CN103952308A

CN103952308A - 一种提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法

Info

Publication number: CN103952308A
Application number: CN201410143830.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡俊鹏; 孙秋平
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明公开一种提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。该方法包括以下步骤：制备蛭弧菌微生物制剂；将蛭弧菌微生物制剂与不同种类和/或不同浓度的保护剂混合，得到混合液；将混合液置于不同温度下进行加速试验；定期取样，检测混合液中蛭弧菌微生物制剂的活菌浓度；运用阿伦尼乌斯方程及记录的数据计算出蛭弧菌微生物制剂的保质期，通过比对保质期来确定保护剂的效果。通过该方法，对不同的保护剂对于蛭弧菌微生物制剂的保质效果进行对比，筛选出保质效果最佳的保护剂，明显延长蛭弧菌微生物制剂的保质期；且可在长时间内有效保持蛭弧菌微生物制剂中菌体的活力。本发明提供的保护剂选材广泛价格低廉，适用于推广使用。

Description

一种提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法

技术领域

本发明属于蛭弧菌技术领域，特别涉及一种提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。

背景技术

目前，出于环境友好的需要，许多在畜牧水产养殖中应用的杀菌防病制剂多采用微生物型。但是多数微生物制剂存在活性极易丧失或下降、货架期短等缺点。同时，在我们的实际养殖环境当中，我们需要浓度和活力较高的微生物制剂以便菌体能够较好地投入到生产应用当中。国内外对于微生物制剂的保质技术的研究主要集中于双歧杆菌冻干粉、微胶囊化有益菌微生物制剂等方面，而对于延长由蛭弧菌制得的微生物制剂的保质期技术目前尚为欠缺，且主要集中于用冷冻干燥或包埋等方法，但是这些方法制得的微生物制剂的保质期短，而且固定化的蛭弧菌微生物制剂将难以发挥其对于细菌的裂解作用，存在一定的局限性。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。该方法弥补了蛭弧菌微生物制剂保质期普遍较短的缺陷。

本发明的另一目的在于提供所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，包括以下步骤：

（1）制备蛭弧菌微生物制剂；

（2）在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂。

所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS02，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209170；对所述的蛭弧菌进行进行负染后于电子显微镜下观察形态可知：BDS02呈单细胞，弧形，大小为0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛长度为1.8μm；所述蛭弧菌BDS02用双层平板培养的方法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑；

所述的蛭弧菌微生物制剂优选通过以下步骤获得：

①宿主菌浓缩液的制备：挑取大肠杆菌单菌落（大肠杆菌E.coli，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号为GIM1.355），接种于营养肉汤液体培养基中，培养，得到培养液，然后将培养液离心，弃上清，每100mL培养液收集的沉淀用2～3mL DNB（diluted nutrient broth）液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4℃保存备用；

②蛭弧菌微生物制剂的制备：按照蛭弧菌：宿主浓缩液：DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液离心，取上清液，过滤，滤液使用质量体积比（g/mL）1.5%盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，最终蛭弧菌微生物制剂的终浓度为10¹⁰～10¹¹PFU（plaque-forming unit）/mL；即为蛭弧菌微生物制剂来进行后续的加速试验；

所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS02，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209170；

步骤①中所述的营养肉汤液体培养基优选为营养肉汤18g/L，pH7.2，121℃高压灭菌15min后保存备用；

步骤①中所述的培养的条件优选为200rpm、28℃培养18h；

步骤①中所述的离心的条件优选为4℃、6000rpm离心20min；

步骤②中所述的恒温培养的条件优选为230rpm、28℃培养；

步骤②中所述的将培养液离心的条件优选为6000rpm、4℃离心20min；

步骤②中所述的过滤优选为用0.45μm醋酸纤维素膜进行过滤；

步骤①和②中所述的DNB液体培养基，优选通过如下步骤制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.1g/L的酵母提取物，15g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min保存备用；

步骤②中所述的质量体积比（g/mL）1.5%盐度的灭菌蒸馏水优选用海水晶制备得到；

步骤②中所述的蛭弧菌微生物制剂的终浓度优选为6.4×10¹⁰～7.2×10¹⁰pfu/mL；

步骤（2）中所述的保护剂优选为谷氨酸钠、蔗糖、甘油、内消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一种；

