CN103343093B - 酿造慕萨莱思的低温酵母、制备方法及制备的慕萨莱思 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产慕萨莱思的低温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.7512和利用此菌株发酵制备方法获得慕萨莱思。本发明通过不同温度、糖度、酒度及低氮耐受性分析、起发性测定、产酒力、絮凝性、自溶性、产H2S能力、产生物胺特性的检测、果胶酶活性测定和β-葡萄糖苷酶活性测定试验，筛选出酿酒性能优良的低温慕萨莱思酵母一株，广泛应用于轻工业生产等领域。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及发酵工业领域。具体的说，本发明涉及一种新疆慕萨莱思酿造的低温酵母菌、制备方法及其获得的饮品技术领域。
背景技术
慕萨莱思是西域最古老的葡萄酒，民间也称作“穆萨莱斯”、“穆塞勒斯”、“姆塞来斯”、“木赛来斯”和“美赛来斯”、“ 慕萨莱思”、“ 穆塞莱斯”等。中国唐代诗句“葡萄美酒夜光杯，欲饮瑟琶马上催”中的“葡萄美酒”指的就是穆塞莱斯。高昌王向唐朝进贡的“西域琼浆”也是穆塞莱斯。“葡萄独不用曲”（明朝李时珍《本草纲目》卷二十五），慕萨莱思就是用葡萄汁自然发酵而成，不勾不兑，无任何“曲”类添加剂，因此被认为是古代西域葡萄酒的“活化石”。民间历来酿造慕萨莱思极为普遍，“村村舍舍煮酒忙，香气氤氲漫农家”。群众饮慕萨莱思往往以酣为快，酣后意恣，高歌狂舞，尽兴而怡然，再现了古代西域文化的遗风，是古代西域文化的余绪。慕萨莱思已成为新疆特产，主产地在阿瓦提县，在新疆的阿瓦提县，几乎家家户户都酿酒。同一个村庄里，即使有上百户人家，也不会有一种相同的穆塞莱斯。这与酿酒人的年龄、性格、心情等有关，他们把自己的个性融人了穆塞莱斯中了，是一种酿造的味美醇香的葡萄酒，药用价值高，富含人体所需的氨基酸、多种维生素、葡萄糖、铁等营养成分和微量元素。慕萨莱思属温性,是一种纯天然绿色饮品，至今沿袭着祖辈的酿造工艺，使得慕萨莱思以最老的方式保存了下来，堪称刀郎文化的精髓与灵魂。慕萨莱思酒是新疆维吾尔民族利用鲜食或兼食性的葡萄取汁、熬煮、发酵而成的一种天然酒精饮料。慕萨莱思的酿造工艺与葡萄酒工艺有着很大的不同。其基本工艺为维吾尔人将葡萄榨汁，先将皮渣加水熬煮（水刚没过皮渣）熬煮，之后过滤，滤液与压榨汁混合后再熬煮，形成慕萨莱思起始发酵液，自然冷却至室温，装入大缸进行自然发酵而成。偶尔酿造者根据自己的需求会添加一些当地出产的大芸、白杏、桑椹、红花、枸杞、鸽子、雪鸡、鹿血，甚至是新疆的烤全羊。作为具有保健功效及丰富文化底蕴的原生态饮品，慕萨莱思逐步成为当地经济发展的重要组成部分，慕萨莱思市场的迅速扩大与人民对其消费需求的迅速增长，传统慕萨莱思逐步暴露出其产量不足，质量层次不齐等先天性缺陷，已经不能保证慕萨莱思的规模化持续发展，慕萨莱思的改革与创新为慕萨莱思进一步发展的迫切任务。
由于慕萨莱思的原生态性，也严重制约了慕萨莱思产业化发展。在当地家家可以酿造慕萨莱思，但是酿造出的产品参差不齐，而且工艺还很落后，人才匮乏真正掌握能酿造高品质的慕萨莱思的技师寥寥无几，有的也只是掌握了祖辈的酿造经验而已，对于规模化的科学生产却不能适应。由于慕萨莱思的酿造工艺不同于普通葡萄酒的工艺，所以对于慕萨莱思的酿造来说葡萄酒酿造师是一片陌生的领域。
传统慕萨莱思酿制的关键工序为熬煮与发酵工序，其中发酵工序受到野生菌种、自然环境条件及发酵设备等因素的影响，是引起慕萨莱思质量波动的重要因素，是限制慕萨莱思规模化生产的最主要因子。例如，在慕萨莱思完全自然发酵过程中，由于受到新疆早晚大幅度温差波动，发酵过程中大量生物热等的影响，造成发酵醪品温要么过高，高达37℃，要么过低，低达13℃，常常发生延迟启发，停滞发酵，提前结束发酵等现象，使得发酵周期由15d到45d 不等，同样的熬煮发酵醪，但最终的慕萨莱思产品质量如酒精、酸、涩、苦等有某单项感官特征突出到各种滋味与香味协调怡人的高品质不等。又由于在市场利益的驱动下，人们随意改变熬煮与发酵设备等，使得传统慕萨莱思酿造工艺更加复杂化，对传统慕萨莱思的发展产生负面影响。
现有技术研究表明，环境因子对葡萄酒酵母多样性的形成具有重要作用，慕萨莱思酵母菌多样性及遗传多样性与慕萨莱思独特的酿制环境有关，环塔里木盆地的极端内陆气候，其干旱、少雨、无霜期长等均有可能影响当地酵母的多样性。此外，与采样点之间在原料选择，取汁方式，熬煮方式与时间，自然发酵容器、周期等工序上以及制作过程中卫生防控相关联。不同的取汁方法也可能导致葡萄汁中酵母菌数多样性不同，这些都需要采用科学的技术手段加以研究和攻关。目前国内，有对慕萨莱思酿制中野生优势菌的报道，但没有适宜于地方慕萨莱思复杂酿制环境的优良菌株及其配套酿制工艺的报道。
针对目前慕萨莱思发展处于传统加工与现代化生产交汇阶段，传统工艺革新是慕萨莱思发展的历史性任务。依据慕萨莱思的酿制的科学原理，对慕萨莱思酿制核心技术，即自然发酵工序进行科学分析，筛选研制适宜于慕萨莱思现代化生产优良菌种和适合稳定工业化生产的工艺，同时又最大水平保留传统慕萨莱思优质品质特征的先进工艺是对传统慕萨莱思改进的根本。
发明内容
针对目前国内外没有发酵性能优良、耐受性好的慕萨莱思专用酵母，本发明提供一种耐受性好，低温发酵性能优良的低温酵母菌种、确定的生产慕萨莱思的工艺及其制备获得的慕萨莱思。
本发明从新疆阿克苏地区、和田地区和喀什地区慕萨莱思产区不同慕萨莱思的自然发酵液中取样，筛选出一批生长良好的酵母菌株，从中优选出一株编号为LTSM-A1的低温酵母菌株，经鉴定为酿酒酵母菌，该菌株确定的发酵工艺能生产慕萨莱思。
本发明具体提供了一种耐受性好，发酵性能优良的低温酵母菌种，编号为LTSM-A1，参照J.A巴尼特和R.W佩恩编著的《酵母菌的特征和鉴定手册》，Barnett等编著的《酵母菌：特征与鉴定》，张纪忠的《微生物分类学》，Cavazza（1992）等人及杨莹（2007）等人的文献报道，对LTSM-A1菌株进行形态学，生理生化鉴定。LTSM-A1菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101, 保藏日期是2013年04月23日，保藏号是CGMCC No.7512。经微生物学鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。该酵母经WL营养琼脂培养基培养，菌落特征为奶油色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油状；YPD固体培养菌落为乳白色，奶油状，表面平滑，边缘整齐；YPD液体培养基培养无膜或蹼，试管底部具有白色紧实沉淀；细胞形态为圆形或椭圆形，多端出芽，产孢子，孢子为圆形，孢子数为1个～4个；利用赖氨酸培养基进行选择性培养，为不生长；可发酵葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麦芽糖，蔗糖，可同化的碳源为：葡萄糖，半乳糖，甲基葡萄糖甙，乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、N－乙酰氨基葡萄糖、蜜二糖、木糖醇、丙三醇、山梨醇、赤鲜醇、环乙糖胺、肌醇、乳酸及柠檬酸测试均显示阴性，不能利用硝酸钾，脲酶试验、DBB实验、抗0.01%及0.1%放线菌酮实验及无维生素生长实验均为阴性；通过上述结果及经过26S rDNA同源分析、系统发育分析结果，将菌种编号为LTSM-A1菌株鉴定为酵母属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
