CN112940996A - 一种调控表皮微生态平衡的益生菌、其产品及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控表皮微生态平衡的益生菌，其特征在于，为动物双歧杆菌，其分类命名为Bifidobacterium animalis 5b5L3，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021389。实验显示，本发明提供的益生菌，其无菌发酵产物能有效调节表皮微生态，抑制丙酸杆菌，从而起到治疗和护理痤疮的作用。尤其是经超声破碎的益生菌发酵液，具有更加显著的调节表皮微生态、抑制丙酸杆菌的作用。本发明提供的益生菌其发酵产物能应用于制备调节表皮微生态的制剂。

Description

一种调控表皮微生态平衡的益生菌、其产品及应用

技术领域

本发明属于微生物领域，更具体地，涉及一种调控表皮微生态平衡的益生菌、其产品及应用。

背景技术

表皮微生态系统是由各类微生物、皮肤表面的组织细胞及各种分泌物、微环境等共同组成的生态系统，它们共同维持着表皮微生态平衡，在皮肤表面形成第一道生物屏障，具有重要的生理作用。当微生态失衡时，会造成皮肤产生痤疮或者其他肌肤问题。

皮肤微生物是表皮微生态平衡体系里的重要组成部分，皮肤表面的菌群可分为常驻菌群和暂住菌群，常驻菌群是指在健康皮肤上定居的微生物，暂住菌是指通过接触外界环境而获得的一类微生物，它们是引起皮肤感染的主要病原菌。

目前治疗痤疮的方法主要为抗生素、维A酸类、过氧化苯甲酰和壬二酸、光动力疗法等，但都有明显的弊端，抗生素长期使用，可造成抗生素耐药现象；维A酸类会破坏皮肤屏障，有一定致畸与光敏等毒副作用；过氧化苯甲酰和壬二酸具有较强的皮肤刺激性，有一定致癌性等毒副作用，且国家法律禁止这三类物质用于护肤品；光动力疗法通过重塑皮肤微生物群并降低病变内的痤疮丙酸杆菌数量来改善痤疮，会加剧破坏皮肤微生物平衡，留下皮肤问题隐患。

虽然目前认为皮肤表面益生菌的大量生长，将有利于表皮微生态的平衡，从而能够治疗和护理痤疮等问题。然而活菌产品的产品质量控制、保存和运输等环节皆存在巨大难题。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种控表皮微生态平衡的益生菌、其产品及应用，其目的在于发现了一种动物双歧杆菌，其发酵液具有调节表皮微生态，抑制丙酸杆菌、改善痤疮的作用，由此解决现有的表皮微生态缺乏有效的调节手段或者活菌产品质量难以控制的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种调控表皮微生态平衡的益生菌，其为动物双歧杆菌，其分类命名为Bifidobacterium animalis 5b5L3，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021389。

