CN103725625A - 一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用 - Google Patents

一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用 Download PDF

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蔡俊鹏
陈小红
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华南理工大学
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Abstract

本发明公开了一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用。发酵方法包括以下步骤:(1)宿主菌悬液的制备;(2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备;(3)蛭弧菌制剂的制备。本发明所述的发酵方法中采用的宿主菌均为有益的或对环境无害的革兰氏阳性菌,既可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革兰氏阴性菌的能力,用该方法制得的蛭弧菌制剂对致病菌的裂解能力有了一定的提高;所制得的蛭弧菌制剂又可以直接使用,无需经过更多的发酵后处理,该制剂的使用范围也大大的增加。本发明在得到高浓度蛭弧菌菌液的同时,相对也缩短了发酵周期,这样有效的解决了发酵时间过长而导致的能源消耗过大,生产成本过高的问题,得到的蛭弧菌制剂不仅成本低,而且活性高。

Description

一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用
[0001 ] 本发明专利申请是申请号为“ 201010270772.9”的分案申请,原申请的申请日为“2010年8月31日”,申请号为“201010270772.9”,发明名称为“一种蛭弧菌制剂及其发酵
方法和应用”。
技术领域
[0002] 本发明涉及发酵技术领域,具体涉及一种蛭弧菌制剂及其发酵方法与应用。
背景技术
[0003]目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各种物理和/或化学的方法,包括各种抗生素的使用。物理和/或化学的方法都存在着明显的弊端,首先,抗生素大量滥用,会导致一些副作用的产生,如病原菌的抗药性、抑制有益菌群等。其次,酸碱处理的方法虽可达到一定的灭菌/杀菌效果,但在有害菌形成生物膜后,这些方法的效果就极不理想。最后,物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节,而难以扩展到整个领域的所有环节。生物防治的方法则可具有强大的优越性,极有可能使其服务于日常生活的病害防治以及生物战和恐怖袭击中大规模的水源性、食源性污染的处理等。
[0004] 近年来微生物生态制剂的研究开发受到各方关注,特别是蛭弧菌的研究受到人们的青睐。蛭弧菌自1963年被发现以来,因其是一种寄生菌,能裂解大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌等革兰氏阴性致病菌且对人和动物无害,而备受关注。
[0005] 将蛭弧菌应用于防治致病菌的关键是获得浓度高、裂解能力强的蛭弧菌制剂。为此,人们对蛭弧菌制剂的制备方法进行了不懈的研究,譬如专利申请号为93111749.6、名称为“生物制菌王及其生产方法”的国家发明专利申请提出用高温(70~150°C)或化学药物(氯仿等)将大肠杆菌杀死,制造灭活的宿主菌,接着用其培养蛭弧菌,得到蛭弧菌制剂;专利申请号200810145709.5、名称为“蛭弧菌微生态制剂的生产方法”提供了蛭弧菌微生态制剂的生产方法,主要和传统方法不同的是将宿主大肠杆菌冻干成菌粉使用。上述两份专利申请都采用活的大肠杆菌作为宿主菌,最终会影响生态环境。而本发明所用的宿主菌均为有益菌或是对环境无害的菌,不会对环境构成威胁。专利申请号200810202809.7、名称为“双效蛭弧菌的发酵生产方法”的国家发明专利申请提供了一种双效蛭弧菌的发酵生产方法,即先发酵制备宿主菌的混悬液,再加入宿主菌混悬液和蛭弧菌液到配制好的培养液中进行发酵。虽然该生产方法生产出的蛭弧菌含量较高(5X108pfu/mL),但是其宿主菌选用了致病性的嗜水气单胞菌,而且发酵时间较长(72~120h),会导致其生产成本的增加。另外,此技术也可能存在着所得的蛭弧菌裂解活性不高的问题。而本发明采用的是革兰氏阳性菌为宿主,实验证明,以此宿主发酵制得的蛭弧菌能够维持,甚至提高对其他革兰氏阴性菌和阳性菌的裂解能力。
发明内容
[0006] 为了克服现有方法所制备的蛭弧菌制剂含量低以及裂解活性低的问题,本发明的首要目的在于提供一种蛭弧菌制剂的发酵方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种由上述发酵方法制备得到的蛭弧菌制剂。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述蛭弧菌制剂的应用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种蛭弧菌制剂的发酵方法,包括以下步骤:
[0010] (I)宿主菌悬液的制备
[0011] 将宿主菌培养至对数生长期,收集菌体,接着用磷酸盐缓冲液调整浓度,得到浓度为IO17~1022cfu/mL的宿主菌悬浮液,然后置于2~15°C中保存备用;
[0012] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0013] 在磷酸盐缓冲液中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液,调整宿主菌的浓度为101°~1015cfu/mL,再接入蛭弧菌斑,然后将此培养液在20~40°C培养20~60h,再在2~15°C, 5000~8000rpm离心15~35min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在2~15°C,12000~20000rpm离心15~40min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入磷酸盐缓冲液调整蛭弧菌游泳体的浓度为IO6~109pfu/mL,得到蛭弧菌游泳体浓缩液,置于2~15°C保存备用;
[0014] (3)蛭弧菌制剂的制备:
[0015] 将氯化钠溶于溶剂中形成质量体积比浓度为O~30g/L的氯化钠溶液,灭菌,得到发酵培养基;在发酵培养基中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌游泳体浓缩液,使宿主菌起始浓度为101°~1015cfu/mL,蛭弧菌游泳体起始浓度为IO1~103pfu/mL,进行发酵;发酵温度控制在28~30°C,pH值控制在7.2~7.6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在20%~3`0% ;发酵过程中加I~3次宿主菌悬浮液,每次加入宿主菌悬浮液的间隔时间12~18h,每次加入宿主菌悬浮液的量以新加入的宿主菌在发酵培养基中的浓度为101°~1015cfu/mL为准;发酵培养36~48h即制成蛭弧菌制剂;所述溶剂为DNB液体培养基、蒸馏水或磷酸盐缓冲液。
[0016] 步骤(1)所述宿主菌为有益的或对环境无害的革兰氏阳性菌,优选为枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、纳豆芽抱杆菌(Bacillus natto)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或戍糖片球菌(Pediococcus pentasaceus);
[0017]步骤(2 )所述蛭弧菌为 BDR) 1、BDF02, BDF03, BDJO1、BDJ02、BDMO1、BDSO1、BDS02、BDSM08 或 BDFM05。
[0018] 所述BDF01于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208008 ;所述BDF02于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208009 ;所述BDR)3于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO:M208010 ;所述 BDJ01 (蛭弧菌 BDJOlBdellovibrio sp.BDJOl)于 2008 年 I 月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208011 ;所述BDJ02于2008年I月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208012 ;所述BDMOl于2008年4月28日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208066 ;所述BDSOl于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209169 ;所述BDS02于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209170 ;所述BDSM08于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209171 ;所述BDFM05于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO:M209172。
[0019] 步骤(1)所述收集菌体的方式优选为通过离心分离得到,离心条件为2~15°C,5000 ~8000rpm 离心 15 ~35min ; [0020] 步骤(1)所述宿主菌悬浮液的浓度优选为IO17~1022cfu/mL ;
[0021] 步骤(2)所述蛭弧菌斑采用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请)进行分离得到。
[0022] 步骤(1)~(3)任一项所述磷酸盐缓冲液优选为浓度是0.1~0.3mol/L, pH是
7.2~7.6的磷酸盐缓冲液;
[0023] 步骤(2)所述蛭弧菌游泳体浓缩液的浓度优选为IO6~109pfu/mL ;
[0024] 步骤(3)所述蛭弧菌来源于咸水环境时,所述溶剂为DNB液体培养基或蒸馏水,所述氯化钠溶液的质量体积比浓度为25~30g/L ;
[0025] 步骤(3)所述蛭弧菌来源于咸淡水环境时,所述溶剂为DNB液体培养基或蒸馏水,所述氯化钠溶液的质量体积比浓度为5~10g/L ;
[0026] 步骤(3)所述蛭弧菌来源于淡水环境时,不加氯化钠;
[0027] 步骤(3)所述灭菌的条件优选为121°C灭菌20min ;
[0028] 步骤(3)所述蛭弧菌制剂的浓度为IO8~1012pfu/mL ;
[0029] 步骤(3)所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸馏水中,调节pH值至7.2~7.6。
[0030] 一种蛭弧菌制剂,由所述的蛭弧菌制剂的发酵方法制备得到;
[0031] 所述蛭弧菌制剂可以通过裂解其它致病菌或潜在致病菌而达到防治病菌害的目的。所述的蛭弧菌制剂不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体制剂、蛭质体制剂以及它们的按比例混合的制剂。
[0032] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0033] (I)本发明所述的发酵方法中采用的宿主菌均为有益的或对环境无害的革兰氏阳性菌。这样,一方面,可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革兰氏阴性菌的能力,而且实验证明,用该方法制得的蛭弧菌制剂对致病菌的裂解能力有了一定的提高;另一方面,所制得的蛭弧菌制剂可以直接使用,无需经过更多的发酵后处理;再者,因为宿主都是有益菌或是对环境无害的菌株,该制剂的使用范围也大大的增加。
[0034] (2)本发明在得到高浓度蛭弧菌菌液的同时,相对也缩短了发酵周期,这样有效的解决了发酵时间过长而导致的能源消耗过大,生产成本过高的问题,得到的蛭弧菌制剂不仅成本低,而且活性高。
附图说明
[0035] 图1是以两种不同宿主(枯草芽孢杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的裂解能力一时间图。