同时，本发明在提供LTSM-A1酵母菌株的基础上，进一步提供了一种酿制慕萨莱思的生产工艺，具体步骤如下：
（1）酒母制备：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7512在YPD固态培养基上的新鲜培养物，接入24Brix葡萄熬煮汁中培养24h，备用。
（2）原料筛选与冲洗：将石子等异物、霉烂果及青果等从成熟的葡萄原料中拣选出，拣选干净葡萄利用自来水将泥沙冲洗干净。
（3）榨汁：利用破碎机将上述步骤（2）拣选与冲洗后的葡萄除根破碎后，利用螺旋压榨机进行压榨，转移至不锈钢锅带盖的蒸锅。
（4）熬煮与冷却：在步骤（3）榨出的葡萄皮渣中加以淹没皮渣为宜的水量，用煤火或材火大火煮开，而后用小火慢慢熬煮；熬煮时间12h，熬煮好的皮渣水色泽鲜亮，褐红；过滤后的皮渣水再与原汁以1:3（v:v）的比例混入大口锅继续用大火熬煮开，小火熬煮24 h，在熬煮的过程中不断的用纱布笊篱将泡沫漂去；用筷子或长条树枝蘸一滴熬煮液，滴在指甲盖上，来回晃动都不会掉下，甚至能倒挂，有韧性、有黏度，即可判断为熬煮结束，实测糖度22~26Brix，熄火，静置，自然冷却约24h 至室温；纱布笊篱采用给笊篱裹上过滤布。
（5）发酵：将上述步骤（4）葡萄熬煮汁冷却后，装入预先洗干净，灭菌过的发酵容器，接入步骤（1）制备新鲜的酒母，接种量为总发酵液的1%（v/v），接种温度为25℃~28℃，在环境温度为10℃~20℃进行发酵，品温为12℃～20℃，最适宜发酵温度为16℃。在发酵过程中，每隔24h利用糖度计测定发酵液的Brix及利用温度计测试品温；直到糖度连续2～3d 不再降，定为发酵终点，结束发酵。
（6）后熟，杀菌及灌装： 发酵结束后，酒与酒渣放置40~45d，进行后熟，后熟温度不得超过20℃，将后熟好的慕萨莱思上清液导入干净容器中，进行65℃~75℃杀菌30min，冷却并将温度降至室温，而后进行灌装;若不及时灌装，将容器装满，在灌装前进行杀菌，杀菌条件同上。
本发明中选用的酵母菌分离培养基采用如下：
YPD液体培养基（g /L）：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，溶于蒸馏水并定溶至1000 mL，pH值自然。YPD固体培养基加20 g琼脂，121℃高压灭菌20 min；WL营养琼脂培养基（g /L）：酵母浸粉4 g，蛋白胨5 g，葡萄糖50 g，磷酸二氢钾0.55 g，氯化钾0.425 g，氯化钙0.125 g，硫酸镁0.125 g，氯化铁0.025 g，硫酸锰0.025 g，琼脂20 g，溴甲酚绿22 mg，pH 6.5，121℃灭菌20 min。
菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7512保藏用保护剂：甘油
（1）本发明中选用的酿酒酵母鉴定培养基及试剂：
YPD固液态培养基同上；WL营养琼脂培养基同上；Gorodkowa培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1% ，NaCl0.5% ， 琼脂2%，，pH值自然，121℃灭菌 20 min；赖氨酸培养基，每升中含有：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2 mg，DL-色氨酸2mg，对-氨基苯甲酸200 μg，生物素20 μg，叶酸2 μg，肌醇10mg，烟酸400 μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400 μg，核黄素200 μg，盐酸硫胺素400 μg，硼酸500 μg，结晶氯化铜40 μg，碘化钾100 μg，结晶氯化铁200 μg，结晶硫酸锰400 μg，结晶钼酸钠200 μg，结晶硫酸锌400 μg，磷酸二氢钾850 mg，磷酸氢二钾150 mg，结晶硫酸镁500 mg，氯化钠100 mg，结晶氯化钙100 mg，赖氨酸盐酸盐2.5 g，琼脂20 g，pH值自然，121℃灭菌 20 min；
（2）生理生化鉴定培养基：糖发酵培养基：0.5%酵母浸出物，121℃灭菌20min；碳源基础养基:(NH4)2SO4 0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4.7H2O 0.05%，酵母膏0.02%，水洗琼脂2%，115℃灭菌15min；氮源基础培养基：每升含有碳源（D-葡萄糖）10g，氨基酸（L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg），生长因子（对—氨基苯甲酸200ug，生物素20ug，叶酸2ug，肌醇10ug，烟酸400ug，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400ug，核黄素200ug，盐酸硫胺素400ug），微量元素（H3BO3 500ug，CuSO4.5HO2 40ug），盐类（KI 100ug，FeCl3.6HO2 200ug，MnSO4.4HO2400ug ，Na2MoSO4.2HO2 200ug，ZnSO4.7HO2 400ug），同化氮源，选择硝酸钾；脲素培养基：蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.2%，氯化钠0.5%，酚红0.0012%，琼脂2%，PH6.8灭菌后加入经过滤除菌尿素溶液，是尿素的最终浓度达到2%；抗放线菌酮培养基：每升中含有氨基酸（L-组氨酸10ug，DL-蛋氨酸20ug，DL-色氨酸20ug），3.5g硫酸铵以及0.01%和0.1%的放线菌酮，其余成分同氮源基础培养基；无维生素生长测试培养基：每升中含有氨基酸（L-组氨酸10ug，DL-蛋氨酸20ug，DL-色氨酸20ug），5g硫酸铵，不含生生长因子，其余同氮源基础培养基。
序列分析试剂： Tris（Amresco），SDS（Amresco），EDTANa2（Amresco），DNA Marker DL2000 (广东东盛生物科技有限公司)，TE缓冲液，琼脂糖（西班牙），2×Tag PCR Master Mix购自诺维森（北京）生物科技有限公司；TAE缓冲液(50×贮存液pH8.5，242 g Tris碱，57.1 mL 冰醋酸，37.2 g Na2EDTA·2H2O，加 ddH2O 至1 L，用时稀释到 1×)，通过26S rDNA引物测序。
本发明还进一步提供了利用低温菌株LTSM-A1发酵制备得到的慕萨莱思，具备优良品质的慕萨莱思产品：
（1）理化指标：酒精度：7～11％(V/V) 总糖：50～120g/L 总酸：２～８g/L。
（2）感官指标：色泽：具有慕萨莱思的典型色泽特征，砖红色，色泽幽暗，均匀浑浊；气味：具有突出的焦香味，醇香淡雅，具有良好的协调性，典型性强；口感：酸甜适中，口感丰满，具有良好的均衡性，后味悠长，典型性强。
本发明提供慕萨莱思理化指标测试采用的方法：总糖的测定： GB/T 15038-2006直接滴定法；酒精度的测定：GB/T 15038-2006酒精计法；总酸：GB/T 15038-2006电位滴定法；还原糖：GB/T 15038-2006直接滴定法，这些方法都是本领域常见的方法。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：
