CN111979148A - 糖多孢菌组合物及其在食品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了糖多孢菌组合物及其在食品中的应用，属于食品发酵技术领域。本发明从麦曲中筛选获得了具有降低生物胺含量作用的披发糖多孢,J2，和江西糖多孢菌J3，将两个菌株制备混合糖多孢菌制剂用于发酵酒精饮品、发酵食品或发酵调味品制备过程中，能够在降低生物胺含量的同时提高氨基酸含量、提高发酵产品的营养价值，进而达到增强发酵食品品质、提高发酵食品安全性的作用，具有广阔的应用前景。

Description

糖多孢菌组合物及其在食品中的应用

技术领域

本发明涉及糖多孢菌组合物及其在食品中的应用，属于食品发酵技术领域。

背景技术

黄酒是一种酿造酒，一般以糯米、玉米和黍米为原料，添加麦曲、酵母作为糖化剂、发酵剂，经蒸煮、加曲、糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成。黄酒中除含有水、乙醇主要成分外，还含有18种氨基酸，其中包括8种必需氨基酸，这8种氨基酸比同量葡萄酒、啤酒中多数倍，经常饮用黄酒有益于身体健康；黄酒中含有丰富的抗氧化物质，如多酚、多糖、多肽等，具有抗氧化活性。黄酒酿造不同于啤酒和葡萄酒，采用开放型发酵工艺，发酵体系中氨基酸含量丰富，微生物种类复杂数量繁多，细菌群落结构复杂，参与发酵的细菌主要有醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌、糖多孢菌等。但是微生物的代谢产物在给黄酒带来独特风味的同时也会使黄酒中含有一些有害物质，如生物胺等。

生物胺是一种含氮有机碱性小分子化合物，由氨基酸脱羧形成，普遍存在于动植物和微生物体内，适量生物胺能够促进生长、清除自由基、增强代谢活性、增强免疫力，在人体内具有重要的生理功能，但过量生物胺的摄入则会引起动脉、血管和微血管的扩大，导致腹泻、头痛、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应，甚至会导致死亡。生物胺广泛存在于多种食品中，在酸奶、黄酒、白酒、料酒、酱油、食醋和葡萄酒等发酵食品中含量尤为丰富。

发酵食品中的生物胺主要是由微生物代谢产生的氨基酸脱羧酶作用于游离氨基酸形成的。发酵过程中微生物代谢产生蛋白酶和羧肽酶作用于谷物中的蛋白质，分解产生低分子肽和氨基酸，为生物胺的生成提供了丰富的前体物质，在氨基酸脱羧酶，将会造成生物胺的大量生成。

目前，国内外研究中尚未有关于将糖多孢菌应用于食品发酵及降生物胺方面的报道。因此，利用现代生物技术，筛选优良性能的微生物对于生产高质量、高产量、风味独特优质发酵食品，以及提高发酵食品的安全性具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于解决现有传统酿造食品中生物胺含量较高的问题，提供性能优良的糖多孢菌应用于酒类(白酒和黄酒)、香肠和酱油的发酵过程进行生物强化，以降低发酵食品中的生物胺含量，提高食品的口感和风味，更好的发挥放线菌在传统发酵食品中的应用。

本发明的第一个目的是提供

糖多孢菌组合物，含有披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute)J2和江西糖多孢菌(Saccharopolysporajiangxiensis)J3；

所述披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute)J2，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020103；

所述江西糖多孢菌(Saccharopolysporajiangxiensis)J3，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2020104。

本发明的披发糖多孢菌J2和江西糖多孢菌J3，均具有如下优良的性能：

(1)应用于食品发酵体系，不会影响到食品的正常发酵；

(2)该菌株制作的纯种麦曲适用于黄酒的发酵，可以提高黄酒中氨基酸含量；

(3)生物胺产生量均小于2.5mg/L，生物胺检出量极少；

(4)对酪胺、组胺、腐胺、尸胺均有降解作用；

(5)可以适用于香肠、黄酒、白酒和酱油发酵，并且具有降生物胺的能力。

本发明的第二个目的是提供含有所述糖多孢菌组合物的微生物制剂。

在一种实施方式中，所述每克或每毫升发酵剂中的糖多孢菌的数量≥1×10⁶CFU。

在一种实施方式中，所述微生物制剂是将所述糖多孢菌接种至放线菌液体培养基中，28～30℃培养获得含有糖多孢菌细胞的发酵剂。

本发明的第三个目的是提供应用所述糖多孢菌组合物制备的曲，其制备方法为：将原料破碎经加水搅拌、灭菌后，在无菌环境下接入菌种，接种量为5‰-15％，菌液浓度为10⁵～10⁸cfu/mL，25～55℃培养72～96h，培养结束后，保藏备用。

