CN110343635A - 一株发酵酱增香的乳酸片球菌 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体为一株发酵酱增香的乳酸片球菌。该乳酸片球菌郫酿R036，已于2019年3月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:60617。本发明所述菌株乳酸片球菌郫酿R036能在4℃‑50℃条件良好生长，高温更利于其生长，在到37℃‑45℃生长速度最快；能耐受12％的盐，在含0％‑8％的盐浓度条件下正常生长；在pH为3.5～6的酸性条件下均能生长。本发明采用所述菌株制备成微生物菌剂，作为功能菌剂运用于豆瓣酱、酱油、食醋、豆酱、面酱、豆豉等传统发酵食品工业中，可优化生产工艺，改善产品风味，提高产品品质。

Description

一株发酵酱增香的乳酸片球菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体为一发酵酱增香的乳酸片球菌。

背景技术

乳酸菌(LAB)是中国传统发酵食品酿造过程中的重要微生物，与霉菌、酵母菌等微生物共发酵实现独特的产品品质。乳酸菌可利用原料中的糖类产生乳酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸，通过氨基酸代谢系统产生醋酸、丙酸、丁酸、戊酸等有机酸，这些有机酸除本身呈味外，还能与醇类反应生成酯类，构成食品中的芳香成分。此外，乳酸菌本身代谢也能产生核酸、腺苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤等。因此，经过乳酸菌发酵的食品可以产生独特的风味。

发酵酱类食品一般酸度和盐度均较高。因此筛选能够在酸度较高，盐度较高条件下生长良好，且能产生增香物质的乳酸菌，对提升发酵食品的品质有着重要作用。

然而，目前在发酵食品中添加耐盐酵母菌的研究较多，而在发酵过程中添加耐盐耐酸乳酸菌的研究相对较少。因此，筛选耐盐耐酸乳酸菌菌株,制成适合高盐高酸环境的专用菌剂，并将其运用到酿造过程中，对于传统发酵食品中多种风味物质的形成具有重要作用。

发明内容

本发明鉴于现有工业化生产发酵酱中可应用的增香菌种品种少，以及生产的发酵酱香味不足的问题，提供了一株发酵酱增香的乳酸片球菌。该菌种耐盐，可在高盐高酸度酿造环境下生长繁殖，能产生有机酸等风味物质，将其制备成高盐酿造专用菌剂，运用到传统发酵食品酿造过程中，可显著提高传统发酵食品的品质。

为了实现以上发明目的，本发明的技术方案为：

一株发酵酱增香的乳酸片球菌，Pediococcus acidilactici郫酿R036，于2019 年3月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60617。保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码为：510075，分类学名称为Pediococcus acidilactici.

该发酵酱增香的乳酸片球菌，Pediococcus acidilactici郫酿R036能在4℃-50℃条件下生长良好，高温更利于其生长，在到37℃-45℃生长速度最快；能耐受盐度为12％的盐，可在含0％-8％的盐浓度条件下正常生长；在pH为3.5～6的酸性条件下均能生长。

该发酵酱增香的乳酸片球菌可制备成菌产品并运用到酱油、豆酱、面酱或豆豉生产的发酵步骤，也可直接添加。

作为优选，利用以上所述乳酸片球菌制备成菌剂的方法，包括以下步骤：

(1)种子液的制备：将乳酸片球菌郫酿R036菌株活化后，吸取10mL郫酿R036种子液接种到3L的MRS液体培养基中，在37℃的培养箱中培养18 h，种子液OD₆₁₀值达到2.0；

(2)菌种扩大培养：采用500L发酵罐扩大培养，然后将活化好的3L种子液接种至接种在上述培养基中，培养温度为37℃，培养时间为18h；

(3)离心及冻干：将发酵完成的培养基离心收集菌体，将离心沉淀收集到的菌体与保护剂混合后直接冻干，低温离心得到菌体，按1:1(质量体积比) 加入20％海藻糖保护剂后，采用冷冻干燥机冻干48h(-60℃，0.1MPa)得到菌剂，测得菌剂中活菌数为1.08×10¹²CFU/g。