（1）本发明提供一株发酵性能良好，耐受性好的低温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7512，弥补了目前慕萨莱思专用酵母缺乏的现状，特别是适合低温发酵的慕萨莱思专用酵母。
（2）本发明对传统慕萨莱思产业、酿制工艺、品质特征等具体掌握基础上，进行大规模的慕萨莱思酵母分离与筛选，并对筛选株进行工厂化慕萨莱思发酵实验，获得优势优良酿酒酵母菌，完成适宜于高端慕萨莱思的低温纯种发酵工艺的研制。获得了优良的慕萨莱思产品，其色泽为慕萨莱思特有的纯正的砖红色，色泽幽暗，浑浊均匀，焦香味突出，醇香淡雅，酸甜适中，口感丰满，具有良好的均衡性，后味悠长，慕萨莱思典型性强；丰富了现有果酒产品市场。
附图说明
图1显示为慕萨莱思低温发酵工艺流程图。
图2显示为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7513菌落形态图,图中，上半部分图为YPD培养基上菌落形态，下半部分图为WL培养基上菌落形态。
图3显示为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7513细胞形态及孢子形态图，图中，上半部分图为细胞形态，下半部分图为孢子形态。
图4显示为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7513系统发育进化树图。
图5显示为慕萨莱思传统自然发酵Logisic降糖曲线拟合图。
图6显示为采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7513低温发酵制备慕萨莱思Logisic降糖曲线拟合图。
图7 显示慕萨莱思自然发酵与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7513低温发酵时降糖速率图。
具体实施方式
主要仪器与设备：PL202电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HPX-9272数显电热培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LDZX-40BI高压灭菌器，上海申安医疗器械厂；GZX-9420电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司； SW-CJ-2F超净工作台，上海博迅实业有限公司；HHW.21.600电热恒温水浴箱，北京永光明医疗仪器厂；fcycler96孔PCR反应仪，Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；GEL Doc2000凝胶成像分析仪，Bio-Rad公司；HPX-9272 MBE数显电热培养箱、SW-CJ-2F超净工作台 ，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LHS-250SC恒温恒湿培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；Biolog，美国BioTek Instruments公司；游标卡尺，上海工量具有限公司；WHB 96微孔板，上海市蔚宏生物科技有限公司；1000 ml移液枪，上海艾本德生物技术国际贸易有限公司；HPX-9272 MBE数显电热培养箱、SW-CJ-2F超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；C21-RT2103电磁炉、EG720FF1-NR微波炉，广东美的生活电器制造有限公司；G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸发仪，日本Eyela公司。BL3100电子天平，德国Sartorius公司；SCW-CA-650 桌上型垂直流洁净工作台，苏州宏瑞净化科技有限公司。G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸发仪，日本Eyela公司。BL3100电子天平，德国Sartorius公司。手持糖度计，上海天垒仪器仪表有限公司；酒精计，上海医联控温仪器厂。PHS-3B型pH计，上海红益仪器仪表有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；发酵罐（工厂）及25 L陶瓷发酵罐（作坊），市售。
酚酞、次甲基蓝、NaOH 、CuSO4·5H2O，天津永晟精细化工有限公司，酒石酸钾钠，大连凯美化工工程配套有限公司。
选用的原料为和田红葡萄，产自于新疆南疆环塔里木盆地地区。
本发明中选用的所有菌种和原辅材料，以及选用的菌种培养条件和方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的%一般为重量之比，个别不同之处另作说明。
实施例一：菌种的筛选、分离、纯化和鉴定
菌株分离方法
1.酵母分离源的采集：2010年9～10月采集于南疆地区8个具有典型慕萨莱思酿造工艺作坊和工厂49份样液。样液包括新压榨的含有皮渣的或不含皮渣的葡萄汁、正在熬煮的葡萄汁、0d（起始发酵液，即冷却后的葡萄熬煮汁）发酵液以及来自大小不等（50 -500 L）的瓷坛或不锈钢发酵罐（20 t）中不同时期发酵液。采样用厂家专用舀取工具将样液取出立即装入塑料瓶中（样液润洗3次）再用润洗过（样液润洗3次）的注射器吸10mL样液至已灭菌带塞的20 mL小玻璃瓶中，盖好瓶塞用封口膜密封放入4℃保温瓶中，12h内将样品运回实验室并与灭菌甘油1:1混合，放入-20℃冰箱中保存备用。
2. 菌种分离与纯化方法：将所采样品做10的稀释梯度，取其适宜的3个连续稀释梯度，各取0.1mL ，涂布于WL与 YPD固体培养基，于恒温养箱中28 ℃培养2～3 d，挑取单菌落，在YPD固体培养基上纯化培养后，进行甘油管-20℃保藏备用。未发酵的样品分离菌株控制在15~20株/样，发酵期的样品分离株控制20~40株/样。
分离株鉴定方法
1.酵母菌的形态学鉴定：菌落形态观察：将酵母在YPD及WL固体培养基上划线，28℃培养2～3 d，观察其菌落形态；细胞形态观察： YPD液态接种28℃培养2天，显微镜观察；孢子形态观察：Gorodkowa培养基28℃培养7天，采用孔雀绿——蕃红染色法将孢子进行孢子染色，显微镜观察。
液体培养特征观察：将菌种接种到YPD液体培养基中，28℃培养2～3 d，观察是否发酵、培养液是否混浊，是否形成环或岛等膜蹼，沉淀量多少及松紧状况。
2.赖氨酸选择性培养鉴定：菌株接种到YPD液体培养基活化24h后，按照1%的接种量接种到2 mL的无菌水中进行饥饿处理，7d后，划线接种到赖氨酸培养基，28℃培养5d后观察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到15d后仍无菌落生长的说明可能是酿酒酵母。测试结果为在赖氨酸培养基上不生长者为酿酒酵母。
通过上述酵母菌分离，形态学试验与赖氨酸选择性生长鉴定获知：