在一种实施方式中，所述糖多孢菌曲原料蒸煮后在无菌条件下摊凉；接入曲和原料混匀过程，以及后期开耙过程均在无菌环境中进行；所述糖多孢菌曲在无菌环境中接种和培养得到。

在一种实施方式中，所述曲是应用所述披发糖多孢菌J2或所述江西糖多孢菌J3制备的纯种麦曲混合后的混合麦曲。

在一种实施方式中，所述麦曲的制备方法包括如下步骤：

(1)碾麦：小麦破碎程度为每粒3-5片，带少量粉末，使麦粒组织破碎，淀粉外露；

(2)润麦：向步骤(1)处理后的物料中物料质量加入30-40％的清水，搅拌15-25min，使其充分均匀的吸收水分；

(3)蒸煮灭菌：将步骤(2)处理后的物料蒸煮灭菌；

(4)接种：待步骤(3)的物料降温至低于40℃后，接种活化后的披发糖多孢菌J2，接种浓度为10⁵～10⁶CFU/mL；

(5)发酵。

在一种实施方式中，所述步骤(5)的发酵包括如下步骤：

a)孢子发芽期：曲料进盘6小时后，品温缓慢上升至34-35℃左右，自控模式启动小风量间接通风，每次5-10分钟，间隔2小时，使品温降到32℃，要求均匀吹透；

b)菌丝生长期：间歇通风3-5次后，菌丝开始生长，品温升至35℃以上，曲料开始结块，此时应连续通风，维持品温35±2℃；

c)菌丝繁殖期：接种后12小时，品温上升较快，此时应视第一次结块情况进行翻曲，翻曲前，先升起测温探头，开启翻曲机，后摊平，放下测温头，开启通风及喷雾系统；

d)第一次翻曲后，品温保持在36-37℃之间，保持通风喷雾顺畅，约20小时后，曲料再次结块，眼观曲料发白，温度控制在37℃以下，进行第二次翻曲，二次翻曲过后，品温应控制在35±2℃。

本发明的第四个目的是提供所述混合麦曲在发酵黄酒中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述混合麦曲在制备发酵食品、饮品或调味品中的应用。

在一种实施方式中，所述食品包括但不限于香肠的发酵或半发酵食品。

在一种实施方式中，所述饮品包括但不限于黄酒或白酒发酵。

在一种实施方式中，所述调味品包括但不限于酱油或香肠。

在一种实施方式中，所述应用是采用所述混合麦曲与酿酒原料混合后进行发酵。

在一种实施方式中，所述方法是将纯种麦曲按照12～16％的接种量在发酵罐中与米饭、酒母等原料混匀后进行发酵，发酵采用传统发酵工艺。

本发明的第六个目的是提供所述糖多孢菌组合物或混合麦曲在香肠、黄酒、白酒、酱油中降生物胺的应用。

在一种实施方式中，所述生物胺包括但不限于酪胺、组胺、腐胺、尸胺。

在一种实施方式中，所述酿造黄酒和白酒是先利用所述糖多孢菌制成纯种曲，添加到酒类的发酵中。

本发明的有益效果：

(1)本发明的菌株应用于食品发酵体系，不会影响到食品的正常发酵；

(2)添加糖多孢菌复合菌剂发酵黄酒中氨基酸的含量最高；菌株的添加对传统黄酒风味影响均不明显；对生物胺含量的降低降低效果相比于对照组降低了42.17％，提高了黄酒中氨基酸态含量和营养价值，达到了提高黄酒中氨基酸和挥发性物质含量和提升黄酒品质目的；

(3)糖多孢菌复合菌剂具有降生物胺效果，添加复合菌剂的臭鳜鱼生物胺含量比对照组下降了20.87％，用于生产料酒可使料酒中的生物胺含量相比较对照组降低23.16％，用于生产食醋食醋可使生物胺含量相比较对照组降低了25.08％。

生物材料保藏

江西糖多孢菌(Saccharopolysporajiangxiensis)J3，分类命名为江西糖多孢菌(Saccharopolysporajiangxiensis)J3，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020104。

披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute)J2，分类命名为披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute)J2，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020103。

附图说明

图1为糖多孢菌J2的系统发育树。

图2为糖多孢菌J3的系统发育树。

图3为黄酒发酵过程中理化指标的变化；(A)酒精度；(B)还原糖；(C)可滴定酸；(D)氨基酸态氮。

图4为糖多孢菌J2黄酒发酵样品风味物质的主成分分析。

图5为糖多孢菌J3黄酒发酵样品风味物质的主成分分析。

具体实施方式

黄酒理化指标的检测：酒精度、氨基酸态氮和总酸的测定按照GB/T 13662-2018进行测定。生物胺含量风味物质采用高效液相(HPLC)和气质联用仪器(GC-MS)进行检测。还原糖含量测定采用DNS方法。