步骤（2）中所述的保护剂优选为谷氨酸钠、蔗糖和甘油中的至少一种；

步骤（2）中所述的保护剂优选为终质量体积比1%～25%谷氨酸钠、终质量体积比1%～25%蔗糖和终体积百分比5%～30%甘油中的至少一种；

步骤（2）中所述的保护剂优选为终质量体积比5%谷氨酸钠、终质量体积比5%蔗糖和终体积百分比15%甘油中的至少一种；

步骤（2）中所述的保护剂更优选为终质量体积比5%谷氨酸钠和终质量体积比5%蔗糖；

步骤（2）中所述的保护剂的筛选方法，包括如下步骤：

（Ⅰ）将上述制备好的蛭弧菌微生物制剂与不同种类和/或不同浓度的保护剂混合，得到混合液；

（Ⅱ）将混合液置于梯度温度下进行加速试验；

（Ⅲ）定期取样，检测混合液中蛭弧菌微生物制剂的浓度；

（Ⅳ）运用阿伦尼乌斯方程及步骤（Ⅲ）记录的数据计算出蛭弧菌微生物制剂的保质期，通过比对保质期来确定保护剂的效果；当保质期越长，保护剂效果越好；保质期越短，保护剂效果越差；

步骤（Ⅰ）中所述的保护剂优选为谷氨酸钠、蔗糖、甘油、内消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一种；

步骤（Ⅰ）中所述的保护剂优选为终质量体积比5%～25%谷氨酸钠、终质量体积比5%～25%蔗糖和终体积百分比5%～25%甘油中的至少一种；

步骤（Ⅰ）中所述的保护剂优选为终质量体积比5%谷氨酸钠、终质量体积比5%蔗糖和终体积百分比15%甘油中的至少一种；

步骤（Ⅰ）中所述的保护剂更优选为终质量体积比5%谷氨酸钠和终质量体积比5%蔗糖；

步骤（Ⅰ）中所述的混合液优选为将蛭弧菌微生物制剂与保护剂按照体积比1:（1～5）进行混合得到；

步骤（Ⅱ）中所述的梯度温度优选为25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃；

步骤（Ⅱ）中所述的加速试验是加速时间的长短随温度的升高而递减；

步骤（Ⅲ）中所述的定期取样的检测间隔时间优选如表1所示。

表1不同的温度下取样检测间隔时间及取样次数

温度	持续时间/取样间隔时间	总共取样次数
			25℃	0～72h/12h	6
37℃	0～48h/8h	6
			45℃	0～24h/4h	6
55℃	0～8h/40min	12
			65℃	0～2h/20min	6
75℃	0～1h/10min	6
			85℃	0～30min/5min	6
95℃	0～10min/1min	10

步骤（Ⅲ）中所述的混合液中蛭弧菌微生物制剂的浓度优选通过双层平板检测法进行检测；

步骤（Ⅳ）中所述的阿伦尼乌斯方程为：阿伦尼乌斯方程（Arrhenius formula）的指数定律k=e^-E/RT，其对数形式为：logk=-E/2.303RT+logA；

其中k为失活速度常数，E为表观活化能，R为摩尔气体常数，T为热力学温度，A为频率因子；以混合液中蛭弧菌微生物制剂的初始浓度为C₀，所测的蛭弧菌微生物制剂浓度为C，求出各温度下保存不同时间后的相对活性（C_r=C/C₀）；以lgC_r对时间（t）进行回归分析，得出各温度和保护剂下蛭弧菌微生物制剂的失活速度常数（k），将lgk对1/T×10³进行回归分析，得阿伦尼乌斯方程；此后，求出该种蛭弧菌微生物制剂在不同温度（4℃和10℃）下浓度降为原始浓度的1%、0.1%和0.01%时的保质期；

所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法在延长蛭弧菌微生物制剂保质期上的应用。

所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS02，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209170。

本发明的机理是：通过使用研究保质期的经典恒温加速试验，对蛭弧菌微生物制剂在不同保护剂下的失活速度常数进行研究，以确定可以达到最佳的保护效果的保护剂组合，并将其灵活的应用于试验中，实现了通过该方法达到提高蛭弧菌微生物制剂保质期的目的。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

（1）本发明获得了一种有效提高蛭弧菌微生物制剂保质期的理想方法，通过该方法可在长时间内有效保持蛭弧菌微生物制剂的活力。

（2）本发明以咸淡水蛭弧菌制备的蛭弧菌微生物制剂为例，获得了一种能够提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法。本发明通过该方法，对不同的保护剂对于蛭弧菌微生物制剂的保质效果进行对比，筛选出保质效果最佳的保护剂。