49份样液共分离到699株酵母菌，见表1，根据酵母菌在WL培养基上的形态和颜色，可将阿瓦提县不同发酵工艺慕萨莱思样液中分离到的699株酵母菌聚为20个培养类型，其中482株WL培养菌落特征为将奶油色，带或不带淡淡的绿色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油状， YPD液态培养无膜或蹼，试管底部具有白色紧实沉淀，YPD固体培养菌落为乳白色，奶油状，表面平滑，边缘整齐；通过赖氨酸培养基进行选择性培养鉴定，每株菌做三个重复，筛选不能生长的酵母有436株；对436株典型菌株进行细胞形态及孢子形态观察复检，进一步确认其分类地位。
通过上述形态鉴定及赖氨酸选择培养，将699分离株中436株初步鉴定为酿酒酵母，其中包括编号为LTSM-A1菌株，其菌落形态及显微形态参见附图2与附图3。
表1 慕萨莱思酵母菌分离源及分离株数
生理生化鉴定：
依据形态及赖氨酸选择性培养基初步确定编号为LTSM-A1的菌株进行糖发酵、碳氮源同化，抗防线菌酮，无维生素生长，尿素分解，重氮基蓝B等实验，进行生理生化鉴定
糖发酵实验：在糖发酵培养基分别加入葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麦芽糖，蔗糖利用杜氏管发酵法在28℃， 培养1周，其间每天观察并记录杜氏管内气体积存与否及其积存量，检测是否对测试糖具有发酵力。
碳源同化实验：生长普法，在氮源基础培养基中，测试葡萄糖，半乳糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，甲基葡萄糖甙，木糖，阿拉伯糖，海藻糖，松三糖，棉子糖，N－乙酰氨基葡萄糖，蜜二糖，木糖醇，丙三醇，山梨醇，赤鲜醇，环乙糖胺，肌醇，乳酸，柠檬酸， 28℃培养 2～3天后观察记录结果，检测其是否生长。
硝酸盐同化实验：生长普法，在碳源基础培养基中，加入硝酸钾，28℃， 2～3天后观察记录结果，检测其是否生长
脲酶试验：把脲素液体培养基用无菌操作，以0.5mL为一份分别放进许多试管中，并且深度冷冻储存六周。取一环生长1天或2天的酵母菌培养物，接种在上述培养基中，在37℃培养。每半小时检查一次试管颜色的变化，红色表示脲酶活性.所有呈阳性反应的酵母菌在4小时之内都能变成红色。
重氮基蓝B（DBB）试验：把培养在YPD固体培养基上至少10天的菌种，放在55℃数小时，然后浸淹在冰冷的DBB试剂中.如果该培养物在室温下2分钟内变成暗红色，那么该结果被记录为阳性。
抗放线菌酮实验：将新鲜活化的测试菌接入含0.01%及0.1%的培养基中进行28℃培养2-3d，观察期生长状况。
无维生素生长实验：将新鲜活化的测试菌接入无维生素生长测试培养基行28℃培养2-3d，观察期生长状况。
鉴定结果如下：编号为LTSM-A1可发酵葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麦芽糖，蔗糖，可同化的碳源为：葡萄糖，半乳糖，甲基葡萄糖甙，其余碳源测试均显示阴性，不能利用硝酸钾，脲酶试验，DBB实验，抗0.01%及0.1%放线菌酮实验，无维生素生长实验均为阴性，鉴定为酵母属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
选用的菌种编号为LTSM-A1，参照J.A巴尼特和R.W佩恩编著的《酵母菌的特征和鉴定手册》，Barnett等编著的《酵母菌：特征与鉴定》，张纪忠的《微生物分类学》，Cavazza（1992）等人及杨莹（2007）等人的文献报道，对LTSM-A1菌株进行形态学，生理生化鉴定。LTSM-A1菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101, 保藏日期是2013年04月23日，保藏号是CGMCC No.7512。经微生物学鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。该酵母经WL营养琼脂培养基培养，菌落特征为奶油色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油状；YPD固体培养菌落为乳白色，奶油状，表面平滑，边缘整齐；YPD液体培养基培养无膜或蹼，试管底部具有白色紧实沉淀；细胞形态为圆形或椭圆形，多端出芽，产孢子，孢子为圆形，孢子数为1个～4个；利用赖氨酸培养基进行选择性培养，为不生长；可发酵葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麦芽糖，蔗糖，可同化的碳源为：葡萄糖，半乳糖，甲基葡萄糖甙，乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、N－乙酰氨基葡萄糖、蜜二糖、木糖醇、丙三醇、山梨醇、赤鲜醇、环乙糖胺、肌醇、乳酸及柠檬酸测试均显示阴性，不能利用硝酸钾，脲酶试验、DBB实验、抗0.01%及0.1%放线菌酮实验及无维生素生长实验均为阴性；结合下述结果及经过26S rDNA同源分析、系统发育分析结果，将菌种编号为LTSM-A1菌株鉴定为酵母属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
序列分析鉴定：
DNA 提取：依据形态与生长特性鉴定及赖氨酸选择性培养基初步确定编号为LTSM-A1的菌株，测定其26S rDNA序列，与基因库中基因序列进行同源性比较，确定为酿酒酵母。无菌接种环挑取YPD平板上生长良好的单菌落于1.5mL无菌水离心管中，4℃ 12000 r/min，离心6 min，弃上清；取200 μL裂解液（100 mmol/L T ris,30 mmol/L EDTA,0.5% SDS），充分混匀使菌体完全悬浮；-80℃冰冻5 min（完全冻结），95℃水浴2 min（此步骤重复三次）；加入200 μL氯仿：异戊醇（24：1）后12000 r/min，室温离心5 min，将上清转移至另一无菌1.5 mL离心管中，加冰乙醇到1 mL，室温下自然沉降5 min，12000 r/min，离心5 min；弃上清液，加入500 mL 75%乙醇，12000 r/min，离心5 min；弃上清液，室温下自然风干沉淀；DNA沉淀用30 μL TE溶解，-20℃保存备用。经过26S rDNA PCR 扩增酵母菌基因组DNA中的26S rDNA基因片段。PCR反应体系总体积为25 μL，每管加入10 μL超纯水，12 μL 2×Taq PCR MasterMix（TaqDNA聚合酶0.05 units/ul，MgCl2 4 mM，dNTPs 0.4 mM），10 μmol/L引物各1 μL，模版DNA 1 μL。PCR反应条件为：预变性95℃ 5 min；变性94℃ 1 min，退火52℃ 1 min，延伸72℃ 1 min20 s，循环36次；总延伸72℃ 8 min。扩展反应在fcycler96孔PCR反应仪上进行。反应结束后取5 μL反应产物以1%琼脂糖凝胶在TE缓冲液中120 V，电泳30 min，染色5 min电泳检测，凝胶成像系统成像，符合条件的PCR产物进行序列测定，具体序列参见附后序列。
测序结果分析：将测序结果进行Blast 比对，挑选同源性为99%以上的菌株，及其他种属的菌株，利用Clastal 及MEGA 4.0 软件建立系统发育树，参见附图4，确定被鉴定菌株的发育地位。
对上述436株酿酒酵母发酵特性初筛后，对灰色关联度排序前10的酵母菌株进行26S rDNA 序列分析,菌种编号参见附图4，进一步鉴定其分子学分类地位。与参考菌株（Saccaromyces cerevisae HM191642）序列相似性＞99.9%，通过N-J法构建系统发育树，进一步验证此10株均与参考株Saccaromyces cerevisae HM191642聚类为一族，由此菌种编号为LTSM-A1鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），参见附图4。