香肠理化指标的检测：粗蛋白含量按照GB5009.3-2010半微量凯氏定氮法进行测定；水分含量按照GB/T 9695.15-2008方法进行测定。pH测定：取10g样品加入90mL蒸馏水匀浆后静置2min，用pH计测定上清液pH值。

生物胺含量测定方法：准确量取1mL待测液于15mL离心管中，加入1mL饱和NaHCO₃溶液，混匀，加入2mL丹磺酰氯(5mg/mL丙酮)试剂，混匀后置于65℃恒温水浴锅中黑暗衍生30min，室温静置后，加入0.5mL饱和NaCl溶液，混匀后加入5mL乙醚，涡旋振荡20s，静置分层后，转移上层有机相于15mL离心管中，下层水相再萃取一次，合并两次萃取液，50℃水浴下氮气吹干。加入1mL乙腈振荡混匀，溶解残留物，过0.22μm滤膜，通过高效液相色谱法(HPLC)测定。

实施例1：糖多孢菌的筛选及鉴定

(1)样品的采集及预处理

麦曲样品采自浙江省绍兴市某黄酒厂，采集的麦曲置于密封的无菌塑料袋中4℃保存。称取5g麦曲于50mL离心管中，添加30mL蒸馏水放入30℃摇床培养箱中培养30min。

(2)菌株的平板筛选

放线菌筛选培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃)。

在无菌操作环境下，用无菌移液枪吸取1mL样品置于15mL无菌离心管中，加无菌水至10mL，充分混匀，制成10^-1的样品匀液。用无菌移液枪吸取10^-1样品匀液1mL于15mL无菌离心管中，加无菌水至10mL，充分混匀，制成10^-2的样品匀液。按上述操作，以此制成10^-1～10^-6十倍递增系列麦曲、米浆水、发酵醪稀释匀液。

分别吸取麦曲、发酵醪、米浆水各稀释度菌液100μL涂布于放线菌筛选培养基，28℃培养1～7d。在菌落密度适中的平板上挑取单个乳白色、菌落薄、有隆起或凸面、略皱的菌落，分别划线接种到放线菌筛选培养基上，反复划线确定纯菌落，并保存筛选菌株。

(3)菌株鉴定

提取筛选菌株的基因组，并对筛选菌株进行16S rDNA扩增测序。

PCR扩增引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

PCR扩增体系(50μL)为：2×Taq PCR Master Mix 25μL，上下引物各1μL，模板1μL，加无菌水22μL补充至50μL。

PCR扩增程序：94℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸8min。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并送交基因测序公司测序，根据返回的测序结果，通过NCBI官网进行BLAST序列比对，用所得的16S rDNA序列进行BLAST比对，并进行了系统发育分析，结果如图1～2所示，菌株J2的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)与糖多孢菌S.hirsute(GenBank登录号：MN515057.1和NR_118870.1)的同源相似性达在98.30％以上，将菌株命名为披发糖多孢菌J2。菌株J3的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)与糖多孢菌属S.jiangxiensis(GenBank相似序列号：MG255179.1)的同源相似性在98.84％以上，将该菌株命名为江西糖多孢菌J3。

(4)披发糖多孢菌J2菌株生物胺代谢能力的分析

菌种活化：将保藏的披发糖多孢菌J2接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，30℃摇床培养48h，得一级种子液。将活化的菌株接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，摇床培养48h，转速150r/min，温度30℃。

样品预处理：将菌种分别接种于检测生物胺产生培养基和检测生物胺降解培养基中，28℃摇床培养5d，12000r/min离心5min收集上清液。

放线菌液体培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃)。

检测生物胺产生培养基：放线菌液体培养基中添加L-酪氨酸0.4g/L，L-组氨酸1g/L，L-赖氨酸1g/L，L-鸟氨酸1g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05g/L。

检测生物胺降解培养基：放线菌液体培养基中添加50mg/L生物胺(包括组胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺、色胺、β-苯乙胺)，调节pH至6.0-6.2。

披发糖多孢菌J2降生物胺效果分析：在检测生物胺产生培养基和检测生物胺降解培养基中培养后的披发糖多孢菌J2的生物胺产生量小于2.5mg/L，生物胺检出量极少，表明基本上没有检测到生物胺的含量，因此认为不产生生物胺。披发糖多孢菌J2对酪胺的降解率为77.41％，对组胺的降解率达到100％，对腐胺的降解率达到58.1％，对尸胺的降解率达到47.71％，对总生物胺的降解率达到72.98％，说明菌株均有良好的降生物胺的能力。

