CN103952309A - 一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。该方法包括以下步骤：制备蛭弧菌微生物制剂，将蛭弧菌微生物制剂、不同种类和/或不同浓度的保护剂混合，再以DNB培养基填充，得到混合液；将混合液置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃下进行加速试验；定期取样，检测混合液中蛭弧菌的浓度；运用阿伦尼乌斯方程及记录的数据计算出蛭弧菌微生物制剂的保质期；通过比对保质期来确定保护剂的效果。其中保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的至少一种。通过该方法，明显延长高浓度蛭弧菌微生物制剂活力的衰减时间，提高蛭弧菌微生物制剂的保质期；并对不同的保护剂保质效果进行对比，筛选出最佳的保质方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物学领域，特别涉及一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。
背景技术
目前，对于蛭弧菌微生物制剂的保质期普遍存在保质期短的缺点，在保质期内随着时间的推移蛭弧菌大量死亡。然而，在现实的实验和应用中，我们需要能够提供有一定浓度和活力的蛭弧菌以便这些菌种能够较好地投入到前期实验和应用中。因此本发明意在研究一种能够提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。目前对于蛭弧菌制剂产品的长期保质还没有报道过可行的方案，本研究方法的探索对于延长蛭弧菌微生物制剂货架期具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。该方法弥补了实际应用中蛭弧菌微生物制剂保质期普遍较短的缺陷。
本发明的另一目的在于提供所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，包括以下步骤：
在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂。
所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDSM08，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209171。
所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，包括以下步骤：在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂，再以无菌DNB（dilutednutrient broth）培养基填充。
所述的蛭弧菌微生物制剂优选通过以下步骤获得：
①DNB培养基的制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白水解物，0.1g/L的酵母提取物，30g/L的海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调整pH至7.5，115℃高温蒸汽灭菌20min；
②宿主菌悬浮液的制备：在LB（Luria-Bertani broth）液体培养基中接种嗜水气单胞菌（购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172），培养，离心，弃上清收集菌体，每100mL培养液收集的菌体用2～3mL DNB培养基悬浮，得到宿主菌悬浮液，4℃保存备用；
③蛭弧菌的活化：取用实验室保藏的蛭弧菌，将蛭弧菌保藏液加入到DNB培养基中，再按照50mL DNB培养基中接种500μL由步骤②制备的宿主菌悬浮液的比例接种宿主菌悬浮液，培养，得到活化后的蛭弧菌；
④蛭弧菌微生物制剂的制备：将活化后的蛭弧菌用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的生长情况；挑取有规则的单个噬菌斑，接种到DNB培养基中，同时按照50mL DNB培养基中接种500μL由步骤②制备的宿主菌悬浮液的比例接种宿主菌悬浮液，培养，得到蛭弧菌种子液，将蛭弧菌种子液进行离心，取上清液，得到蛭弧菌微生物制剂；
⑤用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的浓度及生长情况，得到浓度为2.1×1011～5.74×1012pfu（plaque-forming unit）/mL的蛭弧菌微生物制剂，用该蛭弧菌微生物制剂进行后续的加速试验；
步骤②中所述的LB液体培养基的配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，pH7.4，121℃高压灭菌15min后保存备用；
步骤②中所述的培养的条件优选为250rpm、30℃培养24h；
步骤②中所述的离心的条件优选为4℃、6000rpm离心15min；
步骤③中所述的蛭弧菌保藏液与DNB培养基的体积比优选为1:（25～50）；
步骤③中所述的培养的条件优选为28～35℃、100～150rpm恒温培养48～72h；将实验室保种的蛭弧菌接种到新鲜的DNB培养基中，置于30℃、150rpm的恒温摇床中培养72h；取出培养后的蛭弧菌，用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的浓度；检测结果发现蛭弧菌浓度达到1012数量级，具有较好的培养效果；