(4)步骤(2)中增菌培养基灭菌的条件为：温度100℃，时间60min，并用18％w/v的NaOH溶液将发酵液pH值调整为6.0。

将制备得到的乳酸片球菌郫酿R036菌剂在豆瓣酱酿造过程中的发酵步骤添加，可明显改善产品的风味。

该乳酸片球菌郫酿R036菌剂还适用于酱油、豆酱、面酱或豆豉生产的发酵步骤，可明显提升风味，提升产品品质。

本发明的积极效果体现在：

(1)本发明制备的高盐酿造专用菌剂，运用到豆瓣酱甜瓣子发酵过程中，得到的甜瓣子产品感官上瓣子形态完整，酱香味浓郁，呈红棕色；其理化及风味等指标都优于传统发酵产品。

(2)乳酸片球菌菌株在8％盐浓度条件下生长情况良好，在10％盐浓度条件下仍能保持一定的生长量，在12％盐浓度条件下仍能缓慢生长。这说明本发明的乳酸片球菌菌株的食盐耐受性强，完全适合工业上高盐酿造环境。

(3)根据实施例3的生长曲线图可以看出，该乳酸片球菌在接种2h后，便进入了生长对数期，接种10h后就进入了生长稳定期，这说明该菌环境适应能力强，且生长繁殖速度快。

(4)本发明利用耐盐乳酸片球菌制备一种适合高盐酿造环境的专用菌剂，该菌剂活菌数高达千亿级别。该专用菌剂使用简便，成本较低，通过添加该菌剂到传统发酵食品在酿造过程中，便可实现原料中蛋白质、淀粉等大分子物质的利用率增加，成品中风味物质种类增多，产品香气得到提升。该菌剂的使用可改善豆瓣酱、酱油、豆酱、面酱、豆豉等传统发酵食品风味物质可控度差的现状，提高了传统发酵食品的风味与产品质量。

(5)将本发明所述的郫酿R036菌剂运用到豆瓣酱甜瓣子的酿造过程，得到的甜瓣子产品营养丰富，产品质量符合国家标准，其中氨基酸态氮含量得到明显提高，优于不添加专用菌剂的普通酿造产品；风味物质种类和含量也得到大幅度提升，其中有机酸含量提升最为明显。菌剂的使用，对于甜瓣子产品的风味改善效果显著，可降低甜瓣子的发酵周期。

附图说明：

图1为本发明所述乳酸片球菌在MRS固体培养基上菌落形态图。

图2为本发明所述乳酸片球菌的细胞形态图。

图3为本发明所述乳酸片球菌的生长曲线图。

图4为本发明所述乳酸片球菌的系统发育树图。

具体实施方式：

为了使本发明的发明目的、技术方案及其有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

本申请文件中所使用的％，如无特殊说明，均表示其质量百分含量，即wt％。

本申请中的发酵酱增香的乳酸片球菌，Pediococcus acidilactici郫酿R036，于2019年3月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO： 60617。保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码为：510075，分类学名称为Pediococcus acidilactici.。

上述乳酸片球菌的形态学鉴定实验：

(1)菌落形态学观察：将本发明所述耐盐乳酸片球菌在MRS固体培养基平板上划线分离得到单菌落，该菌菌落形态如图1所示，其在MRS培养基上呈圆形菌落，菌落较小，凸起，乳白色，不透明。

细胞形态学观察：挑取该菌在MRS培养基上单菌落，进行革兰氏染色，显微镜观察观察。该菌细胞形态如图2所示，其显微结构为：直径约1μm，圆球形，细胞呈对生，革兰氏阳性菌。

乳酸片球菌郫酿R036的16S rDNA鉴定实验

细菌基因组总DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒操作进行。菌株的16S rDNA采用通用引物,通用引物序列为primer1序列：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；primer2序列: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA，PCR反应程序如下:95℃预变性5min；95℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸60s，进行35个循环后72℃延伸10min，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST 在线比对。通过在线比对结果显示，该菌株为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。