(5)糖多孢菌J3生物胺代谢能力的分析

对江西糖多孢菌J3降生物胺效果进行分析：在生物胺前体存在的培养基中培养后的江西糖多孢菌J3的各类生物胺产生量均小于2.5mg/L，生物胺检出量极少，表明基本上没有检测到生物胺的含量，因此认为不产生生物胺。江西糖多孢菌J3对酪胺的降解率分别81.55％，对组胺的降解率分别达到100％，对腐胺的降解率分别达到51.8％，对尸胺的降解率分别达到40.01％，对总生物胺的降解率达到69.09％。说明该菌株具有良好的降生物胺的能力。

实施例2：糖多孢菌的活化培养

放线菌液体培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃下测定)。

PDA培养基：马铃薯粉6.0g/L；葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L，pH 5.4-5.8，121℃高压灭菌15min；固体培养基在此基础上添加。

MRS培养基：牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖20g/L，吐温800.10g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.28g/L。

将实施例1筛选的披发糖多孢菌J2接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，30℃摇床培养48h，得一级种子液。将活化的菌株接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，摇床培养48h，转速150r/min，温度25～45℃，获得菌浓为10⁵～10⁶cfu/mL的菌液，待培养成熟后用于纯种麦曲的制备。

将保藏的黄曲霉(Aspergillus flavus)和米曲霉(Aspergillus oryzae)接种到PDA平板上，28℃培养3～5天；然后用无菌水清洗孢子液，再次转接到PDA茄形瓶中，温度28℃培养3～5天，获得菌浓为10⁵～10⁶cfu/mL的菌液，待孢子成熟后用于纯种麦曲的制作。

将保藏的乳杆菌L.plantarum(Lactobacillus plantarum)接种到MRS培养基中，接种量10％，37℃恒温厌氧培养24h，得到一级种子培养液，将活化的种子液再次接种到MRS液体培养基中，接种量为10％，37℃恒温厌氧培养24h，获得菌浓为10⁵～10⁶cfu/mL的菌液，菌种培养成熟后用于纯种麦曲制作。

实施例3：糖多孢菌纯种麦曲的制备

(1)碾麦：小麦破碎程度为每粒3-5片，带少量粉末，使麦粒组织破碎，淀粉外露；

(2)润麦：向步骤(1)处理后的物料中加入约35～40％的清水，搅拌20～25min，使其充分均匀的吸收水分；

(3)蒸煮灭菌：将步骤(2)处理后的物料于121℃灭菌30min；

(4)接种：待步骤(3)的物料降温至36℃后，接种实施例2的活化菌种，接种菌液浓度为10⁵～10⁶cfu/mL，，接种量为5‰-15％。

(5)曲料进盘后保持适当品温及室温，静置培养六小时左右。

a)孢子发芽期：曲料进盘六小时后，品温缓慢上升至34-35℃左右，自控模式启动小风量间接通风，每次5-10分钟，间隔2小时，使品温降到32℃，要求均匀吹透。

b)菌丝生长期：间歇通风3-5次后，菌丝开始生长，品温升至35℃以上，曲料开始结块，此时应连续通风，维持品温35℃左右。

c)菌丝繁殖期：接种后12小时，品温上升较快，此时应视第一次结块情况进行翻曲，翻曲前，先升起测温探头，开启翻曲机，后摊平，放下测温头。开启通风及喷雾系统。

d)第一次翻曲后，品温保持在36-37℃之间，保持通风喷雾顺畅，约20小时后，曲料再次结块，眼观曲料发白，温度难以控制在37℃以下，进行第二次翻曲，二次翻曲过后，品温应控制在35℃左右。

(6)出曲：培养72～96h；培养结束后，将麦曲置于4-7℃冰柜中储藏备用；

按照以上方法分别制备获得菌体数量级为10¹⁵CFU/g的披发糖多孢菌J2纯种麦曲、江西糖多孢菌J3纯种麦曲。

实施例4：糖多孢菌混合麦曲的制备

将实施例3制备的披发糖多孢菌J2纯种麦曲和江西糖多孢菌J3纯种麦曲以任一比例混合，制备获得混合麦曲。

可选地，用于酿酒酒精饮品发酵的混合麦曲是将披发糖多孢菌J2纯种麦曲和江西糖多孢菌J3以1:(0.8～1.5)的质量比混合。

实施例5：糖多孢菌纯种麦曲在黄酒发酵中的应用

(1)本实施例所选取的传统黄酒发酵的原料配比(以每升发酵体积计)为：

蒸熟的米饭：500g；清水417L；酒母：38g；

(2)传统黄酒酿造过程

a)酵母活化培养：将甘油保藏管的酵母菌，在无菌操作台进行转接到YPD培养基中，30℃，150r/min条件下培养24h；然后转接到制备好的酒母中，将转接好的酵母在30℃，150r/min条件下，进行培养18-24h，备用。