按照本发明的另一个方面，提供了一种用于调控表皮微生态平衡的制剂，其含有如权利要求1所述益生菌的发酵液。

优选地，所述用于调控表皮微生态平衡的制剂，其所述益生菌的发酵液按照如下方法制备：

将所述益生菌活化得到的液体菌种按照0.5％-3％的接种量接种至发酵培养基，置于35-37℃摇床120-180rpm培养36-48小时；

发酵完成后，破碎细胞，过滤收集滤液即为所述益生菌的发酵滤液。

优选地，所述用于调控表皮微生态平衡的制剂，其所述发酵培养基含有如下质量份数以干重计的发酵营养料：

金银花1～10份 马齿苋1～10份 大米5-10份

优选地，所述用于调控表皮微生态平衡的制剂，其所述发酵培养基含有如下质量份数以干重计的发酵营养料：

金银花5份 马齿苋5份 大米10份

优选地，所述用于调控表皮微生态平衡的制剂，其所述破碎细胞采用超声破碎，优选超声破碎条件为：

保护温度15℃，功率750w，超声5s，间隔5s，持续10分钟。

优选地，所述用于调控表皮微生态平衡的制剂，其所述益生菌的发酵液按照如下方法制备：

所述益生菌活化得到的液体菌种按照如下方法获取：

将冷冻菌种接种于MRS固体平板上培养，取无污染的所述动物双歧杆菌接种至MRS液体培养基中培养，获得所述益生菌活化得到的液体菌种。

按照本发明的另一个方面提供了所述益生菌或所述制剂的应用，其特征在于，其应用于调控表皮微生态平衡。

优选地，所述益生菌的应用，其应用于改善痤疮。

优选地，所述益生菌的应用，其将含有所述益生菌的发酵液的制剂涂抹于皮肤表面。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

实验显示，本发明提供的益生菌，其无菌发酵产物能有效调节表皮微生态，抑制丙酸杆菌，从而起到治疗和护理痤疮的作用。尤其是经超声破碎的益生菌发酵液，具有更加显著的调节表皮微生态、抑制丙酸杆菌的作用。本发明提供的益生菌其发酵产物能应用于制备调节表皮微生态的制剂。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的调控表皮微生态平衡的益生菌，为动物双歧杆菌，其分类命名为Bifidobacterium animalis 5b5L3，于2021年4月16日保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021389。

本发明提供的用于调控表皮微生态平衡的制剂含有所述益生菌的发酵液。

所述益生菌的发酵液按照如下方法制备：

将所述益生菌活化得到的液体菌种按照0.5％-3％的接种量接种至发酵培养基，置于35-37℃摇床120-180rpm培养36-48小时；优选培养条件为： 37℃摇床120rpm培养48小时

所述发酵培养基含有如下质量份数的发酵营养料：

金银花1～10份 马齿苋1～10份 大米5-10

优选地，所述发酵培养基含有如下质量份数的发酵营养料：

金银花5份 马齿苋5份 大米10份

所述益生菌活化得到的液体菌种按照如下方法获取：

将冷冻菌种姐终于MRS固体平板上培养，取无污染的所述动物双歧杆菌接种至MRS液体培养基中培养，获得所述益生菌活化得到的液体菌种。

发酵完成后，破碎细胞，过滤收集滤液即为所述益生菌的发酵滤液。

所述破碎细胞采用超声破碎，优选超声破碎条件为：

保护温度15℃，功率750w，超声5s，间隔5s，持续10分钟。

实验显示，发酵完成后直接滤除益生菌获得的发酵基液其效果远逊于破碎细胞除菌获得的发酵液，推断抑制痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的活性成分可能更多的存在于益生菌体内。而为了产品品质稳定宜采用无活菌的发酵液或者发酵基液作为成品，由于破碎细胞后的发酵基液具备更加显著的生物学活性，故破碎细胞的过程在制取发酵液中至关重要。常用的，能有效理解细菌细胞的方法，包括超声裂解、热裂解、化学裂解、冻干裂解。考虑到：热裂解细菌的同时可能会影响发酵液中有些成分如酶、蛋白类物质等，导致其变性或失活；冻干研磨工序太复杂、成本过高；化学裂解会有化学残留，影响后续细胞实验。而超声裂解细菌的同时，有利于添加的发酵营养料中有效成分的释放，故本发明中优选超声裂解。

本发明提供的用于调控表皮微生态平衡的制剂含有所述益生菌的发酵液制备方法如前所述。

所述益生菌，应用于调控表皮微生态平衡，尤其是改善痤疮；将所述益生菌的发酵液涂抹于皮肤表面，能显著抑制痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌，调节皮肤表面微生态。

以下为实施例：

实施例1益生菌的分离纯化及保种

实验室收集得到哺乳期健康女性的乳汁样本，经无菌无氧水梯度稀释后，选择适宜梯度的稀释液涂布于MRS固体培养基，37℃厌氧培养48小时。挑取典型菌落划线于MRS固体培养基2-3次，培养得到纯菌落。经16S rDNA 分子鉴定为一株动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌5b5l3(Bifidobacterium animalis 5b5l3)，该菌株已于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC。