[0036] 图2是以两种不同宿主(纳豆芽孢杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对单核增生李斯特菌和猪霍乱沙门氏菌的裂解能力一时间图。
[0037] 图3是以两种不同宿主(两歧双歧杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对猪链球菌II型和乳房链球菌的裂解能力一时间图。
[0038] 图4是以两种不同宿主(粪肠球菌和猪霍乱沙门氏菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对表皮葡萄球菌和大肠杆菌的裂解能力一时间图。
[0039] 图5是以两种不同宿主(保加利亚乳杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对类马链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解能力一时间图。
[0040] 图6是以两种不同宿主(乳酸片球菌和嗜水气单胞菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对乳房链球菌和大肠杆菌的裂解能力一时间图。
[0041] 图7是以两种不同宿主(乳酸链球菌和猪链球II型)发酵制得的蛭弧菌制剂对猪霍乱沙门氏菌和表皮葡萄球菌的裂解能力一时间图。
[0042] 图8是以两种不同宿主(屎肠球菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌的裂解能力一时间图。
[0043] 图9是以两种不同宿主(地衣芽孢杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对嗜水气单胞菌和类马链球菌的裂解能力一时间图。
[0044] 图10是以两种不同宿主(嗜酸乳杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌的裂解能力一时间图。
[0045] 图11是以两种不同宿主(干酪乳杆菌和嗜水气单胞菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对类马链球菌和大肠杆菌的裂解能力一时间图。
[0046] 图12是以两种不同宿主(乳酸乳杆菌和猪链球II型)发酵制得的蛭弧菌制剂对表皮葡萄球菌和嗜水气单胞菌的裂解能力一时间图。
[0047] 图13是以两种不同宿主(植物乳杆菌和猪霍乱沙门氏菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对无乳链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解能力一时间图。
[0048] 图14是以两种不同宿主(戊糖片球菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对乳房链球菌和链球菌II型的裂解能力一时间图。
具体实施方式
[0049] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
[0050] 实施例1
[0051] 分别以枯草芽孢杆菌(菌种编号:GIM1.136,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和大肠杆菌(Escherichia coli,菌种编号:GM1.137,来源于广东省微生物菌种保藏中心)为宿主菌制备蛭弧菌制剂A`和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:[0052] (I)枯草芽孢杆菌悬液的制备
[0053] 将枯草芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中(蛋白胨IOg,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2),置于33°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,5000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.6),得到浓度为1019cfu/mL的枯草芽孢杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0054] 同上方法,制备浓度为1019cfu/mL的大肠杆菌悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0055] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0056] 在磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.6)中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度 为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水1000mL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJ02(于2008年I月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208012)斑,然后将此培养液在30°C培养48h,再在4°C,5000rpm离心35min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C, 13000rpm离心30min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.6的磷酸钠钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,置于2°C冰箱保存备用;
[0057] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0058] 在DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的
2.5%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤
(1)制备的枯草芽孢杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,发酵培养基中的枯草芽孢杆菌的起始浓度为1012cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在28°C ;加入枯草芽孢杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在28% ;培养过程中加两次枯草芽孢杆菌悬浮液,每次加入枯草芽孢杆菌悬浮液的间隔时间15h,每次加入枯草芽孢杆菌悬浮液的量以新加入的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中的浓度为1012cfu/mL为准,发酵培养48h即制成浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0059] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤
(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,制得浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0060] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌均有很好的裂解效果。分别以对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium,菌株编号:GM1.237,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,菌株编号:GIM1.142,来源于广东省微生物菌种保藏中心)的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液,分别加入常规培养方法得到鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的菌体沉淀,每种菌各有两瓶。调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(10ncfu/mL)。在两瓶含有鼠伤寒沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有金黄色葡萄球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811这九个时刻分别取样,按1(^~1(^1的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图1所示。从图1可知,与用大肠杆菌发酵得到的蛭弧菌制剂B相比,用枯草芽孢杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的金黄色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B好。另外,由枯草芽孢杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0061] 实施例2
[0062] 以纳豆芽孢杆菌(菌种编号:CGMCC1.1086,来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0063] ( I)纳豆芽孢杆菌悬液的制备
[0064] 将纳豆芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于35°C摇床中培养15h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,6000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.1mol/L,pH7.4),得到浓度为1018cfu/mL的纳豆芽孢杆菌悬浮液,然后置于2°C冰箱中保存备用;
[0065] 同上方法,制备浓度为1018cfu/mL的大肠杆菌悬液,置于2°C冰箱中保存备用;
[0066] ( 2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0067] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.lmol/L,pH7.4)中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1013cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水1000mL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧菌BDR)2(于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208009)斑,然后将此培养液在30°C培养45h,再在4°C,6000rpm离心25min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,14000rpm离心28min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.lmol/L、pH7.4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0068](3)蛭弧菌制剂的制备