b)酒母的制作：取600g蒸熟的米饭，加入1600mL清水，60g生麦曲，800U/g米饭的糖化酶进行糖化，糖化的温度控制在55-65℃，时间3-4小时，糖化结束后外观糖度不低于12°Bx后，115℃灭菌15min，灭菌后冷却至24～31℃，接入成熟的酵母种子培养液5％，培养温度不超过30℃，培养时间24h，培养成熟后即得酒母。

c)按照步骤(1)所述的传统黄酒发酵的原料配比进行落料和发酵。实验组：纯种麦曲：45.3g对照组：生麦曲：39.3g；熟麦曲：6.0g。

前四天为前酵阶段，温度控制在28～30℃，发酵4d，前4d每天开耙不少于1次，头耙时间8-10h；后酵阶段，温度为13～15℃，每天搅拌开耙一次，持续发酵10～15d。

对照组(TF Control)是将本实施案例中(3)中的纯种麦曲调整为工厂取样的生麦曲39.3g/L和熟麦曲6.0g/L。

实施例6：糖多孢菌混合麦曲在黄酒发酵中的应用

混合麦曲发酵组采用披发糖多孢菌J2纯种麦曲和江西糖多孢菌J3纯种麦曲的复配麦曲与酿酒酵母采用传统酿造方法共同发酵。

复合菌剂组(Mix)按照菌体数量1:1的比例添加披发糖多孢菌J2纯种麦曲和江西糖多孢菌J3纯种麦曲，添加量共45.3g。

黄酒发酵过程中理化指标的变化：为了进一步验证糖多孢菌在黄酒发酵中的作用，对比了传统麦曲和纯种麦曲发酵过程中理化指标(酒精度，还原糖，可滴定酸和氨基酸态氮)的变化。纯种发酵共分为4组，分别为A.flavus(黄酒发酵中的常用菌),A.oryzae(日本清酒酿造中的常用菌,S.hirsuteJ2和L.plantarum，这4种纯种麦曲分别与酿酒酵母采用传统酿造方法共同发酵。发酵结束，酒精度、还原糖、总酸和氨基酸态氮的含量均符合黄酒国标的标准(图3)。至发酵结束，除L.plantarum组外，其他各组酒精度、酸度和氨基酸态氮含量均达到黄酒国家标准(表1)。L.plantarum组可滴定酸含量迅速增加到17.50g/L，样品出现明显的酸败。说明糖多孢菌对黄酒发酵过程中重要理化指标影响不大，发酵正常。

黄酒发酵样品中氨基酸含量：采用HPLC方法对发酵黄酒中的氨基酸含量进行了分析，添加S.hirsuteJ2实验组中的氨基酸含量达到6434.81±123.3mg/L，相比于对照组提高了40.37％。Mix，A.flavus和A.oryzae实验组的氨基酸含量相差不大，但是均显著高于对照组(TF Control)；而添加S.jiangxiensisJ3实验组的总氨基酸含量则与对照组相差不大，部分氨基酸含量显著超出对照组。

表1黄酒发酵样品中的氨基酸含量分析

注：gaga为γ-氨基丁酸。

糖多孢菌降生物胺效果分析：所得产品用高效液相法检测黄酒中生物胺含量，添加披发糖多孢菌J2的样品组相比较对照组降低了21.71％；添加江西糖多孢菌J3的样品组相比较对照组降低了35.09％。添加披发糖多孢菌J2组和江西糖多孢菌J3的复合菌剂(Mix组)相比对照组降低了42.17％。

纯种发酵与传统发酵风味分析：采用主成分分析法对纯种和传统发酵样品中风味成分的变化和相似性进行了分析。所有样本的biplot分析表明，披发糖多孢菌J2和江西糖多孢菌J3发酵的黄酒中前两个主成分的方差累积贡献率均为83.6％，这可以解释大多数发酵样本的风味差异。从图4可以看出，传统发酵组与S.hirsuteJ2组聚在一起，与曲霉(A.flavus和A.oryzae)组和L.plantarum组明显分离。这说明糖多孢菌参与了大多数风味物质的合成，并在黄酒发酵中起主导作用。

实施例7：糖多孢菌菌剂在黄酒发酵中的应用

以实施例4中的传统黄酒落料配方进行黄酒发酵，实验组分别设置Mix组和江西糖多孢菌J3组，区别在于，麦曲接种比例均为10％；江西糖多孢菌J3组接种江西糖多孢菌J3组纯种麦曲；Mix组接种应用江西糖多孢菌J3和披发糖多孢菌J2混合菌液按照实施例3的方法制备的复合菌种麦曲。黄酒酿造工艺和指标测定方法参照实施例4进行。

