无新皮疹发生；显效为皮疹消退70～90％，5个以下新皮疹发生；有效为皮疹消退40～69％，10个以下新皮疹发生；无效为皮疹消退在40％以下或不断有新皮疹发生，炎症不能控制。

11.3实验结果：

具体结果如表七所示：

表七 痤疮干预效果比较(例，％)

11.4实验结论：

干预60天后，治疗组与对照组比较，治愈率和有效率都显著大于对照组，差异均有统计学意义。根据实验结果可见，该护理用品能够起到调整皮肤微生态，修复皮肤屏障，治疗痤疮的生物功效。

实施例12：

本实施例提供一种作用于皮肤和/或毛发的高效微生态调整剂，所述的高效微生态调整剂含有处于活的非可培养态的乳酸菌数量为2.5x10⁷个。可培养态的细菌的含量低于10³个/克。所述微生态调整剂还包括其他辅助成分，所述其他辅助成分包括以下成分：油脂1份、水30份、表面活性剂1份、防腐剂0.05份、营养素0.001份、pH调节剂适量、植物提取物0.0008份、微生物培养物7份、药学上可接受的辅料适量。

本实施例也是基于微生态调整剂制备得到的沐浴液/洗发液。其中，油脂为甘油，水为去离子水，营养素为维生素C，植物提取物为黄芪甲甙，pH调节剂为氢氧化钾，益生元为海藻糖，表面活性剂为α-磺基脂肪酸甲酯钠盐，细菌培养液为瑞士乳杆菌耗尽培养液上清，防腐剂为苯氧乙醇，增稠剂为羟甲基纤维素，pH调节剂为乳酸，防腐剂为山梨酸钠，活的非可培养态的细菌为青春双歧杆菌。

该沐浴液的制备过程如下：

12.1制备青春双歧杆菌活的非可培养态的菌泥，具体制备过程在实施例10中有详细描述，这里不再赘述；

12.2将步骤12.1中的青春双歧杆菌活的非可培养态的菌泥与甘油混和搅拌均匀，使其菌体含量为10⁹个/克；

12.3将30份去离子水加热至50℃，加入α-磺基脂肪酸甲酯钠盐1份、氢氧化钾0.0001份、苯氧乙醇0.05份搅拌溶解，并混合均匀；

12.4冷却上述溶液至室温，加入瑞士乳杆菌发酵上清液7份，维生素C0.001份，黄芪甲甙0.0008份，海藻糖0.5份，含菌体的甘油1份，混合均匀后用乳酸将溶液pH值调至6.0，然后加入羟甲基纤维素0.5份，采用均质机均质三次，即获得沐浴液，其中活的非可培养态的细菌含量为2.5x10⁷个/克。

制备得到的沐浴液可以调整皮肤和毛囊的微生态，从而修复皮肤屏障，抑制癣菌。用于沐浴的同时，也可用于洗发和头发护理，减少头皮屑的产生。

实施例13：

本实施例提供一种通过外用(雾化或灌洗)直接作用于呼吸道的微生态调整剂，所述微生态调整剂中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。还包括其他辅助成分，所述其他辅助成分包括以下成分中的一种或几种混合：水、营养素、盐、pH调节剂、植物提取物、微生物培养物、药学上可接受的辅料。

具体的包含表面活性剂、活的非可培养态的细菌以及NaCl，柠檬酸、水。可选的还可以包括抗生素，消毒剂。

活的非可培养态的细菌优选为干酪乳杆菌，菌体含量是1x10⁹个/克，表面活性剂为表面活性素(sunfctin)。表面活性素浓度为14.5mg/L，pH值为6，NaCl浓度为60g/L。

该微生态调整剂的制备过程如下：

13.1选用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，ATCC393)。接种过夜培养的新鲜菌液，接种至MRS培养基，接种量1％，培养温度37℃，培养箱中静置厌氧培养，培养15小时左右，培养结束后，4500rpm离心10min，收集可培养态干酪乳杆菌菌泥；

13.2按照质量份计，将菌泥与灭菌生理盐水按1：6混合，将菌泥重悬于灭菌生理盐水中，制成干酪乳杆菌菌悬液；将所述菌悬液接入到灭菌生理盐水的诱导液体中，使干酪乳杆菌终浓度约10⁷个/克，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中干酪乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活的细菌数，然后对诱导液中乳杆菌在4℃下进行VBNC态的诱导；

13.3诱导20天以上，经平板计数法检测确认活的可培养细菌数低于10个/克后，4500rpm离心10min，收集干酪乳杆菌菌体；

13.4含表面活性素浓度为14.5mg/L的溶液100ml，加入6gNaCl，加入13.3中经诱导的干酪乳杆菌，得到非可培养态活的干酪乳杆菌悬液，并用分光光度仪确定干酪乳杆菌含量为1x10⁹个/g。加入柠檬酸调pH值，用pH仪确定pH值为6从而得到该微生态调整剂。