[0069] 将DNB液体培养基装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的纳豆芽孢杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,发酵培养基中的纳豆芽孢杆菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在29°C;加入纳豆芽孢杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的pH值控制在7.4 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在28% ;培养过程中加两次纳豆芽孢杆菌悬浮液,每次加入纳豆芽孢杆菌悬浮液的间隔时间16h,每次加入纳豆芽孢杆菌悬浮液的量为以新加入的纳豆芽孢杆菌在发酵培养基中的浓度为1013cfu/mL为准,发酵培养45h即制成浓度为I X lO'fu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0070] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,制得浓度为I X 1010pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0071] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌等致病菌都有很好的裂解效果。分别以对革兰氏为阳性的单核增生李斯特菌(Listeriamonocytohenes,菌株编号:GIM1.228,来源于广东省微生物菌种保藏中心)的裂解和对革兰氏为阴性的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella enterica,菌株编号:GM1.244,来源于广东省微生物菌种保藏中心)的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别加入常规培养方法得到单核增生李斯特菌和猪霍乱沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌各两瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(101(lCfu/mL)。在两瓶含有单核增生李斯特菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有猪霍乱沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂Blm,于30°C,200rpm的摇床上培养。在Oh、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h这八个时刻分别取样,按KT1~10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图2所示。从图2可知,与用大肠杆菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用纳豆芽孢杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪霍乱沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的单核增生李斯特菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由纳豆芽孢杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0072] 实施例3
[0073] 分别以两歧双歧杆菌(菌种编号:GM1.169,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和鼠伤寒沙门氏菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0074] ( 1)两歧双歧杆菌悬液的制备
[0075] 将两歧双歧杆菌接种于PTYG培养基中,置于37°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在8°C条件下,7000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.3mol/L, pH7.5),得到浓度为1022cfu/mL的两歧双歧杆菌悬浮液,然后置于8°C冰箱中保存备用;
[0076] 同上方法,用营养肉汤培养基制备浓度为1022cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌悬液,置于8 C冰箱中保存备用;
[0077] ( 2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0078] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.3mol/L, pH7.5)中加入步骤(1)制备的鼠伤寒沙门氏菌悬浮液,调整鼠伤寒沙门氏菌的浓度为101(lCfU/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水1000mL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自土壤的蛭弧菌BDS02(于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209170)斑,然后将此培养液在30°C培养50h,再在8 °C,7000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在8°C, 16000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.3mol/L、pH7.5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,置于15°C冰箱保存备用;
[0079] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0080] 在DNB液体培养基加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的0.7%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的两歧双歧杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,发酵培养基中的两歧双歧杆菌的起始浓度为1015cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入两歧双歧杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.2 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在22% ;培养过程中加一次两歧双歧杆菌悬浮液,每次加入两歧双歧杆菌悬浮液的间隔时间12h,每次加入两歧双歧杆菌悬浮液的量以新加入的两歧双歧杆菌在发酵培养基中的浓度为1015cfu/mL为准,发酵培养36h即制成浓度为5 X 10npfu/mL的蛭弧菌制剂A。 [0081] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的鼠伤寒沙门氏菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,制得浓度为5X 10npfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0082] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对乳房链球菌、沙门氏菌、猪链球菌等致病菌均有裂解效果。分别以对革兰氏为阴性的猪链球菌II型(Streptococcus suis,菌株编号:CVCC3306,来源于国家兽医微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阳性的乳房链球菌(Streptococcus uberis,菌株编号:700407,来源于上海三踏科技有限公司)的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别加入常规培养方法得到猪链球菌II型和乳房链球菌的菌体沉淀,每种菌各两瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(10ncfu/mL)o在两瓶含有猪链球菌II型的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有乳房链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 这九个时刻分别取样,按ΙΟ—1~10_η的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图3所示。从图3可知,与用鼠伤寒沙门氏菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用两歧双歧杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪链球菌II型有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的乳房链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由两歧双歧杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0083] 实施例4
[0084] 分别以幾肠球菌(Enterococcus faecalis,菌种编号:CGMCC1.131,来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)和猪霍乱沙门氏菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:[0085] (1)粪肠球菌悬液的制备
[0086] 将粪肠球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于30°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,6000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH 7.4),得到浓度为102°cfu/mL的粪肠球菌悬浮液,然后置于2~4°C冰箱中保存备用;
[0087] 同上方法,制备浓度为102°cfu/mL的猪霍乱沙门氏菌悬液,置于2~4°C冰箱中保存备用;
[0088] ( 2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0089] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.4)中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙门氏菌悬浮液,调整猪霍乱沙门氏菌的浓度为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“ 一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉
3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.lg,蒸馏水1000mL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自土壤的蛭弧菌BDFM05(于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209172)斑,然后将此培养液在30°C培养38h,再在4°C,6000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,15000rpm离心22min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDFM05游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0090] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0091] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.6),装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的粪肠球菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDFM05游泳体浓缩液,发酵培养基中的粪肠球菌的起始浓度为1014cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C;加入粪肠球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.2 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在30% ;培养过程中加两次粪肠球菌悬浮液,每次加入粪肠球菌悬浮液的间隔时间18h,每次加入粪肠球菌悬浮液的量以新加入的粪肠球菌在发酵培养基中的浓度为1014cfu/mL为准,发酵培养48h即制成浓度为5 X 101Qpfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0092] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙门氏菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDFM05游泳体浓缩液,制得浓度为5X lO'fu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0093] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分别以对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,菌株编号:GIM1.143,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阴性的大肠杆菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到表皮葡萄球菌和大肠杆菌的菌体沉淀,每种菌两瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IO12Cfu/mL)。