（1）本发明中选用的编号为LTSM-A1酵母菌分离培养基采用YPD液体培养基和WL营养琼脂培养基如下：
YPD液体培养基（/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，溶于蒸馏水并定溶至1000 mL，pH值自然。YPD固体培养基加20 g琼脂，121℃高压灭菌20 min；WL营养琼脂培养基（/L）：酵母浸粉4 g，蛋白胨5 g，葡萄糖50 g，磷酸二氢钾0.55 g，氯化钾0.425 g，氯化钙0.125 g，硫酸镁0.125 g，氯化铁0.025 g，硫酸锰0.025 g，琼脂20 g，溴甲酚绿22 mg，pH 6.5，121℃灭菌20 min。
菌株保藏用保护剂：甘油
（2）本发明中选用的编号为LTSM-A1鉴定培养基及试剂：
YPD固液态培养基同上；WL营养琼脂培养基同上；Gorodkowa培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1% ，NaCl0.5% ， 琼脂2%，pH值自然，121℃灭菌 20 min；赖氨酸培养基，每升中含有：D-葡萄糖10 g，L-组氨酸1 mg，DL-蛋氨酸 2 mg，DL-色氨酸2 mg，对-氨基苯甲酸200 μg，生物素20 μg，叶酸2 μg，肌醇10 mg，烟酸400 μg，泛酸2 mg，盐酸吡哆醇400 μg，核黄素200 μg，盐酸硫胺素400 μg，硼酸500 μg，结晶氯化铜40 μg，碘化钾100 μg，结晶氯化铁200 μg，结晶硫酸锰400 μg，结晶钼酸钠200 μg，结晶硫酸锌400 μg，磷酸二氢钾850 mg，磷酸氢二钾150 mg，结晶硫酸镁500 mg，氯化钠100 mg，结晶氯化钙100 mg，赖氨酸盐酸盐2.5 g，琼脂20 g，pH值自然，121℃灭菌 20 min。
生理生化鉴定培养基：糖发酵培养基：0.5%酵母浸出物，121℃灭菌20min；碳源基础养基:(NH4)2SO4 0.5%，KH2PO40.1%，MgSO4.7H2O 0.05%，酵母膏0.02%，水洗琼脂2%，115℃灭菌15min；氮源基础培养基：每升含有碳源（D-葡萄糖）10g，氨基酸（L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg），生长因子（对—氨基苯甲酸200ug，生物素20ug，叶酸2ug，肌醇10ug，烟酸400ug，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400ug，核黄素200ug，盐酸硫胺素400ug），微量元素（H3BO3 500ug，CuSO4.5HO2 40ug），盐类（KI 100ug，FeCl3.6HO2 200ug，MnSO4.4HO2 400ug ，Na2MoSO4.2HO2 200ug，ZnSO4.7HO2 400ug），同化氮源，选择硝酸钾；脲素培养基：蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.2%，氯化钠0.5%，酚红0.0012%，琼脂2%，PH6.8灭菌后加入经过滤除菌尿素溶液，是尿素的最终浓度达到2%；抗放线菌酮培养基：每升中含有氨基酸（L-组氨酸10ug，DL-蛋氨酸20ug，DL-色氨酸20ug），3.5g硫酸铵以及0.01%和0.1%的放线菌酮，其余成分同氮源基础培养基；无维生素生长测试培养基：每升中含有氨基酸（L-组氨酸10ug，DL-蛋氨酸20ug，DL-色氨酸20ug），5g硫酸铵，不含生生长因子，其余同氮源基础培养基。
实施例二：优良菌株筛选实验
将上述筛选分离及初步鉴定的包括编号为LTSM-A1的436株酿酒酵母与5株商用酿酒酵母进行基本发酵特性测试分析，包括不同温度、糖度、酒度及低氮耐受性分析、起发性测定、产酒力、絮凝性、自溶性、产H2S能力、产生物胺特性的检测、果胶酶活性测定和β-葡萄糖苷酶活性测定分析如下：
1.分离株基本发酵特性测试分析
（1）不同温度、糖度、酒度及低氮耐受性分析：将鉴定后的包括编号为LTSM-A1的436株酿酒酵母与5株商用酿酒酵母进行适宜条件下（可吸收氮300mg/L，26%糖，28℃培养基）、高糖度（慕萨莱思合成培养基将其糖度调为45%和50%），不同酒精度（慕萨莱思合成培养基中含有8%，10%，14%，6%乙醇），不同温度（慕萨莱思合成培养基，13℃，37℃，45℃），低氮素（慕萨莱思合成培养基将可吸收氮设为56mg/L）条件下培养分析其耐受行为。其中温度28℃、可吸收氮源300mg/L、26%糖为各耐受条件测试中的其他控制条件。
新鲜培养物接种于5ml 上述培养液后，取300 μl培养物于96微孔板中，590 nm下测其OD1值。将培养物于28℃(耐温性以不同温度梯度为准)培养72 h后于590 nm下测其吸光度OD2。实验中以不接菌种的培养基作为空白试样ODk。增长倍数=（OD2-ODK2）/(OD1-ODK1)-1。
（2）起发性测定：将活化好的菌株接入发酵试管内，摇匀，28℃下培养，定期观察倒置杜氏管内气体集存与否及其积存量，每隔4 h记录一次。从接种到产气达到0.1mL所需时间定为起发时间，结果以下述方式表示：4表示从起发时间起4h之内所产气体充满杜氏管，其中4+表示时间短（约2h），4-表示时间稍微比较长（约4h）；3表示从起发时间起8h之内所产气体充满杜氏管；2表不从起发时间起12h之内所产气体充满杜氏管；1表示从起发时间起12h之后所产气体充满杜氏管。
(3)产酒力：将活化好的菌种接种到TTC下层培养基，28℃恒温培养24 h，倒入15 ml TTC上层培养基，覆盖原来菌落，28℃下避光保温2～3 h，观察菌落颜色。微红（产酒力弱），用1 表示；粉红（产酒力一般），用2 表示；深红（产酒力强），用3表示。
(4) 絮凝性：将待测菌接种于装有1.5 mL YPD 液体培养基的离心管中，28 ℃静置培养48 h后离心收集菌泥，用250 mmol/L EDTA 溶液及无菌水各清洗两次，离心收集菌体并悬于絮凝缓冲液（50 mmol/L柠檬酸钠，20 mmol/L CaCl2）中，用Biolog在波长590 nm 处测OD1 值；然后将细胞悬液置于25 ℃，120 r/ min 振荡2 h 至絮凝完成，室温静置30 min，取上清液在波长590nm 处测OD2 值。絮凝水平（F）=（OD1-OD2）/OD1×100%。F 值越大表示该酵母越容易絮凝。
(5)自溶性：将活化好的菌种接种于YPD-BCIP培养基，20℃培养24 h后转移到37℃环境中培养，24h后观察菌落颜色，根据其是否变化及变化的深浅来判断其自溶水平。
(6)产H2S能力测定：各测试菌株接种在BIGGY琼脂培养基上，于30℃培养4d~7d，持续观察菌落颜色变化，根据颜色深浅考察各测试菌株产H2S 能力。1：乳白色；2：浅棕色；3：棕色；4：深棕色；5：棕黑色。数值越高、颜色越深则表明H2S 产生能力越强。
(7)产生物胺特性的检测：将活化好的菌种接种到生物胺检测培养基中，25℃培养，3 d后观察菌落周围培养基颜色变化，当酵母菌对氨基酸脱羧产生碱性的生物胺时就会使培养基的pH 升高，菌落周围出现紫色圈。