实施例14：

本实施例提供实施例13中所述微生态调整剂影响宿主呼吸道抗菌肽的抑菌活性的实验：

14.1实验分组：

将78头12±1kg的断奶仔猪随机分为3个组，正常饲喂，具体组别如下：

M组：每天雾化3次生理盐水，空白对照组；

C9组：每天雾化3次含可培养态的细菌10⁹个/克的微生态调整剂；

VBN9组：每天雾化3次实施例13制备的高效微生态调整剂。

14.2C9组中微生态调整剂的制备：

14.2.1制备可培养的干酪乳杆菌菌泥，具体制备过程实施例13中有详细描述，这里不再赘述；

14.2.2含表面活性素浓度为14.5mg/L的溶液100ml，加入6g NaCl，加入上述可培养干酪乳杆菌的菌泥，并用分光光度仪确定干酪乳杆菌含量为1x10⁹个/g，加入柠檬酸，用pH仪确定pH值为6从而得到用于对比的活的可培养菌微生态调整剂。

14.3实验过程：

14.3.1第7天，将所有断奶仔猪处死，并立即取出左侧气管，用灭菌生理盐水冲洗，截取气管中段经组织捣碎机捣碎后按1：l(w/v)比例加入5％乙酸，100度水浴l0min，迅速冷却至4℃后、8000rpm离心30min，取上清超声波裂解30秒，4℃搅拌浸提24h后重复上述离心过程，取上清，调整pH值7.0，再次离心，上清液冷冻干燥。从而获得猪呼吸道分泌物含有抗菌肽的冻干粉；

14.3.2将三组含有仔猪气管抗菌肽的冻干粉，每组取2mg皮肤分泌物冻干粉溶解于1000μL去离子水中，采用纸片扩散法(纸片直径0.5cm)测定各组呼吸道分泌物对大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)的抑菌活性。实验数据均以(平均值±标准差)表示，组间比较采用SPSS18.0软件统计分析。

14.4实验结果：

具体结果如表八所示：

表八 猪呼吸道分泌物抗菌肽抑菌活性对比(抑菌环直径cm)

14.5实验结论：

根据表八的内容可见，实施例13提供的高效微生态调整剂能够显著提高呼吸道分泌的抗菌肽的抑菌活性，提高幅度也显著高于使用同等含量可培养态乳杆菌的微生态调整剂。

实施例15：

本实施例提供一种高效微生态调整剂作为制备治疗疾病的药物的应用，使用微生态调整剂制备成的药物作用的部位为呼吸道。具体的为实施例13所述微生态调整剂用于治疗猪高热综合症的效果实验：

15.1实验所治疗病症说明：

猪高热综合症，是一种发病率和死亡率均较高的疾病，病猪临床主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲不振或废绝，呼吸困难、喘气，部分猪伴有皮肤发红变紫等症状，少数毛孔有出血点。猪病死前会出现肺炎症状。

15.2实验分组：

选猪高热综合症的小猪63只，随机分3组治疗，每组21只，每组均在小猪发高烧1天内，采用头孢，肌肉注射，每KG体重按0.15ml注射1次，换在干净的猪舍正常喂养。

具体组别如下：

对照组1：每天用生理盐水20ml，雾化喷入鼻孔三次；

对照组2：每天用14.2得到的可培养活菌制剂20ml，雾化喷入鼻孔三次；

实验组：每天用实施例13的高效微生态调整剂20ml，雾化喷入鼻孔三次。

15.3对照组2中可培养的活菌制剂的制备，同14.2所述。

15.4实验过程：

7天后，观察高热综合症的小猪进展，发生肺炎的比例。

15.5实验结果如表九所示：

表九 猪高热综合症小猪的肺炎发生率(％)

15.6实验结论：

根据表八的内容可知，使用头孢注射结合实施例13的微生态调整剂雾化治疗的高热综合症小猪，得病小猪的肺炎发生率，显著低于单独使用头孢与头孢结合可培养干酪乳杆菌菌悬液雾化的对照组的肺炎发生率。说明实施例13提供的高效微生态调整剂作用于呼吸道，调整了呼吸道的微生态，有效地阻止了猪高热综合症的进程，这也说明实施例13的高效微生态调整剂可应用于呼吸道相关疾病的防治和辅助治疗。

实施例16：

本实施例提供一种作用于呼吸道或/和口腔的微生态调整剂，具体包括活的非可培养态的致病菌、盐、pH值调整剂、水。

其中，致病菌可源自呼吸道，也可以源自消化道，皮肤，阴道等其他部位及血液、唾液等体液，具体为耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA)，菌体含量是7x10³个/克；盐为NaCl和KH2PO4，pH值调整剂为乳酸，水为去离子水。

该微生态调整剂的制备过程如下：

16.1复苏标准株耐甲氧西林金黄葡萄球菌(ATCC 33951)，划线接种于MH平板，37℃培养18h，挑取单个菌落，接种于MH液体培养基中，37℃在180r/min的摇床上培养6—8h，4500rpm离心10min后弃上清。再以无菌生理盐水洗涤2次，收取菌泥；

16.2将步骤16.1所得的可培养耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌泥，在4℃条件下，以15％NaC1和0.3％乙酸的营养肉汤培养基诱导12天以上；

16.3诱导12天以后，每天取诱导液在添加1.8％的琼脂粉的营养肉汤液体培养基中，用平板计数法测细菌可培养数，直到活的金黄葡萄球菌不再检出，完成其VBNC诱导，4500rpm离心10min，收取耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌体。