在两瓶含有表皮葡萄球菌的缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL;同样,在两瓶含有大肠杆菌的缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 这九个时刻分别取样,按ΙΟ—1~10_12的稀释倍数进行稀释,再各取IOO μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图4所示。从图4可知,与用猪霍乱沙门氏菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用粪肠球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的大肠杆菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由粪肠球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0094] 实施例5
[0095] 分别以保加利亚乳杆菌(菌种编号:GM1.80,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0096] ( I)保加利亚乳杆菌悬液的制备
[0097] 将保加利亚乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于37°C摇床中培养20h,使其处于对数生长期,培养液在10°C条件下,6000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.3mol/L,pH7.3),得到浓度为1017cfu/mL的保加利亚乳杆菌悬浮液,然后置于2~4°C冰箱中保存备用;
[0098] 同上的方法,制备浓度为1017cfu/mL的大肠杆菌悬液,置于2~4°C冰箱中保存备用;
[0099] ( 2)蛭弧菌游 泳体浓缩液的制备:
[0100] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.3mol/L,pH7.3)中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1013cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.Sg,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJ02 (于2008年I月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208012)斑,然后将此培养液在30°C培养40h,再在10°C,6000rpm离心25min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在15°C, 15000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.3mol/L、pH7.3的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,置于2°C冰箱保存备用;
[0101] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0102] 在蒸馏水中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为蒸馏水体积的2.8%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的保加利亚乳杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,发酵培养基中的保加利亚乳杆菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为10pfU/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在28°C ;加入保加利亚乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的pH值控制在7.6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在21% ;培养过程中加2次保加利亚乳杆菌悬浮液,每次加入保加利亚乳杆菌悬浮液的间隔时间18h,每次加入保加利亚乳杆菌悬浮液的量以新加入的保加利亚乳杆菌在发酵培养基中的浓度为1013cfu/mL为准,发酵培养40h即制成浓度为I X 10npfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0103] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤
(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,制得浓度为I X 10npfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0104] 本制剂对气单胞菌、沙门氏菌、类马链球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分别以对革兰氏为阳性的类马链球菌(Streptococcus equinus,菌株编号:cvccl925,来源于国家兽医微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到类马链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌两瓶,调节两瓶缓冲液的菌体浓度一致(10ncfu/mL)。在两瓶含有类马链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有鼠伤寒沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL菌,于30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h这八个时刻分别取样,按KT1~10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图5所示。从图5可知,与用大肠杆菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用保加利亚乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的类马链球菌类马链球菌裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由保加利亚乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0105] 实施例6
[0106] 分别以乳酸片球菌(菌种编号:GIM1.263,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,菌种编号:GIM1.172,来源于广东省微生物菌种保藏中心)为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和`蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0107] (I)乳酸片球菌悬液的制备
[0108] 将乳酸片球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于30°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在5°C条件下,7000rpm离心15min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.1mol/L,pH7.4),得到浓度为1022cfu/mL的乳酸片球菌悬浮液,然后置于15°C冰箱中保存备用;
[0109] 同上方法,制备浓度为1022cfu/mL的嗜水气单胞菌悬液,置于15°C冰箱中保存备用;
[0110] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0111] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.lmol/L, pH7.4)中加入步骤(1)制备的嗜水气单胞菌悬浮液,调整嗜水气单胞菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧菌BDR)3(于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208010 )斑,然后将此培养液在30 °C培养54h,再在5 °C,7000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在5°C,15000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.lmol/L、pH7.4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDF03游泳体浓缩液,置于10°C冰箱保存备用;
[0112] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0113] 将蒸馏水装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的乳酸片球菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF03游泳体浓缩液,发酵培养基中的乳酸片球菌的起始浓度为1014cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为10pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入乳酸片球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.4 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在24% ;培养过程中加两次乳酸片球菌悬浮液,每次加入乳酸片球菌悬浮液的间隔时间15h,每次加入乳酸片球菌悬浮液的量以新加入的乳酸片球菌在发酵培养基中的浓度为1014cfu/mL,发酵培养45h即制成浓度为5 X IO8的蛭弧菌制剂A。
[0114] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的嗜水气单胞菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF03游泳体浓缩液,制得浓度为5X IO8的蛭弧菌制剂B。