步骤④中所述的培养的条件优选为28～35℃、100～150rpm恒温培养48～72h；将实验室保种的蛭弧菌接种到新鲜的DNB培养基中，置于30℃、150rpm的恒温摇床中培养72h；取出培养后的蛭弧菌，用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的浓度；检测结果发现蛭弧菌浓度达到1012数量级，具有较好的培养效果；
步骤④中所述的将蛭弧菌种子液进行离心的条件优选为4℃、6000rpm离心20min；
所述的保护剂优选为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的至少一种；
所述的保护剂优选为终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～15%蔗糖+终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～18%内消旋肌醇、终浓度1%～15%棉子糖、终浓度1%～20%葡萄糖或终体积百分比1%～25%甘油；
所述的保护剂优选为终浓度5%谷氨酸钠、终浓度5%蔗糖+终浓度5%谷氨酸钠、终浓度5%内消旋肌醇、终浓度5%棉子糖、终浓度10%葡萄糖或终体积百分比15%甘油；
所述的保护剂最佳优选为终浓度5%蔗糖+终浓度5%谷氨酸钠；
所述的保护剂的筛选方法，包括如下步骤：
（1）将上述制备好的蛭弧菌微生物制剂、不同种类和/或不同浓度的保护剂二者混合，再以无菌的DNB培养基填充，得到混合液；
（2）将混合液置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃下进行加速试验；
（3）定期取样，检测混合液中蛭弧菌的浓度；
（4）运用阿伦尼乌斯方程及步骤（3）记录的数据计算出蛭弧菌微生物制剂的保质期；通过比对保质期来确定保护剂的效果；当保质期越长，保护剂效果越好；保质期越短，保护剂效果越差；
步骤（1）中所述的保护剂优选为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的至少一种；
步骤（1）中所述的保护剂优选为终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～15%蔗糖+终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～18%内消旋肌醇、终浓度1%～15%棉子糖、终浓度1%～20%葡萄糖或终体积百分比1%～25%甘油；
步骤（1）中所述的保护剂优选为终浓度5%谷氨酸钠、终浓度5%蔗糖+终浓度5%谷氨酸钠、终浓度5%内消旋肌醇、终浓度5%棉子糖、终浓度10%葡萄糖或终体积百分比15%甘油；
步骤（1）中所述的保护剂最佳优选为终浓度5%蔗糖+终浓度5%谷氨酸钠；
步骤（1）中所述的混合液优选为蛭弧菌微生物制剂体积的10～30倍；
步骤（1）中所述的混合液更优选为蛭弧菌微生物制剂体积的20倍；
将初始浓度为5.74×1012pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂、谷氨酸钠及DNB培养基混合，得到混合液；其中混合液为蛭弧菌微生物制剂体积的20倍，得到终浓度5%谷氨酸钠及终浓度2.87×1011pfu/mL的混合液。将混合液置于25℃，一周后检测发现蛭弧菌浓度仍有10的11次方数量级，保质效果较好；
步骤（2）中所述的加速试验是加速时间的长短随温度的升高而递减；
步骤（3）中所述的定期取样的条件优选为对于25℃环境下的样品，每12h检测蛭弧菌的浓度，周期3天；对于37℃环境下的样品，每8h检测蛭弧菌的浓度，周期2天；对于45℃环境下的样品，每4h检测蛭弧菌的浓度，周期1天；对于55℃环境下的样品，每40min检测蛭弧菌的浓度，周期8h；对于65℃环境下的样品，每20min检测蛭弧菌的浓度，周期2h；
步骤（3）中所述的混合液中蛭弧菌的浓度优选通过双层平板检测法进行检测；
步骤（4）中所述的阿伦尼乌斯方程为：阿伦尼乌斯方程（Arrhenius formula）的指数定律k=e-E/RT，其对数形式为：logk=-E/2.303RT+logA；
其中，k为失活速度常数，E为表观活化能，R为摩尔气体常数，T为热力学温度，A为频率因子；以混合液中蛭弧菌的初始浓度为C0，所测的蛭弧菌浓度为C，求出各温度下保存不同时间后的相对活性（Cr=C/C0）；以lgCr对时间（t）进行回归分析，得出各温度和保护剂下蛭弧菌的失活速度常数（k），将lgk对1/T×103进行回归分析，得阿伦尼乌斯方程；此后，验证性地检测蛭弧菌微生物制剂4℃保存8周期间的浓度变化。
所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法在延长蛭弧菌微生物制剂保质期上的应用。
所述的蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDSM08为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209171。