实施例2益生菌的发酵液制备

(1)菌种活化

取出保存于-80℃冰箱的动物双歧杆菌5b5l3甘油冻存管，置于室温融化后在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体平板上，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为动物双歧杆菌且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃培养24小时备用。

(2)发酵培养基的制备

称取10g蔗糖、5g豆粕、5g玉米、5g麸皮、5g NaCl、0.5g MgSO4，加入去离子水定容至500mL，ph调至5-6。

(3)发酵营养料的制备

称取5-10g大米洗净，浸泡至500mL去离子水中2h，再加入1-10g金银花、1-10g马齿苋，混合均匀后得到发酵营养料。

(4)益生菌发酵

菌种活化得到的菌液按照0.5％-3％的接种量，接种至发酵培养基与发酵营养料等比例混合的培养基中，置于37℃摇床120rpm培养48小时。

(5)发酵液过滤

1：益生菌发酵完成后过滤，滤液为益生菌发酵基液。

2：益生菌发酵完成后，超声破碎细胞后过滤，滤液为益生菌发酵液。

超声破碎细胞条件：保护温度15℃，功率750w，超声5s，间隔5s，超声10分钟。

实施例3益生菌发酵液的抑菌效果测试

实施例2制备的益生菌发酵基液与益生菌发酵液，按照5％体积比分别添加至BHI和LB液体培养基中，将痤疮丙酸杆菌以2％的接种量接种至含有实施例2制备的益生菌发酵基液与益生菌发酵液的BHI培养基中，将表皮葡萄球菌以2％的接种量接种至含有实施例2制备的益生菌发酵基液与益生菌发酵液的LB培养基中；阴性对照组为BHI和LB液体培养基，以2％的接种量分别接种痤疮丙酸杆菌与表皮葡萄球菌，培养基接种情况如下表所示。 37℃培养24小时，OD₆₀₀处检测吸光值。每组实验设置3个平行，使用 GraphPad 8.0.2进行统计学分析，结果以均值±标准差表示。

表1抑菌实验培养基接种情况

注：“*”表示与CK比较的差异显著程度，P<0.05。

由表1可知，痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌分别接种至相应的培养基和含有实施例2制备的益生菌发酵基液与益生菌发酵液的培养基中，同等条件培养，其CKA、CKB的OD值显著高于A1-A6、B1-B6的OD值，且相同发酵程序下，含有益生菌发酵基液培养基的OD值显著高于含有益生菌发酵液培养基的OD值，表明动物双歧杆菌与金银花、马齿苋、大米等物质混合发酵后，可产生有效抑制痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌生长的物质，益生菌发酵液与益生菌发酵基液相比，益生菌发酵液对痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的抑制效果更佳。

实施例4益生菌发酵液的细胞毒性测试

以3×10⁴细胞/孔的密度将HaCaT细胞接种到96孔板中，37℃、5％CO₂条件下培养24小时后吸除上清，按照实验方案分组，实验组每孔分别加入 100μL含有5％不同发酵程序的益生菌发酵基液或益生菌发酵液的无血清 DMEM培养液；阴性对照组使用无血清DMEM培养液。37℃，5％CO₂条件下培养24小时，吸除上清，加入100μL含有5mg/mL MTT溶液的培养基，37℃温育4小时，除去MTT溶液，加入100μL DMSO避光低速震荡10分钟，于490nm处测定吸光值。每组实验设置6个平行，使用GraphPad 8.0.2进行统计学分析，结果以均值±标准差表示，如下表所示。

其中：细胞相对存活率＝A_n/A₀

注：A_n为实验组吸光值，A₀为阴性对照组吸光值。

根据ISO 10993-5:2009描述的毒性评价标准，细胞存活率高于70％时可定义为无细胞毒性。实施例4中细胞相对存活率均高于90％，表明动物双歧杆菌与金银花、马齿苋、大米等物质混合发酵后，得到的益生菌发酵基液与益生菌发酵液均无细胞毒性。