[0115] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、乳房链球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分别以对乳房链球菌和大肠杆菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到乳房链球菌和大肠杆菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(101(lCfu/mL)。在两瓶含有乳房链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL;同样,在两瓶含有大肠杆菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811这九个时刻分别取样,按1(^ ~10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图6所示。从图6可知,与用嗜水气单胞菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用乳酸片球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的大肠杆菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的乳房链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由乳酸片球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0116] 实施例7
[0117] 分别以乳酸链球菌(菌种编号:GIM1.156,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和猪链球菌II型为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0118] (I)乳酸链球菌悬液的制备
[0119] 将乳酸链球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨IOg,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于37°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,6000rpm离心27min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.5),得到浓度为102°cfu/mL的乳酸链球菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0120] 同上方法,制备浓度为102°cfu/mL的猪链球菌II型悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0121] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0122] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.5)中加入步骤(1)制备的猪链球菌II型悬浮液,调整猪链球菌II型的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水1000mL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离土壤的蛭弧菌BDSM08(于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209171)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在4°C,6000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C, 16000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为107pfu/mL,得到蛭弧菌BDSM08游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0123] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0124] 在pH值为7.2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的1.5%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的乳酸链球菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDSM08游泳体浓缩液,发酵培养基中的乳酸链球菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入乳酸链球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.5 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在27% ;培养过程中加2次乳酸链球菌悬浮液,每次加入乳酸链球菌悬浮液的间隔时间14h,每次加入乳酸链球菌悬浮液的量以新加入的乳酸链球菌在发酵培养基中的浓度为1013cfu/mL为准,发酵培养42h即制成浓度为5X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0125] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪链球菌II型悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDSM08游泳体浓缩液,制得浓度为5X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0126] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分别以对猪霍乱沙门氏菌和表皮葡萄球菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到猪霍乱沙门氏菌和表皮葡萄球菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(101(lcfu/mL)。在两瓶含有猪霍乱沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有表皮葡萄球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h这九个时刻分别取样,按IO-1~10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图7所示。从图7可知,与用猪链球菌II型发酵的蛭弧菌制剂B相比,用乳酸链球`菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪霍乱沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由乳酸链球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0127] 实施例8
[0128]分别以屎肠球菌(菌种编号:CGMCC1.2136,来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0129] (I)屎肠球菌悬液的制备
[0130] 将屎肠球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨IOg,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于32°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,5000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.5),得到浓度为1018cfu/mL的屎肠球菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0131] 同上方法,制备浓度为1018cfu/mL的大肠杆菌悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0132] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0133] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.5)中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水1000mL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJ02(于2008年I月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208012)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在4°C,6000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C, 16000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为106pfu/mL,得到蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0134] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0135] 在pH值为7.2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的2.7%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的屎肠球菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,发酵培养基中的屎肠球菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入屎肠球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.3 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在26% ;培养过程中加两次屎肠球菌悬浮液,每次加入屎肠球菌悬浮液的间隔时间14h,每次加入屎肠球菌悬浮液的量以新加入的屎肠球菌在发酵培养基中的浓度为1013cfu/mL为准,发酵培养42h即制成浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0136] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,制得浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0137] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌等致病菌均有裂解效果。分别以对单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(10ncfu/mL)。在两瓶含有单核增生李斯特菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有鼠伤寒沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂 BlmL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h 这八个时刻分别取样,按ΙΟ—1~10_η的稀释倍数进行稀释,再各取IOO μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图8所示。从图8可知,与用大肠杆菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用屎肠球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的单核增生李斯特菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由屎肠球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0138] 实施例9[0139] 分别以地衣芽孢杆菌(菌种编号:GM1.182,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0140] ( I)地衣芽孢杆菌悬液的制备