本发明的机理是：由于正常保质期长短的验证需要很长时间来完成，所以多数科研人员通常采取加速试验检测菌种的保质期。本发明是根据阿伦尼乌斯方程，利用不同温度下加速试验的实验数据检测蛭弧菌BDSM08在不同保护剂的保护作用下的保质期。运用正常情况下保种实验验证加速试验的可行性。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
（1）本发明获得了一种有效保持高浓度蛭弧菌活力的理想方法，通过该方法明显延长高浓度蛭弧菌微生物制剂活力的衰减时间，提高蛭弧菌微生物制剂的保质期。
（2）本发明通过不同的保护剂保护效果的对比，筛选最佳的延长方法。
（3）本发明选用加速试验方式来推断蛭弧菌微生物制剂的保质期，大大缩短了常规检测保质期的时间。
附图说明
图1为实施例2加速试验步骤③蛭弧菌BDSM08的保质情况，组I的阿伦尼乌斯方程的线性回归图。
图2为实施例2加速试验步骤③蛭弧菌BDSM08的保质情况，组II的阿伦尼乌斯方程的线性回归图。
图3为实施例2加速试验步骤③蛭弧菌BDSM08的保质保况，组III的阿伦尼乌斯方程的线性回归图。
图4为实施例2加速试验步骤③蛭弧菌BDSM08的保质情况，组IV的阿伦尼乌斯方程的线性回归图。
图5为实施例2加速试验步骤③蛭弧菌BDSM08的保质情况，组V的阿伦尼乌斯方程的线性回归图。
图6为实施例2加速试验步骤③蛭弧菌BDSM08的保质情况，组VI的阿伦尼乌斯方程的线性回归图。
图7为实施例3中8周内验证性实验蛭弧菌保质期验证情况结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDSM08为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209171。蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDSM08在中国专利申请文件“申请号：200910042276.5，名称为：一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其应用”中公开。
实施例1
1、蛭弧菌微生物制剂的制备
（1）DNB培养基的制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白水解物，0.1g/L的酵母提取物，30g/L的海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调整pH至7.5，115℃高温蒸汽灭菌20min。
（2）宿主菌悬浮液的制备：在装有100mL LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4，121℃高压灭菌15min）中接种嗜水气单胞菌（Ameromonas hydrophila）（购自广东省微生物菌种保藏中心，编号GIM1.172），250rpm、30℃摇床培养24h，将培养液于4℃、6000rpm下离心15min，弃上清收集菌体，用2～3mL DNB培养基悬浮，得到宿主菌悬浮液，4℃冰箱保存备用。
（3）蛭弧菌的活化：取一管（2mL）实验室保藏的蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDSM08（保藏编号为CCTCC No.M209171），将整管蛭弧菌保藏液加入到50mLDNB培养基中，再接种500μL由步骤（2）制备的宿主菌悬浮液，30℃、150rpm的恒温摇床中培养72h，得到活化后的蛭弧菌；
（4）蛭弧菌微生物制剂的制备：将活化后的蛭弧菌用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的生长情况；挑取有规则的单个噬菌斑，接种到50mL DNB培养基中，同时加入500μL步骤（2）制备的宿主菌悬浮液，30℃、150rpm恒温培养72h，得到蛭弧菌种子液，将蛭弧菌种子液4℃、6000rpm离心20min，取上清液，得到蛭弧菌微生物制剂；
（5）用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的浓度及生长情况，得到浓度为5.74×1012pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂，用该蛭弧菌微生物制剂进行后续的加速试验；
2、蛭弧菌微生物制剂保质期的加速试验
本发明实验所用到的保护剂为终浓度（质量体积分数g/mL）1%～15%谷氨酸钠（MSG）、终浓度（质量体积分数g/mL）1%～15%蔗糖+终浓度（质量体积分数g/mL）1%～15%谷氨酸钠、终浓度（质量体积分数g/mL）1%～18%内消旋肌醇、终浓度（质量体积分数g/mL）1%～15%棉子糖、终浓度（质量体积分数g/mL）1%～20%葡萄糖、终体积百分比1%～25%甘油6种保护剂。在每种保护剂的浓度范围内选取3个不同浓度（见表1）。
①最优浓度的筛选：取步骤1中培养的蛭弧菌微生物制剂100μL，分别与新鲜DNB培养基、不同保护剂混合于2mL离心管（总体积为2mL）中，然后置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃的条件下进行加速试验。混合液中均配有终浓度为30‰的海水晶以调整环境的盐度。
②蛭弧菌浓度的检测：对于25℃环境下的样品，每12h检测蛭弧菌的浓度，周期3天；对于37℃环境下的样品，每8h检测蛭弧菌的浓度，周期2天；对于45℃环境下的样品，每4h检测蛭弧菌的浓度，周期1天；对于55℃环境下的样品，每40min检测蛭弧菌的浓度，周期8h；对于65℃环境下的样品，每20min检测蛭弧菌的浓度，周期2h。检测方法采用双层琼脂平板法检测，所有检测操作均在无菌环境下进行，且每样品均有3个平行检测。对于双层平板上的噬菌斑进行计数，记录数据。