16.4以无菌生理盐水，洗涤离心3次，获得活的非可培养态的耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌泥。

16.5将8克NaCl和0.24克KH2PO4溶解在1L去离子水中，搅拌均匀后，加入步骤16.4所获得的菌泥，调整菌体含量到7x10³个/克，加入乳酸，将pH值调整到5.5，获得本实施例的高效微生态调整剂。

实施例17：

本实施例提供实施例16中所述高效微生态调整剂用于耐甲氧西林金黄葡萄球菌的肺部定植实验：

17.1实验分组：

将35只15～20g左右SPF级的BALB/c裸鼠，随机分为3组。具体组如下：

M组：5只小鼠，从小鼠左侧鼻腔分别滴入20μL PBS溶液，空白对照组；

C3组：15只小鼠，从小鼠左侧鼻腔分别滴入20μL活的可培养态的耐甲氧西林金黄葡萄球菌微生态调整剂；

VBNC3组：15只小鼠，从小鼠左侧鼻腔分别滴入20μL实施例16所制的耐甲氧西林金黄葡萄球菌微生态调整剂。

17.2C3组中微生态调整剂的制备：

17.2.1制备可培养态耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌泥，其具体制备过程在实施例16中有详细的描述，这里不再赘述；

17.2.2将8克NaCl和0.24克KH₂PO₄溶解在1L去离子水中，搅拌均匀后，加入步骤17.2.1获得的耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌泥，调整菌体含量到7x10³个/克。加入乳酸，将pH值调整到5.5，获得可培养态的耐甲氧西林金黄葡萄球菌微生态调整剂。

17.3实验过程

17.3.1每组滴入对应的试剂后，保持小鼠直立2min，一周后再次分别对3组小鼠重复进行一次滴鼻接种；

17.3.2第17天处死所有小鼠，无菌条件下取左侧的肺叶匀浆研磨。在TBS培养基上铺板，37℃过夜培养后计数细菌。

17.4实验结果：

结果如表十所示：

表十 小鼠肺脏MRSA计数平均值对比表(个/克)

两次鼻腔接种后，可培养态耐甲氧西林金黄葡萄球菌微生态调整剂在宿主呼吸道产生了耐甲氧西林金黄葡萄球菌的定植，而实施例16提供的采用非可培养活菌的高效微生态调整剂，未在呼吸道形成定植。

实施例18：

本实施例提供实施例16中所述微生态调整剂用于耐甲氧西林金黄葡萄球菌的与微生态调整同步的免疫效果实验：

18.1实验分组：

将45只15～20g左右SPF级的BALB/c裸鼠，随机分为3组，具体组别如下：

M组：于第0、7、14、21天分别在小鼠鼻腔滴注40μLPBS溶液，滴入后保持小鼠直立2min，为空白对照组；

D3组：于第0、7、14、21天分别在小鼠鼻腔滴注40μL灭活耐甲氧西林金黄葡萄球菌制备的微生态调整剂，滴入后保持小鼠直立2min；

VBNC3组：于第0、7、14、21天分别在小鼠鼻腔滴注40μL实施例16所制的微生态调整剂，滴入后保持小鼠直立2min；

18.2D3组中微生态调整剂的制备

18.2.1取过夜培养的耐甲氧西林金黄葡萄球菌及其培养液，置于100℃水浴箱中热灭活5min。4500rpm离心10min，收取灭活菌的菌泥；

18.2.2将8克NaCl和0.24克KH2PO4溶解在1L去离子水中，搅拌均匀后，加入步骤18.2.1获得的灭活耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌泥，调整菌体含量到7x10³个/克，加入乳酸，将pH值调整到5.5，获得灭活耐甲氧西林金黄葡萄球菌微生态调整剂。

18.3实验过程：

18.3.1在末次免疫后第7天，采集各组小鼠尾静脉血和唾液(用30μL卡米可林促进分泌)；

18.3.2分离后的血清和唾液各适当稀释后，ELISA检测其抗体效价。抗原包被液重悬耐甲氧西林金黄葡萄球菌至D(620)＝0.1，在96孔板中各加100μL，4℃过夜，洗3次后用2％BSA+PBST封闭2h，加一抗100μL(血清1：100，唾液1：25倍比稀释)37℃孵育1h，洗6次后加二抗(抗IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3为1：5000稀释；抗IgA为1：2000稀释)37℃孵育45min，加入底物显色液TMB，15min后用H2SO4终止反应，在450nm波长处测吸光度值[D(450)值]；

18.3.3检测每组小鼠血清和唾液中IgG及其亚型，获得IgG抗体滴度，结果如表十一所示：

表十一 三组小鼠的IgG抗体滴度差异

18.3.3制备可培养耐甲氧西林金黄葡萄球菌的感染菌液，以无菌生理盐水重悬菌体，调整菌体含量为1x10⁹CFU/mL；

18.3.4在最后一次免疫的第14天后，对三组小鼠经尾静脉注射0.1mL上述耐甲氧西林金黄葡萄球菌感染菌液，全部进行攻毒。连续观察小鼠的生存状态至14d，计算小鼠的生存率；

18.4实验结果如表十二所示：

表十二 被攻毒小鼠的生存率差异(％)