[0141] 将地衣芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2),置于33°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,5000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为
0.2mol/L, pH7.6),得到浓度为1019cfu/mL的地衣芽孢杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0142] 同上方法,制备浓度为1019cfu/mL的大肠杆菌悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0143] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0144] 在磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.6)中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水1000mL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDMOl(于2008年4月28日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208066)斑,然后将此培养液在30°C培养48h,再在4°C,5000rpm离心30min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C, 13000rpm离心30min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.6的磷酸钠钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDMOl游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0145] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0146] 在DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的
3.0%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤
(I)制备的地衣芽孢杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDMOl游泳体浓缩液,发酵培养基中的地衣芽孢杆菌的起始浓度为1012cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入地衣芽孢杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.2 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在28% ;培养过程中加两次地衣芽孢杆菌悬浮液,每次加入地衣芽孢杆菌悬浮液的间隔时间15h,每次加入地衣芽孢杆菌悬浮液的量以新加入的地衣芽孢杆菌在发酵培养基中的浓度为1012cfu/mL为准,发酵培养48h即制成浓度为I X 1012pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0147] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDMOl游泳体浓缩液,制得浓度为I X 1012pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0148] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌均有很好的裂解效果。分别以对革兰氏为阴性的嗜水气单胞菌和对革兰氏为阳性的类马链球菌(Streptococcus equinus,菌株编号:cvccl925,来源于国家兽医微生物菌种保藏中心)的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液,分别加入常规培养方法得到嗜水气单胞菌和类马链球菌的菌体沉淀,每种菌各有两瓶。调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(1010cfu/mL)o在两瓶含有嗜水气单胞菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有类马链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂 BlmL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h这九个时刻分别取样,按KT1~10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图9所示。从图9可知,与用大肠杆菌发酵得到的蛭弧菌制剂B相比,用地衣芽孢杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的嗜水气单胞菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的类马链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B好。另外,由地衣芽孢杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0149] 实施例10
[0150] 分别以嗜酸乳杆菌(菌种编号:GM1.208,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0151] (I)嗜酸乳杆菌的制备
[0152] 将嗜酸乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于32°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,5000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.5),得到浓度为1017cfu/mL的嗜酸乳杆菌悬浮液,然后置于8°C冰箱中保存备用;
[0153] 同上方法,制备浓度为1017cfu/mL的大肠杆菌悬液,置于8°C冰箱中保存备用;
[0154] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0155] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.5)中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.Sg,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现曬菌斑)培养出来的分离自土壤的蛭弧菌BDS02 (于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209170)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在4°C,6000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在15°C, 13000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为107pfu/mL,得到蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,置于6°C冰箱保存备用;
[0156] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0157] 将pH值为7.2的DNB液体培养基中装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的嗜酸乳杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌K)S02游泳体浓缩液,发酵培养基中的嗜酸乳杆菌的起始浓度为101(lCfu/mL,蛭弧菌起始浓度为10pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入嗜酸乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.5 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在20% ;培养过程中加两次嗜酸乳杆菌悬浮液,每次加入嗜酸乳杆菌悬浮液的间隔时间14h,每次加入嗜酸乳杆菌悬浮液的量以新加入的嗜酸乳杆菌在发酵培养基中的浓度为1013cfu/mL为准,发酵培养42h即制成浓度为I X 108pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0158] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤
(2)制备的蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,制得浓度为I X 108pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0159] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分别以对金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(10ncfu/mL)。在两瓶含有金黄色葡萄球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有猪霍乱沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h这八个时刻分别取样,按KT1~10_n的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图10所示。从图10可知,与用大肠杆菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用嗜酸乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪霍乱沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的金黄色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由嗜酸乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0160] 实施例11
[0161] 分别以干酪乳杆菌(菌种编号:GM1.159,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和嗜水气单胞菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0162] (I)干酪乳杆菌的制备
[0163] 将干酪乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于30°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在5°C条件下,8000rpm离心15min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.1mol/L,pH7.4),得到浓度为1022cfu/mL的干酪乳杆菌悬浮液,然后置于15°C冰箱中保存备用;[0164] 同上方法,制备浓度为1022cfu/mL的嗜水气单胞菌悬液,置于15°C冰箱中保存备用;
[0165] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0166] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.lmol/L, pH7.4)中加入步骤(1)制备的嗜水气单胞菌悬浮液,调整嗜水气单胞菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧菌BDR)2(于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208009)斑,然后将此培养液在30°C培养54h,再在5°C,7000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在5°C,20000rpm离心15min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.lmol/L、pH7.4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为107pfu/mL,得到蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,置于2°C冰箱保存备用;