（3）本发明提供的保护剂选材广泛价格低廉，适用于推广使用。

（4）本发明设计保护剂的思路可以应用于其他类型如片剂及冻干粉等蛭弧菌微生物制剂的保存中。

附图说明

图1为实施例4中的4组不同组别保护剂下蛭弧菌微生物制剂浓度降低到原始浓度的1%的保质期效果对比图。

图2为实施例4中的4组不同组别保护剂下蛭弧菌微生物制剂浓度降低到原始浓度的0.1%的保质期效果对比图。

图3为实施例4中的4组不同组别保护剂下蛭弧菌微生物制剂浓度降低到原始浓度的0.01%的保质期效果对比图。

图4为实施例5中的最佳组别25周内验证性实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS02为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209170。对所述的蛭弧菌进行进行负染后于电子显微镜下观察形态可知：BDS02呈单细胞，弧形，大小为0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛长度为1.8μm；所述蛭弧菌BDS02用双层平板培养的方法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑。蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS02在中国专利申请文件“申请号：200910042275.0，名称为：一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株及其应用”中公开。

营养肉汤培养基为营养肉汤18g/L，pH7.2，121℃高压灭菌15min后保存备用；

DNB液体培养基，通过如下步骤制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.1g/L的酵母提取物，15g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min保存备用。

实施例1

1、蛭弧菌微生物制剂的制备

（1）宿主菌浓缩液的制备：挑取大肠杆菌单菌落（大肠杆菌E.coli，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号为GIM1.355），接种于营养肉汤液体培养基中，200rpm、28℃培养18h，得到培养液，然后将培养液4℃、6000rpm离心20min，弃上清，每100mL培养液收集的沉淀用2～3mL DNB液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4℃保存备用；

（2）蛭弧菌微生物制剂的制备：将1mL实验室-40℃保存的蛭弧菌BDS02接种于50mL DNB液体培养基中，添加1mL步骤（1）中的大肠杆菌宿主浓缩液，恒温摇床230rpm、28℃培养，每24h添加一次（1mL）宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液6000rpm、4℃离心20min取上清液，0.45μm醋酸纤维素膜（购自上海市新亚净化器件厂）过滤，滤液使用海水晶制备的质量体积比（g/mL）1.5%盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，最终蛭弧菌微生物制剂的终浓度为6.8×10¹⁰PFU/mL；即为蛭弧菌微生物制剂来进行后续的加速试验。

2、蛭弧菌微生物制剂保质期的加速试验

（1）优化保护剂的最佳浓度

本发明实验所用到的保护剂为终质量体积比（g/mL）5%～25%谷氨酸钠，在该浓度区间内，取5个浓度点，终质量体积比（g/mL）分别为：5%、10%、15%、20%和25%的谷氨酸钠。

将步骤1中发酵好的蛭弧菌微生物制剂1mL与不同浓度的谷氨酸钠保护剂1mL混合置于2.5mL的离心管中，密封，然后置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃的条件下进行恒温加速实验。混合液中均配有终浓度为1.5%的海水晶以调整环境的盐度。

（2）蛭弧菌微生物制剂浓度的检测：定期取样检测间隔时间如表1所示。

（3）计算蛭弧菌微生物制剂的保质期（单位，天/d）：通过记录的数据，运用阿伦尼乌斯方程计算蛭弧菌微生物制剂浓度降低为原始浓度1%的保质期（见表2），最终选取最优组别。

表2

由此得出最佳的谷氨酸钠终浓度为5%。

实施例2

1、蛭弧菌微生物制剂的制备。具体步骤见实施例1，发酵制备得到的浓度为6.4×10¹⁰pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂。

2、蛭弧菌微生物制剂保质期的加速试验

（1）优化保护剂的最佳浓度

本发明实验所用到的保护剂为终质量体积比（g/mL）5%～25%蔗糖。在该浓度区间内，取5个浓度点，终质量体积比（g/mL）分别为：5%、10%、15%、20%和25%的蔗糖。

将步骤1中发酵好的蛭弧菌微生物制剂1mL与不同浓度的蔗糖保护剂1mL混合置于2.5mL的离心管中，密封，然后置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃的条件下进行恒温加速实验。混合液中均配有终浓度为1.5%的海水晶以调整环境的盐度。