18.5实验结论：

根据表十二内的数据可知，对照组的血清和唾液中均检测不到IgG及其亚型，它们的抗体滴度为0。在血清标本中，试验组产生的IgG抗体滴度(18900±6271)显著高于死菌组(4059±1742)。在唾液标本中，试验组产生的IgG抗体滴度为(700±203)，死菌组的抗体滴度为0。两者比较，差异具有显著的统计学意义。可见，实施例16提供的微生态调整剂作用鼻腔免疫的效果大大优于灭活菌制剂。

根据表十二内的数据可知，使用实施例16提供的高效微生态调整剂进行免疫，比死菌微生态调整剂的效果更好。

实施例19：

本实施例提供一种作用于呼吸道或口腔的微生态调整剂，由活的非可培养态的细菌中的一种或多种的干燥菌粉组成，具体为冻干的非可培养态的活的耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌粉。

该微生态调整剂的制备过程如下：

19.1制备活的非可培养态的耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌泥，实施例16中对其制备过程做了详细描述，这里不再赘述；

19.2将步骤18.1获得的活的非可培养态的耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌泥，按1：1.6加入海藻糖溶液保护剂，冷冻干燥。即为本实施例提供的高效微生态调整剂。该微生态调整剂喷在鼻腔或舌头下，能够在调整微生态同时用于全身耐甲氧西林金黄葡萄球菌的间接抑制。

实施例20：

本实施例提供一种通过外用直接作用于眼表面的微生态调整剂，具体包含活的非可培养态的细菌、眼表面润湿剂、水。还可包含NaCl。其中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。

其中，活的非可培养态的细菌优选为双歧杆菌、乳杆菌、乳腺炎棒状杆菌、粪肠球菌中的一种或多种的组合，眼表面润湿剂优选为透明质酸钠、聚乙二醇、丙二醇中的一种或多种组合。

具体的活的非可培养态的细菌为婴儿双歧杆菌，含量1x10⁷个/克；眼表面润湿剂为透明质酸钠1份，水为去离子水1000份，NaCl渗透压调整剂9份，。

该高效微生态调整剂的制备过程如下：

20.1选用模式菌株婴儿双歧杆菌(ATCC15697)，培养基配方为:蔗糖2％、酪蛋白胨1％、大豆蛋白胨1％、酵母浸膏0.7％、低聚木糖0.3％、磷酸二氢钾0.05％、胡萝卜汁8％。37℃厌氧培养16小时。12000r/min，离心5分钟，收取可培养态的婴儿双歧杆菌菌体；

20.2将上述婴儿双歧杆菌悬浮于液体LB培养基，pH7，置于4℃的低温下厌氧静止诱导；

20.3第30天后，12000r/min，离心5分钟，收取婴儿双歧杆菌菌体。用生理盐水洗涤两次，获得非可培养态的活的婴儿双歧杆菌；

20.4在1L去离子水中，加入9g的NaCl，1g透明质酸钠，搅拌均匀，获得等渗的透明质酸钠溶液；

20.5将步骤20.3获得的非可培养态的活的婴儿双歧杆菌加入步骤20.4所述的等渗透明质酸钠溶液中，调整菌体含量为1x10⁷个/克，即获得本实施例提供的高效微生态调整剂，该微生态调整剂能够用于眼表面的护理和辅助治疗。

实施例21：

本实施例提供实施例20所述微生态调整剂的应用，包括作为制备治疗疾病的药物的应用，或作为制备防止微生态失衡的护理用品的应用。

本实施例具体的为实施例20所述微生态调整剂治疗干眼症的效果实验：

20.1实验分组：

选取86例干眼症患者，纳入标准：①符合干眼症的诊断标准；②患者知情同意。排除标准：①合并青光眼的患者；②合并眼部有剧痛感的患者。将上述患者随机分为试验组与对照组各43例，具体组别如下：

对照组：采用等渗透明质酸钠溶液滴眼，1滴/次，6次/d，连续治疗14d；

实验组：采用实施例20提供的微生态调整剂滴眼，1滴/次，6次/d，连续治疗14d。

21.2测试实验：

21.2.1眼泪分泌测试：

采用Schirmer I试验测定：在患者结膜囊内点入局麻药，待麻药起作用后用5×30mm的泪液检测滤纸条，折出5mm置下穹隆结膜囊内的外1/3处，其余部分突出眼外，5min后测量滤纸湿润的长度；

21.2.2角膜荧光素染色：采用消毒玻璃棒沾取少许1-2％无菌荧光素钠液涂于下穹窿部结膜上，1-2min后观察结果；

21.2.3评判标准及结果：

①痊愈：眼泪分泌试验>10mm，角膜荧光素染色阴性(一)；②显效：眼泪分泌试验5-10mm，角膜荧光素染色阴性(一)；③有效：眼泪分泌试验5-10mm，角膜荧光素染色阳性(+)；④无效：眼泪分泌试验<5mm，或角膜荧光素染色强阳性(++)。

21.3实验结果：

结果如表十三所示：

表十三 干眼症滴眼干预效果比较(例，％)

21.4实验结论：

由表十三可知，试验组治疗效果显著优于对照组，说明实施例20提供的高效微生态调整剂对干眼症患者有明显的疗效。眼表面微生态失衡与干眼症发病率相关，以此可推断，实施例20同步地调整眼表面的微生态作用显著。