③计算蛭弧菌微生物制剂的保质期（单位，天/d）：通过记录的数据，运用阿伦尼乌斯方程计算蛭弧菌微生物制剂浓度降低为原始浓度1%的的保质期（见表1），选择最佳的保护剂浓度。
表1
从表1可知，最佳的谷氨酸钠终浓度为5%；最佳的蔗糖+谷氨酸钠终浓度为5%+5%；最佳的内消旋肌醇终浓度为5%；最佳的棉子糖终浓度为5%；最佳的葡萄糖终浓度为10%；最佳的甘油终体积百分比为15%。
实施例2
1、蛭弧菌微生物制剂的制备。具体步骤见实施例1，发酵制备得到的浓度为5.74×1012pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂。
2、蛭弧菌微生物制剂保质期的加速试验
根据实施例1得到的保护剂的最佳浓度分别为终浓度（质量体积分数g/mL）5%谷氨酸钠（MSG）、终浓度（质量体积分数g/mL）5%蔗糖+终浓度（质量体积分数g/mL）5%谷氨酸钠、终浓度（质量体积分数g/mL）5%内消旋肌醇、终浓度（质量体积分数g/mL）5%棉子糖、终浓度（质量体积分数g/mL）10%葡萄糖、终体积百分比15%甘油6种保护剂。
①最优组别的筛选：取步骤1中培养的蛭弧菌微生物制剂100μL，分别与新鲜DNB培养基、不同保护剂混合于2mL离心管（总体积为2mL）中，然后置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃的条件下进行加速试验。混合液中均配有终浓度为30‰的海水晶以调整环境的盐度。本发明实验分为组I到组VI共6个组别，I到V一次对应上述顺序的保护剂，VI为对照组。
②蛭弧菌浓度的检测：对于25℃环境下的样品，每12h检测蛭弧菌的浓度，周期3天；对于37℃环境下的样品，每8h检测蛭弧菌的浓度，周期2天；对于45℃环境下的样品，每4h检测蛭弧菌的浓度，周期1天；对于55℃环境下的样品，每40min检测蛭弧菌的浓度，周期8h；对于65℃环境下的样品，每20min检测蛭弧菌的浓度，周期2h。检测方法采用双层琼脂平板法检测，所有检测操作均在无菌环境下进行，且每样品均有3个平行检测。对于双层平板上的噬菌斑进行计数，记录数据。
③计算蛭弧菌微生物制剂的保质期：通过记录的数据，运用阿伦尼乌斯方程计算蛭弧菌微生物制剂的保质期，选择最好的保护组别。各组保护剂的阿伦尼乌斯方程见表2。
表2 加速试验步骤③蛭弧菌的保种情况
| 阿伦尼乌斯方程 | 4℃/k | |
| 组I | Y=-4.297x+13.12(R2=0.953) | 0.005017 |
| 组II | Y=-5.031x+15.22(R2=0.957) | 0.001168 |
| 组III | Y=-4.209x+12.70(R2=0.962) | 0.003260 |
| 组IV | Y=-4.289x+12.90(R2=0.964) | 0.002658 |
| 组V | Y=-4.348x+13.10(R2=0.974) | 0.002581 |
| 组VI | Y=-4.269x+12.90(R2=0.976) | 0.003139 |
其中，k为失活速度常数。K值越小，保护效果越好。
从表2数据可以看出，4℃下，组II的失活速度常数（k）最小，效果最好，各组的阿伦尼乌斯方程拟合曲线见图1～6。由此可知，最佳的保护剂组别为终浓度为质量体积分数（g/mL）5%蔗糖+质量体积分数（g/mL）5%谷氨酸钠。
实施例3验证性实验
1、蛭弧菌微生物制剂的制备。具体步骤见实施例1，发酵制备得到的浓度为5.74×1012pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂。
2、保质期的验证性实验
验证性实验中，取步骤1中培养的蛭弧菌微生物制剂，分别添加新鲜DNB培养基和实施例2中得到的最佳的保护剂组别，置于4℃进行试验，制备3个平行样品。将混合好的混合液分别置于同一条件下实验。按一周一次的频率检测各样品的蛭弧菌浓度的变化情况，统计数据以评估加速试验的实验效果。
效果评估：将验证性实验8周的统计数据绘成图7的曲线图。从图7我们可以看出随着时间的推移，蛭弧菌的浓度逐渐减少。递减的趋势基本趋近一条直线，说明和理论的实验结果基本吻合，符合实验预期。实验中我们筛选出的最佳组为终浓度（质量体积分数g/mL）5%蔗糖+终浓度（质量体积分数g/mL）5%谷氨酸钠。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于包括以下步骤：
在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂；
所述的蛭弧菌为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDSM08，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209171；
所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于包括以下步骤：在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂，再以无菌DNB培养基填充。