乳酸片球菌郫酿R036生长特性实验

(1)生长曲线的测定：将郫酿R036活化后，吸取1mL菌液接种到灭菌后的100mL的MRS液体培养基中，在37℃条件下培养，以不接种菌株的培养液作为空白对照，在610nm处每隔2h测定菌株培养液的吸光度值，研究菌株的生长特性。

该菌株生长曲线如图3所示，从生长曲线可以看出，接种2h后，郫酿R036 进入对数生长期，说明该菌环境适应能力强；接种10h后乳酸菌生长进入了生长稳定期，说明该菌生长繁殖速度快。

(3)耐酸性能实验：将菌株活化后，吸取1mL菌液接种到100mL不同 pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0)的MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，以不接种菌株的培养液作为空白对照，在610nm处测定菌株培养液的吸光度值，确定菌株生长与pH的关系。

表2菌株耐酸性能(OD₆₁₀值)

表2表明菌株在pH 3.0时OD₆₁₀值为0.088，说明在pH 3.0的环境下菌株不能正常生长。在pH 3.5时OD₆₁₀值为0.225，说明在pH 3.5的环境下菌株能缓慢生长，且随着pH的增大，菌株在酸性环境下仍能很好的生长。从本实施例得出本发明乳酸片球菌菌株的耐酸性能强，在pH值3.5～6.0范围内能正常生长，适合应用到传统发酵食品中。

(4)耐盐性能实验：将菌株活化后，吸取1mL的菌液接种到100mL不同盐浓度(0％、3％、5％、8％、10％、12％)的MRS液体培养基中，在37℃条件下培养，以不接种菌株的培养液作为空白对照，在610nm处测定菌株培养液的吸光度值，确定菌株生长与NaCl浓度的关系。

表3菌株耐盐性能(OD₆₁₀值)

表3表明，盐度在0～10％时，菌株能正常生长；当盐度为12％时，OD₆₁₀值仅为0.102，说明菌株在该盐度几乎不生长。本实施例得出本发明乳酸片球菌的耐盐范围为0～12％，说明该菌能够满足酿造高盐发酵食品的需求。

实施例1：乳酸片球菌高密度培养菌剂制备

(1)种子液的制备：将本发明的耐盐乳酸片球菌菌株活化后，吸取10mL郫酿R036种子液接种到3L的MRS液体培养基中，在37℃的培养箱中培养18h，种子液OD₆₁₀值达到2.0左右。

(2)菌种扩大培养：采用500L发酵罐发酵，将500LMRS培养基灭菌备用，灭菌条件为，温度为100℃，时间为60min，并用18％(w/v)的NaOH溶液将发酵液pH值调整为6.0。然后将活化好的3L种子液接种至上述培养基中，培养温度为37℃，培养时间为18h。

(3)离心及冻干：将发酵完成的培养基低温离心收集菌体，将离心沉淀收集到的菌体与保护剂20％的海藻糖按比例混合，混合后采用冷冻干燥机冻干48h (－60℃，0.1MPa)得到菌剂，测得菌剂中的活菌数为1.08×10¹²CFU/g。菌体的质量g与保护剂的体积mL的混合比例为1：1。

实施例2：

将实施例1中制备得到的乳酸片球菌菌剂用来改善甜瓣子品质的方法，具体步骤如下：

1甜瓣子制备

(1)烫瓣：脱壳的干蚕豆瓣5kg，去杂，加入适量沸水漂烫约3min，过滤，冷却。沸水的添加量以淹没豆瓣为准。

(2)接种制曲：以质量百分含量计，加入蚕豆瓣质量17％的面粉，加入蚕豆瓣质量0.03‰的曲精沪酿3.042；于湿度90％，温度37℃的曲房中培养48h，培养至12h翻曲一次。

(3)甜瓣子制作：将制好的豆瓣曲与盐水按质量比1:1(一次加入盐、水，盐的终浓度为15％)混合，搅拌均匀。加入乳酸菌菌剂郫酿R036至入甜瓣子中，乳酸菌的终浓度为10⁷CFU/g。甜瓣子在37℃条件下保温发酵60d。检测甜瓣子的感官、理化指标(氨基酸态氮、总酸)、有机酸含量。