实施例22：

本实施例提供一种直接作用于肛门的微生态调整剂，且其中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。具体包含活的非可培养态的细菌、栓剂基质。还可包含吲哚美辛，营养素，植物提取物，呋喃唑酮。

其中，活的非可培养态的细菌为双歧杆菌、乳杆菌、粪肠球菌中的一种或多种的组合，优选为婴儿双歧杆菌，植物提取物优选为冰片和黄芩提取物，栓剂基质优选为混合脂肪酸甘油酯，营养素优选为维生素C。

该高效微生态调整剂的制备过程如下：

22.1制备活的非可培养态的活的婴儿双歧杆菌菌泥，其具体制备过程在实施例20中有详细描述，这里不再赘述；

22.2将步骤22.1获得的非可培养态的活的婴儿双歧杆菌菌泥0.1g，与研磨细的冰片1g，黄芩提取物0.2g，吲哚美辛75g，呋喃唑酮100g，混匀基质后，再混合脂肪酸甘油酯1300g，获得原料；

22.3将步骤22.2所得原料加入模具，将其制成栓剂。

本实施例提供的高效微生态调整剂，可以在对肛肠消炎的同时调整肛肠的微生态，治疗痔疮和防止便秘。

实施例23：

本实施例提供一种直接作用于阴道的高效微生态调整剂，包含至少一种活的非可培养态的细菌。还可包含益生元，营养素，植物提取物，表面活性剂，抗生素，胶囊，栓剂基质中的一种或多种组合。

具体而言，本实施例提供的高效微生态调整剂选用詹氏乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌为活的非可培养态的细菌。

该微生态调整剂的制备过程如下：

23.1选择模式菌株詹氏乳杆菌(ATCC25258)，植物乳杆菌(ATCC8014)，发酵乳杆菌(ATCC14931)分别进行培养。培养条件：37℃，接种量为5％，厌氧培养；培养基：10％脱脂乳，0.1％乳糖，1.0％酵母膏，10％麦芽汁1.0g，100mL柠檬酸三钠；培养时间：10h左右；

23.2培养结束后，4500rpm离心10min，分别收取上述三种乳杆菌菌泥；

23.3上述步骤23.2获得三株乳杆菌菌泥分别与灭菌生理盐水，按照质量份计，按照1：4混合，将收集的两株菌泥吹打洗涤后，4500rpm离心10min。反复两次，获得三株可培养乳杆菌的菌泥；

23.4将最后得到的三株乳杆菌菌泥与灭菌生理盐水，按质量份计，以1：6混合，将洗涤后的三株乳杆菌重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；

23.5将上述菌悬液接入到液体MRS诱导液体中，将混合菌体含量调整到10⁷CFU/ml混匀。置于4℃的厌氧环境中进行诱导；

23.6每5天摇匀诱导液，取样。采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中活的可培养态乳杆菌进行准确计数；

23.7当活的可培养态的细菌含量低于100CFU/ml时，4500rpm离心10min，收取三株诱导好的乳杆菌菌泥。按1：1.6加入海藻糖溶液保护剂，冷冻干燥，获得非可培养态的詹氏乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌冻干菌粉；

23.8将上述三株非可培养态的乳杆菌冻干菌粉各0.1g装入胶囊中，获得本实施例提供的微生态调整剂。

该微生态调整剂具体使用方法：将步骤23.8制备得到的胶囊放入阴道中，胶囊融解，释放非可培养态的乳杆菌冻干菌粉到阴道中。

活的非可培养态的乳杆菌可以提高阴道内溶菌酶和抗菌肽的抑菌活性，由宿主对其微生态进行整体性调整。由于非培养态的活菌并不会定植于阴道表面，因此，即使是非同类阴道来源的菌株也不会改变微生态的天然构成。

另外，300份23.7所述活的非可培养态的乳杆菌冻干菌粉，也可以与1000份低聚果糖，1000份维生素C，50份辛夷提取物，1份那他霉素混合装入胶囊中，形成复配的微生态调整剂。

上述配方的混合物还可以混合在甘油明胶中，制成栓剂用于阴道护理。

实施例24：

本实施例提供一种能够直接作用于口腔的高效微生态调整剂，包含至少一种非可培养态的活菌和水。还可包含益生元，营养素，植物提取物，表面活性剂中的一种或多种组合。且其中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。

其中，非可培养态的活菌优选为乳酸菌中一种或多种组合。(乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌，包括乳杆菌，双歧杆菌，乳酸链球菌，乳酸片球菌等多个属。)进一步优选为发酵乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌或者副干酪乳酸菌中的一种或者多种混合。

活的非可培养态的乳酸菌具有更小的体积，更容易与口腔免疫细胞作用，提高其抗菌肽或/和溶解酶的抑菌活性更多，更好地间接调整口腔的微生态，抑制有害病菌，以及真菌、病毒。同时非可培养态的活的乳酸菌几乎不代谢产酸，与可培养的活菌相比对牙齿釉质更加安全。