（8）果胶酶活性测定：将活化好的菌种接种于聚半乳糖醛酸琼脂培养基30℃培养5 d。用灭菌的竹签刮除菌落后用蒸馏水冲净，用0.08 g/100 mL的钌红染色，6 h后观察其颜色变化，根据出现紫色圈与否判断其是否具有果胶酶活性，紫色的深浅代表产酶强弱。
（9）β-葡萄糖苷酶活性测定：将活化好的菌种接种于七叶灵甘油琼脂培养基，25℃培养，8d后观察菌落周围颜色变化，菌落周围培养基出现深褐色圈则说明具有β-葡萄糖苷酶活性。用游标卡尺测量黑褐色圈的直径，根据黑褐色圈直径的大小判断其产酶强弱。
（10）数据分析方法：运用加权灰色关联分析法对441株酵母（含5株商用菌）的上述基本发酵特性进行分析，筛选出前5株优良菌株。
通过上述酿酒酵母基本发酵特性分析及优良菌株筛选获知。
采用不同种类的合成培养基与半合成培养基，将鉴定后的436株酿酒酵母与5株商用酿酒酵母进行不同耐受性（耐糖度，耐酒精度，耐温度，低氮素等），起发性，絮凝性，自溶性，产生物胺特性，定性产酒力，产硫化氢的定量或定性分析，产果胶酶及β-葡萄糖苷酶能力测试，利用灰色关联度进行分析得到5株优良菌株，见表2。
筛选出灰色关联度排序前5株优良菌起发性均高于5株商用菌一个级别，1株产酒力中等，其余4株产酒力偏强，弱产硫化氢，不产生物胺，其余指标显示多数菌耐受性好，絮凝性，自溶性，及产果胶酶及β-葡萄糖苷酶良好，部分特性远远高于商用菌株，见表3、表4。
经过上述实验测定得知编号为LTSM-A1菌种在适可吸收氮300mg/L，糖度26Brix，28℃培养适宜生长条件下，其生长能力（其生物量）明显高于5株商用菌株，同时该菌株耐13℃低温能力最强，证明该菌株在低温培养中具有很好的生长繁殖能力，见表4，确定为低温发酵慕萨莱思候选优良菌株。同时该菌株耐高糖，耐低氮素的能力及快速起发性能，产酒适中，强絮凝性与强自溶性，亚硫酸盐还原酶活性(产硫化氢能力)弱，能产果胶酶及β-葡萄糖苷酶，不产生物胺，见表3、表4。
通过对阿瓦提慕萨莱思自然发酵过程中的酿酒酵母进行分离、筛选及初步鉴定，得到436株酿酒酵母，并对其耐受性，起发性，絮凝性等基本特性进行综合性评价，最终筛选出5株性能优良的筛选株，并对其26SrDNA序列测序分析， 进一步分析鉴定为酿酒酵母。利用慕萨莱思传统工艺，对已经鉴定的5株优良酿酒酵母在慕萨莱思工厂或传统作坊中，进行高温和低温的纯种发酵实验，对发酵过程中降糖特性，起发性，发酵周期及所酿制的慕萨莱思产品的酒度，残糖，总酸及感官特征进行分析，筛选出适宜低温发酵慕萨莱思的菌株LTSM-A1为低温菌株。
表2 前5株优良酵母菌及5株商用菌加权关联度
| 菌株编号 | 加权关联度 | 在441株菌中加强关联序 |
| LTSM-A1 | 0.941 | 1 |
| F1-7d2-04 | 0.939 | 2 |
| C1-AR3-03 | 0.938 | 3 |
| LTSM-1 | 0.933 | 4 |
| B3-23d1-02 | 0.928 | 5 |
| cy3079 | 0.908 | 8 |
| RZ | 0.882 | 16 |
| L2323 | 0.871 | 29 |
| EC118 | 0.871 | 29 |
| R796 | 0.869 | 33 |
表3 5株优良酿酒酵母菌和5株商用菌株基本发酵性能
表3注释：起发性评价：4表示从起发时间起4h之内所产气体充满杜氏管，其中4+表示时间短（约2h），4-表示时间稍微比较长（约4h）；3表示从起发时间起8h之内所产气体充满杜氏管；2表不从起发时间起12h之内所产气体充满杜氏管；1表示从起发时间起12h之后所产气体充满杜氏管；自溶性评价：1:蓝色；2：浅蓝；3：黄绿；4:乳白色；产果胶酶特性评价：0：不产；1：活性较弱；2：产，活性一般；3：产，活性较强；β-葡萄糖苷酶活性评价：0：不产；1：活性较弱；2：产，活性一般；3：产，活性较强；产酒力评价：1微红（产酒力弱）；2：粉红（产酒力一般）；3：深红（产酒力强）；亚硫酸盐还原酶评价：0：白色（不产）； 1：乳白色； 2：浅棕色； 3：棕色； 4：深棕色；5：棕黑色（非常强的酶活）；产果胶酶特性评价：0：不产；1：活性较弱；2：产，活性一般；3：产，活性较强；产β-葡萄糖苷酶活性评价：0：不产； 1：活性较弱；2：产，活性一般；3：产，活性较强；产生物胺特性：测试株对酪氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，色氨酸，精氨酸代谢产生物胺特性，0表示不产。
表4 5株优良酿酒酵母菌和5株商用菌株耐受特性
2.TTC下层培养基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母浸膏1.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 值5.5～5.7琼脂30.0 g/L，121℃高压灭菌 20min。
3.TTC上层培养基：TTC 0. 5 g/L，葡萄糖5.0 g/L，琼脂15 g/L，121℃高压灭菌 20min；慕萨莱思合成培养基的配制（每升）： 130 g 葡萄糖，130 g果糖，6 g柠檬酸，6 g DL-苹果酸，750 mg KH2PO4，500 mg KH2SO4，250 mg MgSO4·7H2O，155 mg CaCl2·2H2O，200 mg NaCl，4 mg MnSO4·H2O，4 mg ZnSO4，1 mg CuSO4·5H2O, 1 mg KI，0.4 mg CoCl2·6H2O，1 mg H3BO3，1 mg NaMoO4·2H2O，20 mg肌醇，2 mg烟酸，1.5 mg泛酸钙，0.25 mg维生素B1，0.25 mg维生素B6，and 0.003 mg生物素，15 mg麦角甾醇，5 mg油酸钠，0.5 ml吐温-80。氮源的组成(wt/wt)： 2.81%铵态氮 (NH4Cl)，39.03% L-脯氨酸，4.31%L-谷氨酰胺，23.46% L-精氨酸，3.13% L-色氨酸，2.58% L-丙氨酸，2.64% L-谷氨酸，2.03% L-丝氨酸，1.73% L-苏氨酸，1.75% L-亮氨酸，1.12%L-天冬氨酸，1.43% L-缬氨酸，2.34%L-苯丙氨酸，1.04% L-异亮氨酸，1.79% L-组氨酸， 1.32%L-酪氨酸，1.09%L-甘氨酸，6.49% L-赖氨酸，0.24%甲硫氨酸。过滤除菌。
4.耐受性测试培养基：（1）模拟葡萄汁中可吸收氮分别调整为56.03 mg/L及300 mg/L，形成低氮耐受性培养基及正常氮素生长培养基；（2）模拟葡萄汁中分别添加26%、45%及50%(wt/wt)葡萄糖和果糖（1︰1），形成不同糖度耐受性培养基；（3）模拟葡萄汁培养基中添加8%、10%、12%和14%（v/v）无水乙醇，形成不同酒度耐受性培养基；（4）温度耐受性培养基即为正常氮素生长培养基。
5.起发性：在试管中分装10 mL和田红葡萄熬煮汁，放入倒置的杜氏发酵管，用试管塞封口后轻轻反复倒置试管，使杜氏发酵管灌满葡萄汁，115℃高压灭菌15 min，备用。
6.自溶性检测培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，BCIP （5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸二钠盐）0.004%，121℃高压灭菌 20min