（3）计算蛭弧菌微生物制剂的保质期（单位，天/d）：通过记录的数据，运用阿伦尼乌斯方程计算蛭弧菌微生物制剂浓度降低为原始浓度1%的保质期（见表3），最终选取最优组别。

表3

由此得出最佳的蔗糖终浓度为5%。

实施例3

1、蛭弧菌微生物制剂的制备。具体步骤见实施例1，发酵制备得到的浓度为7.2×10¹⁰pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂。

2、蛭弧菌微生物制剂保质期的加速试验

（1）优化保护剂的最佳浓度

本发明实验所用到的保护剂为终体积百分比5%～25%甘油。在该浓度区间内，取5个浓度点，终体积百分比分别为：5%、10%、15%、20%和25%的甘油。

将步骤1中发酵好的蛭弧菌微生物制剂1mL与不同浓度的甘油保护剂1mL混合置于2.5mL的离心管中，密封，然后置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃的条件下进行恒温加速实验。混合液中均配有终浓度为1.5%的海水晶以调整环境的盐度。

（3）计算蛭弧菌微生物制剂的保质期（单位，天/d）：通过记录的数据，运用阿伦尼乌斯方程计算蛭弧菌微生物制剂浓度降低为原始浓度1%的保质期（见表4），最终选取最优组别。

表4

由此得出最佳的甘油终浓度为15%。

实施例4

1、蛭弧菌微生物制剂的制备。具体步骤见实施例1，发酵制备得到的浓度为6.8×10¹⁰pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂。

2、蛭弧菌微生物制剂保质期的加速试验

根据实施例1～3得到的保护剂的最佳浓度分别为终质量体积比（g/mL）5%谷氨酸氨、终质量体积比（g/mL）5%蔗糖和终体积百分比15%甘油，将其两两组合组及三种混合组4种保护剂组别，同时直接使用步骤1中发酵好的蛭弧菌微生物制剂进行保质期的加速实验。

4种保护剂的组别配比及对比组分别为：

1号组别：终质量体积比5%谷氨酸钠+终质量体积比5%蔗糖；

2号组别：终质量体积比5%谷氨酸钠+终体积百分比15%甘油；

3号组别：终质量体积比5%蔗糖+终体积百分比15%甘油；

4号组别：终质量体积比5%谷氨酸钠+终体积百分比15%甘油+终质量体积比5%蔗糖；

（1）最优组别的筛选：将步骤1中发酵好的蛭弧菌微生物制剂1mL与不同组别的保护剂1mL混合置于2.5mL的离心管中，密封，然后置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃的条件下进行恒温加速实验。混合液中均配有终浓度为1.5%的海水晶以调整环境的盐度。

（3）计算蛭弧菌微生物制剂的保质期：运用阿伦尼乌斯方程分别计算蛭弧菌微生物制剂浓度降低到原始浓度的1%、0.1%和0.01%时的保质期（分别见图1、2、3），最终选取最优组别，以满足不同实验条件下的需求。

由此可知，最佳的保护剂组别为终质量体积比（g/mL）5%蔗糖+终质量体积比（g/mL）5%谷氨酸钠。

实施例5最佳组别的保质期验证性实验

2、验证性实验：使用加速实验实施例4中筛选的最佳组别的保护剂，将步骤1中发酵好的蛭弧菌微生物制剂1mL，浓度为6.8×10¹⁰pfu/mL，与该种保护剂1mL混合置于2.5mL的离心管中，密封，置于4℃进行试验，制备三个平行样品。按一周一次的频率检测各样品的蛭弧菌微生物制剂浓度的变化情况，统计数据以评估加速试验的实验效果。

效果评估：图4是25周内的实验结果，对比发现，当添加该种保护剂的蛭弧菌微生物制剂浓度分别降低至1%、0.1%和0.01%的时间分别为84d、128d和169d左右，与恒温经典加速实验的结果偏差值在±0.02d，在实验允许范围内，达到评估的要求。根据实验结果得出终质量体积比（g/mL）5%蔗糖+终质量体积比（g/mL）5%谷氨酸钠组具有较好延长蛭弧菌制剂保质期的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备蛭弧菌微生物制剂；

（2）在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂；

所述的蛭弧菌为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS02，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209170；

所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、甘油、内消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：