实施例5益生菌发酵液的细胞脂质测试

以1×10⁵细胞/孔的密度将SZ95细胞接种到24孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后吸除上清，按照实验方案分组，实验组每孔加入热灭活的痤疮丙酸杆菌菌悬液100μL，且每孔再分别加入100μL含有5％不同发酵程序的益生菌发酵基液或益生菌发酵液的无血清DMEM培养液；模型组每孔加入热灭活的痤疮丙酸杆菌菌悬液100μL，且每孔再分别加入100 μL无血清DMEM培养液；阴性对照组每孔加入200μL无血清DMEM培养液。37℃，5％CO₂条件下培养24小时，吸除上清后使用PBS清洗两次细胞，加入4％的多聚甲醛处理细胞15分钟固定细胞，再加入1μg/mL的尼罗河红染色液，37℃避光孵育5分钟后，吸除上清后用PBS清洗，去除染色液后，使用荧光显微镜(激发光波长543nm，散发波长598nm)拍照，然后使用软件对脂质进行量化。每组实验设置6个平行，使用GraphPad 8.0.2进行统计学分析，结果以均值±标准差表示。

注：“*”表示与CK比较，P<0.05。

由表-可知，经灭活痤疮丙酸杆菌处理的SZ95细胞(MODEL与D1-D6) 与未经处理的SZ95细胞(CK)脂质比较，MODEL与D1-D6组细胞脂质含量高于CK组，其中MODEL组细胞脂质含量最高，D1-D6组经益生菌发酵基液或益生菌发酵液干预后，其细胞脂质含量显著下降，均低于MODEL组细胞脂质含量；且发现相同发酵程序中，益生菌发酵液处理的细胞脂质含量低于益生菌发酵基液处理的细胞脂质含量。表明灭活痤疮丙酸杆菌可刺激 SZ95细胞过量分泌皮脂，可通过动物双歧杆菌与金银花、马齿苋、大米等物质混合发酵产物进行干预，可有效减轻皮脂过量分泌，且经过超声破碎的益生菌发酵液减缓痤疮丙酸杆菌引发的皮脂分泌过度效果更佳。

实施例6益生菌发酵液的细胞炎症测试

以3×10⁴细胞/孔的密度将HaCaT细胞接种到96孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后吸除上清，按照实验方案分组，实验组每孔加入热灭活的痤疮丙酸杆菌菌悬液100μL，且每孔再分别加入100μL含有5％不同发酵程序的益生菌发酵基液或益生菌发酵液的无血清DMEM培养液；模型组每孔加入热灭活的痤疮丙酸杆菌菌悬液100μL，且每孔再分别加入100 μL无血清DMEM培养液；阴性对照组每孔加入200μL无血清DMEM培养液。37℃，5％CO₂条件下培养24小时，收集上清，使用ELISA试剂盒检测 TNF-α和IL-8含量。每组实验设置6个平行，使用GraphPad 8.0.2进行统计学分析，结果以均值±标准差表示。

注：“*”表示与CK比较，P<0.05。

由上表可知，经灭活痤疮丙酸杆菌处理的HaCaT细胞(MODEL与D1-D6) 与未经处理的HaCaT细胞(CK)炎症因子TNF-α、IL-8相比较，MODEL与 E1-E6组细胞炎症因子含量显著高于CK组，其中MODEL组细胞炎症因子含量最高，D1-D6组经益生菌发酵基液或益生菌发酵液干预后，其细胞炎症因子含量显著下降，均低于MODEL组细胞炎症因子含量；且发现相同发酵程序中，益生菌发酵液处理的细胞炎症因子含量低于益生菌发酵基液处理的细胞炎症因子含量。表明灭活痤疮丙酸杆菌可刺激HaCaT细胞产生炎症，可通过动物双歧杆菌与金银花、马齿苋、大米等物质混合发酵产物进行干预，可有效抑制炎症的产生，且经过超声破碎的益生菌发酵液减缓痤疮丙酸杆菌引发的炎症效果更佳。