(1)对黄酒基本理化指标的影响

根据表2可以看出发酵结束后各组酒精度达到14％v/v左右，所有样品的还原糖、总酸和氨基酸态氮含量均在4.52-5.03g/L，均符合黄酒的理化要求。显著性分析表明Mix组与江西糖多孢菌J3组的酒精度、总酸含量和氨基酸态氮含量与对照组差异均不明显(P＞0.05)，说明接种糖多孢菌披发糖多孢菌J2和江西糖多孢菌J3对黄酒发酵过程中重要理化指标影响不大，不会对黄酒发酵过程带来不利影响。

表2发酵结束时黄酒理化指标

(2)糖多孢菌对黄酒生物胺含量的影响

发酵结束后，接种复合菌剂Mix组、江西糖多孢菌J3组的样品生物胺含量分别为15.57±0.44mg/L和16.88±1.41mg/L，均低于对照组的26.75±2.39mg/L。披发糖多孢菌J2总胺含量的平均值与对照组相比降低了41.79％；江西糖多孢菌J3组与对照组相比降低了36.90％。说明复合菌剂Mix、江西糖多孢菌J3均有降低生物胺含量的作用。

综上所述，在黄酒发酵体系中接种复合菌剂Mix、江西糖多孢菌J3均不影响黄酒的正常品质，且对总胺的降解率分别达到了对照组的41.79％和36.90％。说明直接添加复合菌剂Mix、江西糖多孢菌J3均有应用于黄酒生产、调控黄酒中生物胺含量的潜力，复合菌剂Mix对黄酒中生物胺的降解效果更佳。

实施例8：披发糖多孢菌J2应用于发酵香肠中降低生物胺含量

(1)菌种的活化培养

放线菌液体培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃下测定)。

将保藏的糖多孢菌S.hirsuteJ2接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，30℃摇床培养59h，得一级种子液。将活化的菌株接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，摇床培养48h，转速150r/min，温度30℃，待培养至菌浓数量级为10⁵～10⁷cfu/mL后用于发酵香肠。

(2)发酵香肠的制备

按质量计，取瘦肉65～80％、肥肉20～35％。清洗，去除骨、筋腱、肌膜、淋巴、血管、病变及损伤部位。肥瘦分开，切成4～5cm肉块。将瘦肉和5～8％左右冰屑放入斩拌机内，斩拌1～3min。以猪肉质量为基数，添加亚硝酸钠0.01～0.15％、食盐2～3％、复合磷酸盐0.2～0.3％、抗坏血酸钠0.05～0.06％。香辛料、胡椒、大蒜、辣椒、肉蔻为原料肉的0.2％～0.3％。其中两组分别接种8～12％活化的糖多胞菌，一组不接种作为对照，斩拌1～2min，再加入肥肉和5～8％左右冰屑，斩拌4～6min。腌制后灌入肠衣中。香肠的发酵工艺参数如表3所示。

表3香肠发酵工艺参数

(3)披发糖多孢菌J2降生物胺效果分析

以实施例1中的方法进行菌种活化和生物胺含量的测定。

样品前处理方法：称取绞碎后样品5.0g于50mL离心管中，加入20mL 5％的三氯乙酸并超声30min，转移至50mL具塞离心管中，6 000r/min离心10min，转移上清液至50mL容量瓶中，残渣用20mL上述溶液再提取1次，合并上清液并稀释至刻度。

由表4可知，添加披发糖多孢菌J2发酵后的香肠在发酵成熟后pH分别为6.16±0.16，而对照组则为6.51±0.17，水分含量和粗蛋白含量差异均不明显；添加S.hirsute J2发酵的香肠成熟后生物胺平均含量为129.60mg/kg，比对照组降低了36.19％。

表4发酵成熟香肠指标

实施例9：糖多孢菌J2应用于白酒中降低生物胺含量

白酒酿造使用的糖多孢菌纯种麦曲参照按照实施案例3中麦曲制作方法。以实施案例1中的方法进行生物胺含量的测定。

白酒酿造方法采用两轮发酵法，第一轮发酵时高粱蒸熟后，风冷降温至25℃，添加4％米曲霉种子液，在28℃温度下培养24h。添加稻壳10％、大曲15％、麸皮8％、纯种麦曲5～9％、按1％的比例接入酿酒酵母种子液，然后密封，发酵30天后进行蒸酒。二轮发酵时添加中温大曲10％、按1％的比例接入酿酒酵母种子液，酵母菌种子液浓度为10¹⁰～10¹²cfu/mL，继续发酵12～15天后进行蒸酒。