2测定方法

2.1甜瓣子感官评价

参照GB/T20560-2006中豆瓣酱分级标准中的感官描述对甜瓣子进行描述。

2.2甜瓣子理化指标的测定

(1)总酸的测定：根据GB 5009.235-2016电位滴定法测定。

(2)氨基态氮的测定：根据GB 5009.235-2016电位滴定法测定。

2.3甜瓣子有机酸含量的检测

根据GB 5009.157-2016食品有机酸的测定来检测甜瓣子中有机酸。

3结果分析

3.1不同发酵方式甜瓣子感官评价

表4感官评价表

感官评价结果显示，实施例2(添加菌剂)生产的甜瓣子产品比对照组(未添加菌剂)的甜瓣子(其余步骤相同)香味更加浓郁丰富，说明耐盐乳酸片球菌的加入，促进甜瓣子风味物质的形成，丰富了产品风味。本实例制备得到的甜瓣子产品略有酸味，这是由于乳酸菌的加入，使得发酵体系中有机酸含量增加，口感更加丰富。

3.2不同发酵方式甜瓣子理化指标的分析

氨基酸态氮和总酸含量是评价豆瓣酱甜瓣子质量好坏的重要理化指标之一。添加乳酸菌剂R036发酵60d的甜瓣子氨基态氮含量为0.804g/100g，总酸含量为2.849g/100g；对照组氨基态氮含量为0.807g/100g，总酸含量为2.023 g/100g。乳酸菌剂R036对氨基态氮含量的影响较小，而对总酸含量的生成有一定的促进作用，添加R036菌剂的甜瓣子总酸含量略高于对照组。

3.3不同发酵方式甜瓣子有机酸含量分析

实施例2添加了菌剂发酵的甜瓣子的理化指标优于对照组未添加菌剂发酵的甜瓣子，为了进一步分析其风味口感上的差异，对甜瓣子有机酸进行了检测。

表5郫酿R036菌剂发酵甜瓣子中有机酸含量统计

由表5可知，郫酿R036促进有机酸的形成，测定的有机酸总量为27.08 mg/g，而空白组有机酸总量为19.63mg/g。甜瓣子中以乙酸、乳酸、苹果酸、丁二酸、柠檬酸为主要的有机酸，以乙酸含量最为突出，分别为15.00mg/g和 9.50mg/g。添加郫酿R036发酵甜瓣子对乙酸、乳酸、苹果酸的增强作用最明显。其中乳酸含量由空白组的1.86mg/g增加到2.17mg/g，苹果酸由空白组的 2.15mg/g增加到3.71mg/g，乙酸含量由空白组的9.50g/mg增加到15.00mg/g。乳酸在食品中具有相溶性，它具有柔和的酸味，不掩盖食品中其它柔和的芳香味。乳酸含量的增加，使得甜瓣子口感更加柔和，不刺激。有机酸含量之间的变化，是因为耐盐乳酸片球菌的作用，促进了糖酵解和三羧酸途径的发生，消耗糖类，形成有机酸。

由本实例可以得出：通过在豆瓣酱甜瓣子酿造过程中添加耐盐乳酸片球菌制成的高盐酿造专用菌剂，从而使得甜瓣子产品质量得到提高，风味得到改善。

实施例3：乳酸片球菌郫酿R036在高盐稀态酱油醅发酵中的应用

1.乳酸片球菌强化酱油发酵方法

将充分浸泡的黄豆蒸熟，冷却后将熟制黄豆与面粉按照质量比为5：1混合，同时按照总质量的0.03‰接入米曲霉孢子粉，将物料置于35℃、相对湿度 90％的环境培养48h，即制得酱油成曲，将酱油成曲与质量体积分数为25％的食盐水按照质量比为1：3混合，加入实施例1中制备得到的乳酸片球菌菌剂，使其终浓度为10⁷CFU/g。于30℃发酵90d，过滤得到酱油。头渣按照将酱油醅与食盐水质量比为1：1加入质量体积分数为15％的食盐水，浸泡48h后抽取浸出液，即制得酱油。