该高效微生态调整剂的制备过程如下：

24.1选择模式菌株唾液乳杆菌(ATCC11741)，植物乳杆菌(ATCC8014)，分别进行培养；培养条件：37℃，接种量为5％，厌氧培养；培养基：10％脱脂乳，0.1％乳糖，1.0％酵母膏，10％麦芽汁1.0g，100mL柠檬酸三钠；培养时间：10h左右；

24.2培养结束后，4500rpm离心10min，分别收取上述乳杆菌菌泥；

24.3上述两株乳杆菌的菌泥分别与灭菌生理盐水，按照质量份计，以1：4混合，将收集的两株菌泥吹打洗涤后，4500rpm离心10min，反复两次；

24.4将最后得到的菌泥分别与灭菌生理盐水按照以克计1：6混合，重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；

24.5将上述菌悬液分别接入到液体MRS诱导液体中，将菌体含量调整到10⁷CFU/ml,混匀。置于4℃的厌氧环境中进行诱导；

24.6每5天摇匀诱导液，取样，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中活的可培养态乳杆菌进行准确计数；

24.7当活的可培养态的细菌含量低于100CFU/ml时，4500rpm离心10min，收取两株诱导好的乳杆菌菌泥。按1：6将诱导好的菌泥混悬在生理盐水中。采用真空低温干燥机，在55℃下低温干燥，获得活的非可培养态的唾液乳杆菌及植物乳杆菌的干燥菌粉；

24.8将上述非可培养态的活菌干燥菌粉分散在水中，调整总的菌体含量为2x10⁷CFU/ml。获得本实施例的高效微生态调整剂。

该微生态调整剂通过漱口作用于口腔，清除口腔残渣时，可降低有害细菌的粘附，抑制其生长。同时，非培养态的乳酸菌，不会定植改变口腔菌群，亦不会大量代谢产酸腐蚀牙釉质。高效调整口腔微生态的同时，安全性更高。

实施例25：

本实施例提供实施例24的微生态调整剂对口腔唾液中溶菌酶活性提升的对比实验：

25.1实验分组：

选取372名21-25岁的青年男性，随机分为3组，每组124名。排除：有口腔溃疡、正在服用抗生素、有龋齿、牙龈炎等口腔疾病者。

所有参试者，每天刷牙和餐后(包括零食)均漱口一次。

具体组别如下：

M组：使用生理盐水漱口，空白对照组；

C7组：使用含可培养乳杆菌的生理盐水漱口；

VBNC7组：使用实施例24所述高效微生态调整剂漱口；

25.2C7组微生态调整剂的制备：

25.2.1将24.3得到的两株可培养的乳杆菌，使用海藻糖保护，冷冻干燥后，获得可培养态乳杆菌的冻干菌粉；

25.2.2将上述冻干菌粉等比例加入无菌生理盐水中，调整总的菌体含量为2x10⁷CFU/ml。获得用于对比的微生态调整剂(C7组)。

25.3实验过程：

25.3.1各组连续使用对应的试剂漱口三天后，分别采集各组参与者的唾液。取样前均用蒸馏水漱口，第一口唾液舍弃，取第二口及以后的唾液2ml为样本；

25.3.2测试各组的唾液中溶菌酶的活性：培养溶壁微球菌，经丙酮和乙醚干燥后，用pH7.2的PBS稀释至波长为530nm，吸光度(O.D.)为0.8的菌悬液，分别在2.0ml菌悬液中加入上述测试样品1.5ml，37℃反应1h，并于反应前后测定其吸光值，与用蛋白溶菌酶做成的标准曲线对照，计算样品中溶菌酶活性；

25.3.3以1.5mlPBS加2.0ml菌悬液，37℃反应1h，测得的吸光值作为校正值，溶菌酶相对活性值以含1mg蛋白质量计算,标准蛋白质采用牛血清白蛋白。

25.4实验结果如表十四所示：

表十四 男青年唾液中溶菌酶活性(μg/mgprotein)

25.5实验结果

由表十四内数据可知，用实施例24的高效微生态调整剂作用于口腔，唾液中溶菌酶的活性显著大于生理盐水，也显著大于可培养活菌。非可培养态的活菌提高宿主溶菌酶活性的功效比可培养的活菌更强。

实施例26：

本实施例是实施例24中所述的高效微生态调整剂的应用，即作为制备防止微生态失衡的护理用品的应用。作用的部位为口腔和牙齿。剂型为水悬剂。为了制备成复配漱口水，还包括其他辅助成分，所述其他辅助成分包括以下成分中的一种或几种混合：油脂、水、营养素、盐、pH调节剂、植物提取物、微生物培养物、药学上可接受的辅料。

具体成分为：盐0.4％；甘草提取物0.5％；黄芩提取物0.5％；低聚果糖1％；鼠李糖脂0.5％；乳酸薄荷酯0.03％；柠檬酸0.08％；甘油0.5％；山梨醇1.5％，聚山梨醇酯-20：0.1％；维生素B6：0.01％；柠檬酸锌0.1％；实施例24的微生态调整剂补足余量。将上述组分混合均质，获得防止口腔微生态失衡的护理用品，一种复配漱口水。

所得复配漱口水通过漱口作用于口腔、牙齿，清除口腔残渣时，可提高口腔溶解酶抑菌活性，降低有害口腔细菌的粘附，抑制其生长。同时，非可培养态的乳酸菌，不会定植改变口腔菌群，亦不会大量代谢产酸腐蚀牙釉质。调整口腔菌群、防治口腔牙龈疾病，功效和安全性都更高。