所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖和甘油中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的保护剂为终质量体积比5%～25%谷氨酸钠、终质量体积比5%～25%蔗糖和终体积百分比5%～25%甘油中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的蛭弧菌微生物制剂通过以下步骤获得：

①宿主菌浓缩液的制备：挑取大肠杆菌单菌落，接种于营养肉汤液体培养基中，培养，得到培养液，然后将培养液离心，弃上清，每100mL培养液收集的沉淀用2～3mL DNB液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4℃保存备用；

②蛭弧菌微生物制剂的制备：按照蛭弧菌：宿主浓缩液：DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液离心，取上清液，过滤，滤液使用质量体积比1.5%盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，最终蛭弧菌微生物制剂的终浓度为10¹⁰～10¹¹PFU/mL；即为蛭弧菌微生物制剂来进行后续的加速试验。

5.根据权利要求4所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：

步骤①中所述的营养肉汤液体培养基为营养肉汤18g/L，pH7.2，121℃高压灭菌15min后保存备用；

步骤①中所述的培养的条件为200rpm、28℃培养18h；

步骤①中所述的离心的条件为4℃、6000rpm离心20min；

步骤②中所述的恒温培养的条件为230rpm、28℃培养；

步骤②中所述的将培养液离心的条件为6000rpm、4℃离心20min；

步骤②中所述的过滤为用0.45μm醋酸纤维素膜进行过滤；

步骤①和②中所述的DNB液体培养基，通过如下步骤制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.1g/L的酵母提取物，15g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min保存备用；

步骤②中所述的质量体积比1.5%盐度的灭菌蒸馏水用海水晶制备得到。

6.根据权利要求1所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的保护剂的筛选方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求1中制备好的蛭弧菌微生物制剂与不同种类和/或不同浓度的保护剂混合，得到混合液；

（2）将混合液置于梯度温度下进行加速试验；

（3）定期取样，检测混合液中蛭弧菌微生物制剂的浓度；

（4）运用阿伦尼乌斯方程及步骤（3）记录的数据计算出蛭弧菌微生物制剂的保质期，通过比对保质期来确定保护剂的效果；当保质期越长，保护剂效果越好；保质期越短，保护剂效果越差；

步骤（1）中所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、甘油、内消旋肌醇、棉子糖和葡萄糖中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖和甘油中的至少一种；

步骤（1）中所述的保护剂为终质量体积比5%～25%谷氨酸钠、终质量体积比5%～25%蔗糖和终体积百分比5%～25%甘油中的至少一种；

步骤（2）中所述的梯度温度为25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃；

步骤（1）中所述的混合液为将蛭弧菌微生物制剂与保护剂按照体积比1:（1～5）进行混合得到；

步骤（2）中所述的加速试验是加速时间的长短随温度的升高而递减；

步骤（3）中所述的混合液中蛭弧菌微生物制剂的浓度通过双层平板检测法进行检测。

8.根据权利要求6所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的定期取样的检测间隔时间为对于25℃环境下的样品，每12h检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期72h；对于37℃环境下的样品，每8h检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期48h；对于45℃环境下的样品，每4h检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期24h；对于55℃环境下的样品，每40min检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期8h；对于65℃环境下的样品，每20min检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期2h；对于75℃环境下的样品，每10min检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期1h；对于85℃环境下的样品，每5min检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期30min；对于95℃环境下的样品，每1min检测蛭弧菌微生物制剂的浓度，周期10min。

9.根据权利要求6所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的阿伦尼乌斯方程为：阿伦尼乌斯方程的指数定律k=e^-E/RT，其对数形式为：logk=-E/2.303RT+logA；

其中k为失活速度常数，E为表观活化能，R为摩尔气体常数，T为热力学温度，A为频率因子；以混合液中蛭弧菌微生物制剂的初始浓度为C₀，所测的蛭弧菌微生物制剂浓度为C，求出各温度下保存不同时间后的相对活性；以lgC_r对时间进行回归分析，得出各温度和保护剂下蛭弧菌微生物制剂的失活速度常数，将lgk对1/T×10³进行回归分析，得阿伦尼乌斯方程；此后，求出该种蛭弧菌微生物制剂在不同温度下浓度降为原始浓度的1%、0.1%和0.01%时的保质期。

10.权利要求1～9任一项所述的提高咸淡水蛭弧菌微生物制剂保质期的方法在延长蛭弧菌微生物制剂保质期上的应用。