对糖多孢菌S.hirsuteJ2降生物胺效果分析：将蒸馏后的白酒勾兑成酒精度60％(V/V)，检测勾兑后样品中生物胺含量，添加S.hirsuteJ2的样品组相比较对照组降低了24.32％。

实施例10：披发糖多孢菌J2应用于酱油中降低生物胺含量

以实施案例1中的方法进行菌种活化和生物胺含量的测定。酱油采用高盐稀态法进行酿造：

(1)首先将豆粕和小麦按1:1比例混匀，然后蒸熟；

(2)按照5‰～10％的比例加入菌液浓度为10⁵～10⁶cfu/mL的披发糖多孢菌J2种子液，然后加入约1.5～2倍物料质量的盐水，酱醪最终含盐量约为18％、含水量为65％，然后混匀。

(3)酱醅发酵：起始发酵温度控制在14～16℃，随着发酵进行温度逐渐升高到约35℃。持续发酵约5个月。

(4)发酵结束后的将酱醪进行板框压榨，去除酱醅。压榨结束后进行硅藻土过滤和膜过滤，去除沉淀。过滤澄清的酱油经过巴氏灭菌后进行灌装。

披发糖多孢菌J2降生物胺效果分析，添加披发糖多孢菌J2的酱油产品中的生物胺含量相较于对照组降低了34.28％。

实施例11：披发糖多孢菌J2用于料酒中降低生物胺含量

按照实施例3中酿造方法获得纯种发酵黄酒，向发酵黄酒中加入按质量计10％食盐，过灭菌机85℃灭菌30min热灌装。

对菌株降低料酒中生物胺含量的效果进行分析：用高效液相法检测料酒中生物胺含量，添加披发糖多孢菌J2的样品组与对照组相比，生物胺含量降低。

实施例12：披发糖多孢菌J2用于食醋中降低生物胺含量

按照实施例3中酿造方法获得纯种发酵黄酒，作为醋酸发酵原料；以实施例1中的方法进行生物胺含量的测定。

醋酸发酵采用固态发酵工艺：将大糠、麸皮、黄酒按照1:4:10的质量比拌匀，接入5％的醋醅，接种后前2天内每天从物料表面翻醅，保持温度为35-42℃。到6-8天时翻到物料底部。第8-12天，每天从底部翻醅，温度自然下降。从醋醅中分离后得生醋，在经过85℃灭菌30min后陈酿12个月。在灌装前经过高温灭菌后热灌装。

对制备获得的食醋品质进行测定，所得固态发酵酿造食醋中醋酸含量均为55g/L。对食醋中生物胺含量进行分析：用高效液相法检测料酒中生物胺含量，添加披发糖多孢菌J2的样品组与对照组相比，生物胺含量降低。

实施例13：复合糖多孢菌剂用于降低发酵鱼中的生物胺含量

以实施例1中的方法进行菌种活化。

利用中性蛋白酶发酵臭鳜鱼，具体工艺为：

(1)样品预处理：鳜鱼去内脏，称重3kg；

(2)发酵液制备：取鳜鱼等质量饮用水，以此为100％计，加入6％盐、1％大葱、0.6％姜、0.1％八角、0.05％茴香、0.05％孜然、0.01％辣椒、0.01％花椒、300000U中性蛋白酶，混匀，得发酵液；

(3)接种：发酵液分成两份，一份以10％接种量向发酵液中接种活化的江西糖多孢菌J3菌种，菌液浓度为10⁷cfu/mL，另一份不接种；

(4)发酵：将鳜鱼浸于步骤(3)接种后的发酵液中，最上层用石头压实，20℃下发酵6天，得臭鳜鱼。

生物胺的测定方法：称取绞碎后鱼肉样品5.0g于50mL离心管中，加入20mL 5％的三氯乙酸并超声30min，转移至50mL具塞离心管中，6 000r/min离心10min，转移上清液至50mL容量瓶中，残渣用20mL上述溶液再提取1次，合并上清液并稀释至刻度。然后准确量取1mL上清液于15mL离心管中，加入1mL饱和NaHCO₃溶液，混匀，加入2mL丹磺酰氯(5mg/mL丙酮)试剂，混匀后置于65℃恒温水浴锅中黑暗衍生30min，室温静置后，加入0.5mL饱和NaCl溶液，混匀后加入5mL乙醚，涡旋振荡20s，静置分层后，转移上层有机相于15mL离心管中，下层水相再萃取一次，合并两次萃取液，50℃水浴下氮气吹干。