3.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的保护剂为终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～15%蔗糖+终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～18%内消旋肌醇、终浓度1%～15%棉子糖、终浓度1%～20%葡萄糖或终体积百分比1%～25%甘油。
4.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的蛭弧菌微生物制剂通过以下步骤获得：
①DNB培养基的制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白水解物，0.1g/L的酵母提取物，30g/L的海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调整PH至7.5，115℃高温蒸汽灭菌20min；
②宿主菌悬浮液的制备：在LB液体培养基中接种嗜水气单胞菌，培养，离心，弃上清收集菌体，每100mL培养液收集的菌体用2～3mL DNB培养基悬浮，得到宿主菌悬浮液，4℃保存备用；
③蛭弧菌的活化：取保藏的蛭弧菌，将蛭弧菌保藏液加入到DNB培养基中，再按照50mL DNB培养基中接种500μL由步骤②制备的宿主菌悬浮液的比例接种宿主菌悬浮液，培养，得到活化后的蛭弧菌；
④蛭弧菌微生物制剂的制备：将活化后的蛭弧菌用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的生长情况；挑取有规则的单个噬菌斑，接种到DNB培养基中，同时按照50mL DNB培养基中接种500μL由步骤②制备的宿主菌悬浮液的比例接种宿主菌悬浮液，培养，得到蛭弧菌种子液，将蛭弧菌种子液进行离心，取上清液，得到蛭弧菌微生物制剂；
⑤用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的浓度及生长情况，得到浓度为2.1×1011～5.74×1012pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂，用该蛭弧菌微生物制剂进行后续的加速试验。
5.根据权利要求4所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：
步骤②中所述的培养的条件为250rpm、30℃培养24h；
步骤②中所述的离心的条件为4℃、6000rpm离心15min；
步骤③中所述的蛭弧菌保藏液与DNB培养基的体积比为1:（25～50）；
步骤③中所述的培养的条件为28～35℃、100～150rpm恒温培养48～72h；
步骤④中所述的培养的条件为28～35℃、100～150rpm恒温培养48～72h；
步骤④中所述的将蛭弧菌种子液进行离心的条件为4℃、6000rpm离心20min。
6.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的保护剂的筛选方法，包括如下步骤：
（1）将蛭弧菌微生物制剂、不同种类和/或不同浓度的保护剂混合，再以无菌DNB培养基填充，得到混合液；
（2）将混合液置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃下进行加速试验；
（3）定期取样，检测混合液中蛭弧菌的浓度；
（4）运用阿伦尼乌斯方程及步骤（3）记录的数据计算出蛭弧菌微生物制剂的保质期；通过比对保质期来确定保护剂的效果；当保质期越长，保护剂效果越好；保质期越短，保护剂效果越差；
步骤（1）中所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的定期取样的条件为对于25℃环境下的样品，每12h检测蛭弧菌的浓度，周期3天；对于37℃环境下的样品，每8h检测蛭弧菌的浓度，周期2天；对于45℃环境下的样品，每4h检测蛭弧菌的浓度，周期1天；对于55℃环境下的样品，每40min检测蛭弧菌的浓度，周期8h；对于65℃环境下的样品，每20min检测蛭弧菌的浓度，周期2h。
8.根据权利要求6所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的混合液为蛭弧菌制剂体积的10～30倍；
步骤（2）中所述的加速试验是加速时间的长短随温度的升高而递减；
步骤（3）中所述的混合液中蛭弧菌的浓度通过双层平板检测法进行检测。
9.根据权利要求6所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的阿伦尼乌斯方程为：阿伦尼乌斯方程的指数定律k=e-E/RT，其对数形式为：logk=-E/2.303RT+logA；
其中，k为失活速度常数，E为表观活化能，R为摩尔气体常数，T为热力学温度，A为频率因子；以混合液中蛭弧菌的初始浓度为C0，所测的蛭弧菌浓度为C，求出各温度下保存不同时间后的相对活性；以lgCr对时间进行回归分析，得出各温度和保护剂下蛭弧菌的失活速度常数，将lgk对1/T×103进行回归分析，得阿伦尼乌斯方程；此后，验证性地检测蛭弧菌微生物制剂4℃保存8周期间的浓度变化。
10.权利要求1～9任一项所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法在延长蛭弧菌微生物制剂保质期上的应用。
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