采用甲醛滴定法测定酱油总酸、氨基酸态氮含量；采用GB5009.157－2006 测定甜瓣子中有机酸含量。

2.结果分析

2.1酱油总酸、氨基态氮含量

乳酸片球菌郫酿R036强化发酵的酱油总酸含量为2.302g/100g，氨基态氮含量为0.912g/100g；空白组总酸含量为2.115g/100g，氨基态氮含量为0.892 g/100g。郫酿R036的强化提高了酱油中总酸含量，对氨基态氮含量影响较小。 2.2酱油中有机酸含量

酱油中有机酸的含量如表1所示，乳酸菌剂郫酿R036能明显提高酱油中乳酸和乙酸的含量，尤其是乙酸，空白组乙酸含量为10.28mg/kg，而郫酿R036 强化的酱油中乙酸含量增加到14.57mg/kg。

表6乳酸菌剂郫酿R036强化发酵酱油中有机酸含量统计

由表6可以得出：通过在酱油酿造过程中添加耐盐乳酸片球菌制成的高盐酿造专用菌剂，从而使得酱油中有机酸的组成有所改变，其中乳酸和乙酸含量得到明显提升，风味得到改善。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

SEQUENCE LISTING

<110>四川省食品发酵工业研究设计院

<120>一株发酵酱增香的乳酸片球菌

<130>2019

<160>1

<170> PatentIn version 3 .5

<210>1

<211>1476

<212>DNA

<213>乳酸片球菌

<400>1 tactctgtgaccttagacggctagctcctaaaaggttaccccaccggctttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggttttaagagattagctaaacctcgcggtttcgcgactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaactgaatgctggcaactagtaataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattctgtccccgaagggaacgcctaatctcttaggttggcagaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcttttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggattacttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagtaatcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtctcccagtttccaatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacattagacttaaaagaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaaataccgtcactgggtgaacagttactctcacccacgttcttctttaacaacagagctttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgcatcatcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatccagaagtgatagcagagccatcttttaaaagaaaaccaggcggttttctctgttatacggtattagcatctgtttccaggtgttatcccctgcttctgggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcacttcatattaaaatctcattcagtgcaagcacgtcatgatcaattaacggaagttcgttcgacttgcattatagcacgccgcc

Claims (6)

1.一株发酵酱增香的乳酸片球菌，其特征在于：该乳酸片球菌郫酿R036，于2019年3月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60617。

2.如权利要求1所述的发酵酱增香的乳酸片球菌，其特征在于：该乳酸片球菌郫酿R036在4℃-50℃条件生长良好，在37℃-45℃生长速度最快；在含0％-8％的盐浓度条件下正常生长，耐受盐度为12％；在pH为3.5～6的酸性条件下正常生长。

3.利用如权利要求1所述发酵酱增香的乳酸片球菌制备成菌剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)种子液的制备：将乳酸片球菌郫酿R036菌株活化后，吸取10mL郫酿R036种子液接种到3L的MRS液体培养基中，在37℃的培养箱中培养18h，种子液OD₆₁₀值达到2.0；

(2)菌种扩大培养：采用500L发酵罐扩大培养，将500LMRS培养基灭菌，然后将活化好的3L种子液接种至上述培养基中，培养温度为37℃，培养时间为18h，培养至发酵终点；

(3)离心及冻干：将发酵液低温离心得到菌体，按1:1(质量体积比)加入20％海藻糖保护剂后，采用冷冻干燥机冻干48h(-60℃，0.1MPa)得到菌剂，测得菌剂中活菌数为1.08×10¹²CFU/g。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中增菌培养基灭菌的条件为：温度100℃，时间60min，并用18％w/v的NaOH溶液将发酵液pH值调整为6.0。

5.如权利要求3中所述方法制备得到的菌剂的应用，其特征在于：将制备得到的乳酸片球菌郫酿R036菌剂在豆瓣酱酿造过程中的发酵步骤添加，可明显改善产品的风味。

6.如权利要求3中所述方法制备得到的菌剂的应用，其特征在于：该乳酸片球菌郫酿R036菌剂还适用于酱油、豆酱、面酱或豆豉生产的发酵步骤，明显提升风味。