实施例27：

本实施例提供一种基于微生态调整剂的牙膏，该牙膏直接作用于牙齿和口腔，具体包含至少一种活的非可培养态的细菌、保湿剂，摩擦剂，增稠剂，表面活性剂，甜味剂，香精，水，脱敏剂。且其中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。

优选的，非可培养态的活菌为乳酸菌中一种或多种组合，进一步优选为同型发酵的乳杆菌。

该牙膏的具体制备过程为：

27.1先在制膏机中加入20％的保湿剂甘油和45.89％的去离子水，再加入0.1％的增稠剂羟乙基纤维素快速搅拌均匀，依次加入糖精钠0.8％、硝酸钾0.01％、表面活性剂十二烷基硫酸钠2％、以及24.7中获得的活的非可培养态的唾液乳杆菌及植物乳杆菌的干燥菌粉各0.1％并搅拌；

27.2接着加入30％的摩擦剂碳酸钙，搅拌均质，然后抽真空搅拌；

27.3最后加入香精薄荷脑1％，搅拌均质，脱气，制成膏体。从而获得基于一种高效微生态调整剂的益生菌牙膏。

乳酸菌可以通过竞争位点和调整唾液的溶菌酶活性，抑制卟啉单胞菌、具核梭杆菌以及伴放线放线杆菌等能够引起牙周病的主要病原菌。然而乳酸菌代谢会产生大量乳酸，存在较大的致龋倾向。这导致现有的益生菌牙膏存在较大的技术问题。本实施例采用的非可培养态活的乳酸菌不会代谢产生乳酸，消除了这种致龋倾向，克服了上述技术问题。而更小的菌体不仅共聚能力更强(拮抗口腔致病菌)，也使口腔溶菌酶活性更高，因此保护牙齿的功效更强。

实施例28：

本实施例提供一种口服微生态调整剂，包括至少一种处于活的非可培养态的细菌，所述处于活的非可培养态的细菌为不产芽孢的细菌，每克所述的高效微生态调整剂含有处于活的非可培养态的细菌数量为10³～10¹²个。

活的非可培养态的细菌为乳酸菌，本实施例中优选为鼠李糖杆菌。

该口服高效微生态调整剂的制备过程为：

28.1选取鼠李糖乳杆菌(ATCC 7469)进行培养；培养条件：37℃，接种量为5％，厌氧培养；培养基：10％脱脂乳，0.1％乳糖，1.0％酵母膏，10％麦芽汁1.0g，100mL柠檬酸三钠；培养时间：10h左右；

28.2培养结束后，4500rpm离心10min，收取可培养态鼠李糖杆菌的菌泥；

28.3将步骤28.2获得的鼠李糖杆菌菌泥与灭菌生理盐水，按照质量份计，以1：4混合，洗涤后，4500rpm离心10min。反复两次。将最后得到的鼠李糖杆菌菌泥与灭菌生理盐水，按照质量份计，以1：6混合，重悬于灭菌生理盐水中，制成鼠李糖杆菌菌悬液；

28.4将步骤28.3所得菌悬液接入到液体MRS诱导液体中，将菌体含量调整到10⁷CFU/ml，混匀，然后置于4℃的厌氧环境中进行诱导；

28.5每5天摇匀诱导液，取样。采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中残余的可培养态鼠李糖杆菌进行准确计数；

28.6第45天后，4500rpm离心10min，收取非可培养态的鼠李糖杆菌菌泥；

28.7将28.6中收取的经VBNC诱导的鼠李糖杆菌菌泥，冷冻干燥，即得本实施例提供的口服高效微生态调整剂。

尽管按新的发现，活的非可培养态的乳酸菌调整微生态的功效更强。但是鉴于可培养态的乳酸菌在口服微生态调整剂的传统应用，从生产成本上考虑，本实施例的口服高效微生态制剂，允许可培养态乳酸菌残余，无需限制其含量。

实施例29：

本实施例提供实施例28所述微生态调整剂影响肠道抗菌肽的比较试验：

29.1实验分组：

选60日龄白羽鸡69只，随机分为3组，每组23只，具体组别如下：

M组：采用青贮饲料喂养，作为空白对照组；

C组：采用掺入0.1％可培养态鼠李糖杆菌冻干菌粉的青贮饲料喂养；

VBNC组：采用掺入0.1％实施例28所述微生态调整剂的青贮饲料喂养。

29.2C组中可培养态鼠李糖杆菌的冻干菌粉的制备

29.2.1制备可培养态鼠李糖杆菌的菌泥，具体制备过程在实施例28中有详细描述，这里不再赘述；

29.2.2将步骤29.2.1中获得的可培养态鼠李糖杆菌的菌泥，冷冻干燥，获得的冻干菌粉作为C组的添加试剂。

29.3实验过程：

29.3.1喂养3天后，将鸡只处死，取相同段位新鲜肠道，去脂和内容物，称重，剪碎，用组织捣碎机捣碎3次，每次2min，再用超声波细胞粉碎机破碎10次，每次3秒.按体积比1：l加人5％乙酸，4℃搅拌过夜；