[0167] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0168] 将蒸馏水装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的干酪乳杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,发酵培养基中的干酪乳杆菌的起始浓度为1014cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在29°C ;加入干酪乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.2 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在30%;培养过程中加两次干酪乳杆菌悬浮液,每次加入干酪乳杆菌悬浮液的间隔时间15h,每次加入干酪乳杆菌悬浮液的量以新加入的干酪乳杆菌在发酵培养基中的浓度为1014cfu/mL为准,发酵培养45h即制成`浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0169] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的嗜水气单胞菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,制得浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0170] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、类马链球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分别以对类马链球菌和大肠杆菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到类马链球菌和大肠杆菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(1012cfu/mL)o在两瓶含有类马链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有大肠杆菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211这八个时刻分别取样,按KT1~10-12的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图11所示。从图11可知,与用嗜水气单胞菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用干酪乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的大肠杆菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的类马链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由干酪乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0171] 实施例12
[0172] 分别以乳酸乳杆菌(菌种编号:ATCC12315,来源于American Type CultureCollection)和猪链球菌II型为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0173] (I)乳酸乳杆菌悬液的制备
[0174] 将乳酸乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于37°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,6000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.5),得到浓度为102°cfu/mL的乳酸乳杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0175] 同上方法,制备浓度为102°cfu/mL的猪链球菌II型悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0176] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0177] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.5)中加入步骤(1)制备的猪链球菌II型悬浮液,调整猪链球菌II型的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑。)培养出来的分离土壤的蛭弧菌BDSOI(于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209169)斑,然后将 此培养液在40°C培养20h,再在4°C,6000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,12000rpm离心40min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDS01游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0178] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0179] 在pH值为7.2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的0.5%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的乳酸乳杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDS01游泳体浓缩液,发酵培养基中的乳酸乳杆菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入乳酸乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.2~7.6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在23% ;培养过程中加I次乳酸乳杆菌悬浮液,每次加入乳酸乳杆菌悬浮液的间隔时间18h,每次加入乳酸乳杆菌悬浮液的量以新加入的乳酸乳杆菌在发酵培养基中的浓度为1013cfu/mL为准,发酵培养42h即制成浓度为5X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0180] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪链球菌II型悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDS01游泳体浓缩液,制得浓度为5X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0181] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分别以对嗜水气单胞菌和表皮葡萄球菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到嗜水气单胞菌和表皮葡萄球菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(10ncfu/mL)。在两瓶含有嗜水气单胞菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有表皮葡萄球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811这九个时刻分别取样,按KT1~10_n的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图12所示。从图12可知,与用猪链球菌II型发酵的蛭弧菌制剂B相比,用乳酸乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的嗜水气单胞菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由乳酸乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0182] 实施例13[0183] 分别以植物乳杆菌(菌种编号:GIM1.140,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和猪霍乱沙门氏菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0184] (I)植物乳杆菌的制备
[0185] 将植物乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于30°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在8°C条件下,6000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.4),得到浓度为102°cfu/mL的植物乳杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0186] 同上方法,制备的浓度为102°cfu/mL猪霍乱沙门氏菌悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0187] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0188] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.4)中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙门氏菌悬浮液,调整猪霍乱沙门氏菌的浓度为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50° C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28。C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧菌BDR)1(于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208008)斑,然后将此培养液在30°C培养20h,再在2°C,8000rpm离心15min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,15000rpm离心22min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为106pfu/mL,得到蛭弧菌BDR)1游泳体浓缩液,置于15°C冰箱保存备用;