实施例7

将实施例1中发酵程序B获得的发酵液按照5wt％加入到精华液中，具体组分如下表所示，应用于人体皮肤表面。其中益生元为低聚半乳糖。选择年龄18-36岁的受试者20人，所选择的受试者均为面部皮肤出现不同程度痤疮或油脂分泌过盛问题的人群，共分为4组，每组样品受试者5人。每位受试者每天早晚洁面后，将精华液均匀涂抹于面部，连续使用两周，在试验期间受试者不使用具有治疗痤疮的护肤品及药物，并保持正常的作息及饮食。在试验的开始前和结束后分别对受试者皮肤进行评价。

评价方式以问卷形式进行，主要包括受试者使用过程中对产品肤感、刺激性及功效评价。

痤疮评价：0-正常；1-粉刺性痤疮；2-轻中度丘疹脓疱性痤疮；3-严重丘疹脓疱性痤疮或中度结节性痤疮；4-严重的结节性痤疮或块状痤疮。

油脂分泌评价：0-正常；1-面部T字区少量分泌油脂；2-面部T字区大量分泌油脂；3-面部分泌油脂过量。

刺激性评价：0-正常；1-短暂轻微的刺痛感、红肿；2-刺痛、红肿情况； 3-严重的刺痛、红肿、脱皮等不良反应。

使用肤感评价：0-良好；1-吸收慢；2-黏腻厚重。

综合评价：0-满意；1-一般；2不满意。

(1)问卷调查结果

从上述实验结果可以看出，本发明提供的含有益生菌发酵液的精华液能够有效平衡面部肌肤微生态，重构肌肤生态屏障，可有效改善面部油脂分泌过盛及痤疮问题，其效果与水杨酸等效，但刺激性低于水杨酸。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种调控表皮微生态平衡的益生菌，其特征在于，为动物双歧杆菌，其分类命名为Bifidobacterium animalis 5b5L3，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021389。

2.一种用于调控表皮微生态平衡的制剂，其特征在于，含有如权利要求1所述益生菌的发酵液。

3.如权利要求2所述的用于调控表皮微生态平衡的制剂，其特征在于，所述益生菌的发酵液按照如下方法制备：

将所述益生菌活化得到的液体菌种按照0.5％-3％的接种量接种至发酵培养基，置于35-37℃摇床120-180rpm培养36-48小时；

发酵完成后，破碎细胞，过滤收集滤液即为所述益生菌的发酵滤液。

4.如权利要求3所述的用于调控表皮微生态平衡的制剂，其特征在于，所述发酵培养基含有如下质量份数以干重计的发酵营养料：

金银花1～10份 马齿苋1～10份 大米5-10份。

5.如权利要求4所述的用于调控表皮微生态平衡的制剂，其特征在于，所述发酵培养基含有如下质量份数以干重计的发酵营养料：

金银花5份 马齿苋5份 大米10份。

6.如权利要求3所述的用于调控表皮微生态平衡的制剂，其特征在于，所述破碎细胞采用超声破碎，优选超声破碎条件为：

保护温度15℃，功率750w，超声5s，间隔5s，持续10分钟。

7.如权利要求9所述的用于调控表皮微生态平衡的制剂，其特征在于，所述益生菌的发酵液按照如下方法制备：

所述益生菌活化得到的液体菌种按照如下方法获取：

将冷冻菌种接种于MRS固体平板上培养，取无污染的所述动物双歧杆菌接种至MRS液体培养基中培养，获得所述益生菌活化得到的液体菌种。

8.如权利要求1所述的益生菌或如权利要求2至7任意一项所述制剂的应用，其特征在于，应用于调控表皮微生态平衡。

9.如权利要求8所述的益生菌的应用，其特征在于，应用于改善痤疮。

10.如权利要求8或9所述的益生菌的应用，其特征在于，将含有所述益生菌的发酵液的制剂涂抹于皮肤表面。