29.3.2次日将混合物于4℃，8000r/min离心30min，取上清，4℃保存；

29.3.3将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再次4℃搅拌浸提过夜；

29.3.4重复步骤29.3.3的离心过程，取上清，合并2次上清液，调节pH值为7.0，再离心，弃沉淀，上清液冷冻干燥即为肠道抗菌肽类物质粗提品；

29.3.5每组取2mg上述冻干粉溶解于1mL去离子水中，采用纸片扩散法(纸片直径0.5cm)测定各组肠道抗菌肽对大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)的抑菌活性。实验数据均以(平均值±标准差)表示，组间比较采用SPSS18.0软件统计分析。

29.4实验结果如表十五所示：

表十五 鸡肠道抗菌肽抑菌活性对比(抑菌环直径cm)

29.5实验结论：

由表十五内的数据可知，实施例28提供的口服微生态调整剂，提高肠道抗菌肽的抑菌活性显著优于同等含量使用可培养态乳杆菌的微生态调整剂。

实施例30：

本实施例提供实施例28所述口服微生态调整剂调整肠道微生态的效果：

30.1实验分组：

将标准菌种肠道沙门氏菌(ATCC14028)接种于LB液体培养基中，37℃培养18～24h；含菌培养液接种在100只7日龄雏鸡：腹部皮下注射0.5mL/只。攻毒后，选择45只发生沙门氏菌感染，出现鸡白痢症状的病鸡，随机分成3组，每组15只，具体组别如下：

M组：以生理盐水0.7ml灌胃，作为空白对照组；

C组：以含有0.1％活的可培养态鼠李糖杆菌(29.2.2中得到)的生理盐水0.7ml灌胃

VBNC组：以含有0.1％实施例28所述高效微生态调整剂的生理盐水0.7ml灌胃。

30.2实验过程：

30.2.1以上各组分别隔离饲养，连续用药14日，观察并记录鸡的痊愈、有效、无效和死亡等情况；

30.2.2评判标准：

①痊愈：恢复健康，无病症体现；②有效：症状减轻；③无效：症状恶化，奄奄一息，发生死亡。

30.3实验结果

结果如表十六所示：

表十六 调整感染鸡只肠道菌群的治疗效果比较(例，％)

30.4实验结论：由表十六可知，实施例28提供的口服高效微生态调整剂的菌悬液能够对感染鸡只肠道菌群进行有效调整，而且其治疗效果显著大于可培养态乳杆菌制备的微生态调整剂。实施例28提供的口服高效微生态调整剂可添加到食品，饲料以及饮料中，用于防治肠道菌群失调和致病菌感染引起的疾病。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种高效微生态调整剂，其特征在于，包括至少一种处于活的非可培养态的细菌，所述处于活的非可培养态的细菌为不产芽孢的细菌，每克所述的高效微生态调整剂含有处于活的非可培养态的细菌数量为10³~10¹²个。

2.根据权利要求1所述的一种高效微生态调整剂，其特征在于，所述微生态调整剂通过外用直接作用于目标部位，所述目标部位包括皮肤、口腔、呼吸道、阴道、眼表面、指甲、毛发、肛门、耳道、直肠、牙齿，所述微生态调整剂中可培养态的细菌的含量低于10³个/克。

3.根据权利要求1或2所述的一种高效微生态调整剂，其特征在于，还包括其他辅助成分，所述其他辅助成分包括以下成分中的一种或几种混合：油脂、水、营养素、盐、pH调节剂、植物提取物、微生物培养物、药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求1或2所述的一种高效微生态调整剂，其特征在于，所述处于活的非可培养态的细菌为目标作用部位常驻菌的一种或多种。

5.根据权利要求1或2所述的一种高效微生态调整剂，其特征在于，所述处于活的非可培养态的细菌为乳酸菌中的一种或多种组合。

6.根据权利要求1或2所述的一种高效微生态调整剂，其特征在于，所述处于活的非可培养态的细菌为宿主的条件致病菌或致病菌。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种高效微生态调整剂的应用，包括作为制备治疗疾病的药物的应用，或作为制备防止微生态失衡的护理用品的应用。

8.根据权利要求7所述的一种高效微生态调整剂的应用，其特征在于，所述使用微生态调整剂制备成的药物和防止微生态失衡的护理用品作用的部位为皮肤或口腔或呼吸道或阴道或眼表面或指甲或毛发或肛门或耳道或直肠或牙齿。

9.根据权利要求6或7所述的一种高效微生态调整剂的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括粉剂、水悬剂、膏剂、栓剂、喷雾剂、涂膜剂，所述护理用品包括护肤霜、牙膏、漱口水、清洗液、沐浴液、洗发水、饮料。

10.一种用于皮肤的护理用品，其特征在于，该护理用品的剂型为油剂或膏剂，

当该护理用品的剂型为油剂，其主要成分为：按重量份计，主要由权利要求1~6任一项所述的高效微生态调整剂0.001~20份，油脂80~99.999份、表面活性剂0.01~10份组成；

当该护理用品的剂型为膏剂，其主要成分为：按重量份计，主要由权利要求1~6任一项所述的高效微生态调整剂0.001~20份，油脂10~30份、表面活性剂0.1~20份、水60~80份组成。