7.生物胺检测培养基：葡萄糖 2%，蛋白胨 2%，酵母膏 1%，琼脂2%，0.006% 溴甲酚紫，1%相应氨基酸（组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸和精氨酸），调pH值至6.3，121℃高压灭菌 20min。
8.果胶酶活性检测培养基：聚半乳糖醛酸1%，YNB 0.67%，磷酸二氢钾0.68%，葡萄糖1%，琼脂3%，121℃灭菌20 min（琼脂分开灭菌）。
9.β-葡萄糖苷酶活性检测培养基：1%七叶灵，0.03%三氯化铁，1%水解酪蛋白，0.8%甘油，2.5%酵母膏，2%琼脂，调pH值至6.0，121℃高压灭菌 20min。
实施例三：利用低温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7512低温发酵工艺制备慕萨莱思
将5株筛选株及cy3079商用菌（对照）于新疆阿瓦提刀郎慕萨莱思工厂及新疆吾孜好慕萨莱思私人古作坊进行25L的中试发酵试验，模拟慕萨莱思酵母的生长环境，以不接种菌种的自然发酵作为对照，探究这些酵母在传统酿造工艺及现代酿造工艺下对慕萨莱思品质的影响，以筛选出适合不同酿造工艺的优良菌株。
1.采用低温发酵工艺流程及操作具体如下：
（1）酒母制备：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7512在YPD固态培养基上的新鲜培养物，接入24Brix葡萄熬煮汁中培养24h，备用。
（2）原料筛选与冲洗：将石子等异物、霉烂果及青果等从成熟的葡萄原料中拣选出，拣选干净葡萄利用自来水将泥沙冲洗干净。
（3）榨汁：利用破碎机将上述步骤（2）拣选与冲洗后的葡萄除根破碎后，利用螺旋压榨机进行压榨，转移至不锈钢锅带盖的蒸锅。
（4）熬煮与冷却：将步骤（3）制备的皮渣中加以淹没皮渣为宜的水量，用煤火或材火大火煮开，而后用小火慢慢熬煮；熬煮时间12h，熬煮好的皮渣水色泽鲜亮，褐红；过滤后的皮渣水再与原汁以1:3（v:v）的比例混入大口锅继续用大火熬煮开，小火熬煮24 h，在熬煮的过程中不断的用纱布笊篱将泡沫漂去；用筷子或长条树枝蘸一滴熬煮液，滴在指甲盖上，来回晃动都不会掉下，甚至能倒挂，有韧性、有黏度，即可判断为熬煮结束，实测糖度22~26Brix，熄火，静置，自然冷却约24h 至室温；纱布笊篱采用给笊篱裹上过滤布。
（5）发酵：将上述步骤（4）熬煮液冷却后，装入预先洗干净，灭菌过的发酵容器，接入步骤（1）制备新鲜的酒母，接种量为总发酵液的1%（v/v），接种温度为25℃~28℃，在环境温度为10℃~20℃进行发酵，品温为12℃～20℃，最适宜发酵温度为16℃。在发酵过程中，每隔24h利用糖度计测定发酵液的Brix及利用温度计测试品温；直到糖度连续2～3d 不再降，定为发酵终点，结束发酵。
（6）后熟，杀菌及灌装： 发酵结束后，酒与酒渣放置40~45d，进行后熟，后熟温度不得超过20℃，将后熟好的慕萨莱思上清液导入干净容器中，进行65℃~75℃杀菌30min，冷却并将温度降至室温，而后进行灌装；若不及时灌装，将容器装满，在灌装前进行杀菌，杀菌条件同上。
2.发酵过程监测：在发酵过程中，每隔24h利用糖度计测定发酵液的Brix及利用温度及测试品温。直到糖度连续2～3d 不再降，定为发酵终点，结束发酵。
3.适合工厂工业化低温发酵实验结果与分析：依据慕萨莱思传统工艺对筛选株（以商用菌株cy3079及不接种的自然发酵为对照）进行低温发酵，其工艺流程参见附图1。在发酵过程中进行定期分析糖度及发酵产品的酒度，残糖，总酸及感官特征，其结果如下。
不论是自然发酵还是纯种发酵，底物（在此为糖）消耗规律符合Logistic变化规律，即yBrix = A2 + (A1-A2)/(1 + (xd/x0)^p)），但参数A1、A2和P值及模拟图形具有显著不同，见表5，参见附图5、附图6，其中自然发酵中糖度（Brix）变化规律明显不同于纯种发酵，前期发酵中，自然发酵长期处于发酵停滞阶段，而纯种发酵快速度过适应期，进入发酵期，加速了糖的降解，即酒精的发酵阶段。
低温显著影响酿酒酵母菌菌株的降糖特性，总体降糖水平参差不齐，LTSM-A1纯种发酵降糖率为测试中最小，参见附图7，在20d 发酵内，其糖度仅降了11.5Brix。上述实验结果证明低温纯种发酵可以生产不同含糖量的慕萨莱思。
筛选株的起发时间与发酵周期远远少于传统自然发酵(自然发酵的起发时间未13d, 发酵周期为30d)，起发时间在3天内，发酵周期在15天内（见表6）。综合分析酒度，总酸，总糖得到，LTSM-A1菌株酸度最低，总糖与还原最高，而酒度接近自然发酵，见表6。
表5低温发酵过程中糖度（Brix） 变化Logistic数学模型参数
表6筛选株低温发酵慕萨莱思特性统计表
| 菌株 | 起发时间d | 发酵周期d | 酒度% | 总酸g/L | 总糖g/L | 还原糖g/L |
| 自然发酵 | 13 | 30 | 8 | 8.13 | 95.2 | 32.5 |
| LTSM-A1 | 3 | 15 | 7.6 | 6.99 | 109.8 | 54 |
| B3-23d1-02 | 1 | 12 | 9.3 | 8.77 | 12.76 | 6.9 |
| C1-AR3-03 | 2 | 7 | 9.1 | 7.8 | 91.8 | 49 |
| GTGM-E2 | 1 | 6 | 10.4 | 7.15 | 6.1 | 4.6 |
| F1-7d2-04 | 1 | 10 | 9 | 7.64 | 91.3 | 32.5 |
| cy3079 | 1 | 6 | 8 | 7.31 | 91.5 | 24.3 |
综上所述，LTSM-A1是一款适合低温发酵甜型慕萨莱思理想菌株。
实施例四：慕萨莱思感官评定方法
邀请10位具有慕萨莱思品尝经验的专家及酿制慕萨莱思的专家，对上作坊酿制的慕萨莱思进行感官评定。由于慕萨莱思色泽，浊度及焦糖香与原料有直接关系，6株测试株（含1株商用菌）及自然发酵液来自于同一批次原料，发酵酒在色泽，浑浊度，典型性（焦糖香）之间很相近，依据慕萨莱思地方标准DB65/T 2925—2008，由专家对其进行做统一的定性描述；对受酵母菌影响较大的酵香特征与滋味特征进行秩次排序，按照国标GBT/12315—2008/ISO:8578进行统计分析，寻求所酿酒品之间的差异。依据慕萨莱思品质特点，排序指标设定为酵香，香气协调性，酸度，甜度，香气持久性，评尝员将品尝对比后的样品顺序填入以下感官评分表格，见表7。测试中，供试条件相同，试验代号采用随机2位数字，随机摆放于评价员面前进行品尝。
表7慕萨莱思感官评分表
| 指标 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 醇香 | |||||||
| 甜 | |||||||
| 酸 | |||||||
| 香气协调性 | |||||||
| 香气持久性 |
表8 7份低温酿制慕萨莱思感官评定F 检验显著性（α=0.05）
| 香气特征 | 醇香 | 甜度 | 酸度 | 持久性 | 香气协调性 |
| F值 | 3.636 | 11.656 | 2.224 | 4.618 | 6.194 |
| 显著值 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | 0.001 | 0.000 |
表 9 7份低温酿制慕萨莱思感官评定T-test 双尾检验（α=0.05）