[0189] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0190] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.6),装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的植物乳杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDFOl游泳体浓缩液,发酵培养基中的植物乳杆菌的起始浓度为101(lCfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C;加入植物乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.4 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在30% ;培养过程中加两次植物乳杆菌悬浮液,每次加入植物乳杆菌悬浮液的间隔时间18h,每次加入植物乳杆菌悬浮液的量以新加入的植物乳杆菌在发酵培养基中的浓度为101QCfu/mL为准,发酵培养48h即制成浓度为5X 101Qpfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0191] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙门氏菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌 BDFOl游泳体浓缩液,制得浓度为5X lO'fu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0192] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、无乳链球菌等致病菌均有裂解效果。分别以对无乳链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到无乳链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌两瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(1010cfu/mL)o在两瓶含有无乳链球菌的缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有鼠伤寒沙门氏菌的缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C, 200rpm的摇床上培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211这九八个时刻分别取样,按1(^~10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图13所示。从图13可知,与用猪霍乱沙门氏菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用植物乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的无乳链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由植物乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0193] 实施例14
[0194] 分别以戊糖片球菌(菌种编号:CGMCC1.2695,来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0195] (I)戊糖片球菌的制备
[0196] 将戊糖片球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH7.4±0.2)中,置于32°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下,5000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH7.5),得到浓度为1018cfu/mL的戊糖片球菌悬浮液,然后置于8°C冰箱中保存备用;
[0197] 同上方法,制备浓度为1018cfu/mL的大肠杆菌悬液,置于8°C冰箱中保存备用;
[0198] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0199] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L, pH7.5)中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为200910042274.6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3.5mL50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7.2,琼脂粉3.5g)混合均匀,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.lg,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJOl(Bdellovibrio sp.BDJOl)(于2008年I月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208011)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在8°C, 5000rpm离心30min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C, 16000 rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDJOl游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0200] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0201] 在pH值为7.2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的2.5%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的戊糖片球菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDJOl游泳体浓缩液,发酵培养基中的戊糖片球菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入戊糖片球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7.6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在25% ;培养过程中加3次戊糖片球菌悬浮液,每次加入戊糖片球菌悬浮液的间隔时间12h,每次加入戊糖片球菌悬浮液的量以新加入的戊糖片球菌在发酵培养基中的浓度为IO13Cfu/mL为准,发酵培养48h即制成浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。 [0202] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤
(2)制备的蛭弧菌BDJOl游泳体浓缩液,制得浓度为I X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0203] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对乳房链球菌、沙门氏菌、猪链球菌II型等致病菌均有裂解效果。分别以对乳房链球菌和猪链球菌II型的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到乳房链球菌和猪链球菌II型的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(101(lCfu/mL)。在两瓶含有乳房链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL ;同样,在两瓶含有猪链球菌II型的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂AlmL和蛭弧菌制剂BlmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211这八个时刻分别取样,按1(^~10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图14所示。从图14可知,与用大肠杆菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用戊糖片球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪链球菌II型有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的乳房链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由戊糖片球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0204] 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于包括以下步骤: (1)宿主菌悬液的制备: 将宿主菌培养至对数生长期,收集菌体,用磷酸盐缓冲液调整浓度,得到浓度为IO17~1022cfu/mL的宿主菌悬浮液,然后置于2~15°C中保存备用;所述宿主菌为戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus) CGMCC1.2695 ; (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备: 在磷酸盐缓冲液中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液,调整宿主菌的浓度为101°~1015cfu/mL,再接入蛭弧菌斑,然后将此培养液在20~40°C培养20~60h,再在2~15°C,5000~8000rpm离心15~35min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在2~15 °C,12000~20000rpm离心15~40min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入磷酸盐缓冲液调整蛭弧菌游泳体的浓度为IO6~109pfu/mL,得到蛭弧菌游泳体浓缩液,置于2~15°C保存备用;所述蛭弧菌为BDJ01,BDJOl于2008年I月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208011 ; (3)蛭弧菌制剂的制备: 将溶剂灭菌,得到发酵培养基;在发酵培养基中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌游泳体浓缩液,使宿主菌起始浓度为101°~1015cfu/mL,蛭弧菌游泳体起始浓度为IO1~103pfu/mL,进行发酵;发酵温度控制在28~30°C,pH值控制在7.2~7.6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在20%~30% ;发酵过程中加I~3次宿主菌悬浮液,每次加入宿主菌悬浮液的间隔时间12~18h,每次加入宿主菌悬浮液的量以新加入的宿主菌在发酵培养基中的浓度为101°~1015cfu/mL为准;发酵培养36~48h即制成蛭弧菌制剂;所述溶剂为DNB液体培养基、蒸馏水或磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一`种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(1)所述收集菌体的方式为通过离心分离得到,离心条件为2~15°C, 5000~8000rpm离心15~35min ;所述宿主菌悬浮液的浓度为IO17~1022cfu/mL ;步骤(1)~(3)任一项所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1~0.3mol/L, pH为7.2~7.6 ;步骤(2)所述蛭弧菌游泳体浓缩液的浓度为IO8 ~1012pfu/mL。
3.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(3)所述灭菌的条件为121°C灭菌20min ;所述蛭弧菌制剂的浓度为IO8~1012pfu/mL ;所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸馏水中,调节pH值至7.2~7.6。
4.一种蛭弧菌制剂,由权利要求1~3任一项所述方法制备得到。
5.根据权利要求4所述的蛭弧菌制剂在制备防治乳房链球菌和猪链球菌II型药物中的应用。
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