感官评定可知，自选菌株、商用菌株及传统自然发酵酿造的慕萨莱思样品的典型特征（色泽，浑浊度，焦糖香）进行比较，所得酒品十分相近，均为砖红色，色泽幽暗，均匀浑浊，具有突出的焦糖香味。7份慕萨莱思测试样品， 醇香，甜度，香气协调性与持久性具有显著差异性，酸度无显著差异，见表8，其中LTSM-A1与自然发酵菌株在醇香、甜度、酸度、香气协调性与持久性均有显著差异性，与商用菌cy3079在醇香、甜度、香气持久性及协调性方面均有显著差异，见表9。B3-23d1-02 所酿慕萨莱思醇香味与自然发酵具有显著区别；F1-7d2-04 所酿慕萨莱思在醇香味与自然发酵有显著区别，与商用菌cy3079在醇香与香气协调性上均有显著区别；GTGM-E2 所酿慕萨莱思在甜度方面与商用菌有显著差异，C1-AR3-03与其香气协调性有显著差异，见表9。 考察感官品定秩次和，LTSM-A1 在醇香、甜度、香气协调性、持久性的秩次之和远远高于其他测试样品，其中甜度秩和为最高58，酸度在测试样中秩和最小为18，见表10，测试指标秩和顺序为：甜度＞香气协调性＞香气持久性＞醇香＞酸度。菌株LTSM-A1所酿的慕萨莱思特点是甜度偏高，香气协调性与持久性良好，酒味不突出，不刺激，具有淡淡酒香味，酸度不明显，所酿酒品明显好于其他样品。
通过上述实施例研究表明，LTSM-A1在可吸收氮300mg/L，糖度26Brix，28℃培养的适宜生长条件下，其生长能力明显高于5株商用菌株，在自选菌株中，仅次于GTGM-E2，耐13℃低温最强，能耐高糖，耐低氮素，耐高度酒精的能力及快速起发性能，产酒适中，絮凝性强与自溶性强，产硫化氢能力与商用菌株相当，能产果胶酶及β-葡萄糖苷酶，不产生物胺。低温发酵实验中，降糖率低，起发时间为3d，发酵周期为15d。用LTSM-A1酿制的慕萨莱思品质特点为：酸度低，总糖与还原糖高，而酒度接近自然发酵，具有慕萨莱思样品的典型特征（色泽，浑浊度，焦糖香），砖红色，色泽幽暗，均匀浑浊，具有突出的焦糖香味，口感偏甜，酸度适中，协调性与持久性适中，醇香淡雅，口感丰满，具有良好的均衡性，后尾悠长。综上，LTSM-A1是一款适合发酵甜型慕萨莱低温发酵菌株。
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<110> 塔里木大学
朱丽霞
<120> 26S rDNA 引物
<130> NL1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物 NL1
<400> 1
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
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<110> 塔里木大学
朱丽霞
<120> 26S rDNA 引物
<130> NL4
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物 NL4
<400> 1
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
SEQUENCE LISTING 3
<110> 塔里木大学
朱丽霞
<120> 一种慕萨莱思低温酿酒酵母
<130> LTSM-A1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 599
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
actgttcctt gttttttttt tacacgggta tgcttagtac ggcgagtgag cggcaaaagc 60
tcaaatttga aatctggtac cttcggtgcc cgagttgtaa tttggagagg gcaactttgg 120
ggccgttcct tgtctatgtt ccttggaaca ggacgtcata gagggtgaga atcccgtgtg 180
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tctaagtggg tggtaaattc catctaaagc taaatattgg cgagagaccg atagcgaaca 300
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actgcgacgt aagtcaagga tgctggcata atggttatat gccgcccgtc ttgaaccaa 599
Claims (3)
1.一种能生产慕萨莱思的低温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LTSM-A1，该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LTSM-A1的保藏号为CGMCC No.7512。
2.一种利用权利要求1所述的低温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LTSM-A1生产慕萨莱思的方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括：
（1）酒母制备：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LTSM-A1 CGMCC No.7512在YPD固态培养基上的新鲜培养物，接入24Brix葡萄熬煮汁中培养24h，备用;
（2）原料筛选与冲洗：将石子等异物、霉烂果及青果等从成熟的葡萄原料中拣选出，拣选干净葡萄利用自来水将泥沙冲洗干净;
（3）榨汁：利用破碎机将上述步骤（2）拣选与冲洗后的葡萄除根破碎后，利用螺旋压榨机进行压榨，转移至不锈钢锅带盖的蒸锅;
（4）熬煮与冷却：在步骤（3）榨出的葡萄皮渣中加以淹没皮渣为宜的水量，用煤火或材火大火煮开，而后用小火慢慢熬煮；熬煮时间12h，熬煮好的皮渣水色泽鲜亮，褐红；过滤后的皮渣水再与原汁以1:3（v:v）的比例混入大口锅继续用大火熬煮开，小火熬煮24 h，在熬煮的过程中不断的用纱布笊篱将泡沫漂去；用筷子或长条树枝蘸一滴熬煮液，滴在指甲盖上，来回晃动都不会掉下，甚至能倒挂，有韧性、有黏度，即可判断为熬煮结束，实测糖度22~26Brix，熄火，静置，自然冷却约24h 至室温；纱布笊篱采用给笊篱裹上过滤布;
（5）发酵：将上述步骤（4）葡萄熬煮汁冷却后，装入预先洗干净，灭菌过的发酵容器，接入步骤（1）制备新鲜的酒母，接种量为总发酵液的1%（v/v），接种温度为25℃~28℃，在环境温度为10℃~20℃进行发酵，品温为12℃～20℃，最适宜发酵温度为16℃，发酵至糖度不再下降为止，结束发酵; 在发酵过程中，每隔24h利用糖度计测定发酵液的Brix及利用温度计测试品温；直到糖度连续2～3d 不再降，定为发酵终点，结束发酵；
（6）后熟，杀菌及灌装： 发酵结束后，酒与酒渣放置40~45d，进行后熟，后熟温度不得超过20℃，将后熟好的慕萨莱思上清液导入干净容器中，进行65℃~75℃杀菌30min，冷却并将温度降至室温，而后进行灌装;若不及时灌装，将容器装满，在灌装前进行杀菌，杀菌条件同上。
3.一种利用权利要求1所述的低温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No.7512生产的慕萨莱思。
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