加入1mL乙腈振荡混匀，溶解残留物，过0.22μm滤膜，通过高效液相色谱法(HPLC)测定。

发酵结束后，采取复合菌剂Mix强化的臭鳜鱼生物胺比对照组下降了20.87％。

实施例14：江西糖多孢菌J3用于料酒中降低生物胺含量

以实施例1中的方法进行生物胺含量的测定。

按照实施例3中酿造方法获得纯种发酵黄酒，向发酵黄酒中加入按质量计10％食盐，过灭菌机85℃灭菌30min热灌装。

对菌株在料酒中降生物胺的效果进行分析：用高效液相法检测料酒中生物胺含量，添加复合菌剂Mix和江西糖多孢菌J3的样品组与对照组相比，分别降低了23.16％和18.91％。

实施例15：江西糖多孢菌J3用于食醋中降低生物胺含量

按照实施例3中酿造方法获得纯种发酵黄酒，作为醋酸发酵原料；以实施例1中的方法进行生物胺含量的测定。

醋酸发酵采用固态发酵工艺：将大糠、麸皮、黄酒按照1:4:10的质量比拌匀，接入5％的醋醅，接种后前2天内每天从物料表面翻醅，保持温度为35-42℃。到6-8天时翻到物料底部。第8-12天，每天从底部翻醅，温度自然下降。从醋醅中分离后得生醋，在经过85℃灭菌30min后陈酿12个月。在灌装前经过高温灭菌后热灌装。

复合菌剂Mix和江西糖多孢菌J3降生物胺效果分析：所得固态发酵酿造食醋中醋酸含量均为55g/L。检测样品中生物胺含量，添加复合菌剂Mix和江西糖多孢菌J3的样品组与对照组相比，分别降低了25.08％和27.61％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 糖多孢菌组合物及其在食品中的应用

<130> BAA200603A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1387

<212> DNA

<213> Saccharopolyspora hirsute

<400> 1

gaccactccc cccacaaggg ttgggccatg ggcttcgggt gttaccgact ttcatgacgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agcaatgctg atctgcgatt 120

actagcgact ccgacttcac ggggtcgagt tgcagacccc gatccgaact gagaccggct 180

ttaagggatt cgctcaacct cacgatctcg cagccctctg taccggccat tgtagcatgt 240

gtgaagccct gggcataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccacctt cctccgagtt 300

gaccccggca gtcccccacg agtccccggc attacccgct ggcaacatag ggcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcacc 420

acctgtacac caaccacaag ggaaaccccc tctcaggggc tgtctagtgc atgtcaaacc 480

caggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aatccacatg ctccgccgct tgtgcgggcc 540

cccgtcaatt cctttgagtt ttagccttgc ggccgtactc cccaggcggg gcgcttaatg 600

cgttagctac ggcacggaaa cagtggaacc catccccaca cctagcgccc aacgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca 720

gtatcggccc agagacccgc cttcgccacc ggtgttcctc ctgatatctg cgcatttcac 780

cgctacacca ggaattccag tctcccctac cgaactcaag tctgcccgta tccaccgcaa 840

gccaggagtt aagctcccgg ttttcacgat agacgcgaca aaccgcctac gagctcttta 900

cgcccaataa atccggacaa cgctcgcacc ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960

ttagccggtg cttcttctac acctaccgtc acccgaaggc ttcgtcgatg tcgaaagagg 1020

tttacaaccc gaaggccgtc atcccccacg cggcgttgct gcgtcaggct ttcgcccatt 1080

gcgcaagatt ccccactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1140

ggccggtcac cctctcaggc cggctacccg tcgtcgcctt ggtaggccac taccccacca 1200

acaagctgat aggccgcggg ctcatcctgc accgccagaa ctttccacac cagaacatgc 1260

ctccaggtgt cgtatccggt attagacctc gtttccaagg cttatcccga agtgcagggc 1320

agattaccca cgtgttactc acccgttcgc cactcatcca cacccgaaag tgcttcagcg 1380

ttcgact 1387

<210> 2

<211> 1370

<212> DNA

<213> Saccharopolyspora jiangxiensis

<400> 2

gggttgggcc atgggcttcg ggtgttaccg actttcatga cgtgacgggc ggtgtgtaca 60

aggcccggga acgtattcac cgcagcaatg ctgatctgcg attactagcg actccgactt 120

cacggggtcg agttgcagac cccgatccga actgagaccg gctttaaggg attcgctcaa 180

cctcacgatc tcgcagccct ctgtaccggc cattgtagca tgtgtgaagc cctgggcata 240

aggggcatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccga gttgaccccg gcagtccccc 300

acgagtcccc ggcatcaccc gctggcaaca tagggcaagg gttgcgctcg ttgcgggact 360

taacccaaca tctcacgacc acgaagctga cgacagccat gcacctacct gtacaccaac 420

cacaaaggga aaccccctct caggggctgt ctagtgcatg tcaaaccmag gtaaggttyt 480

tcgcgttgca tsgaattaat ccacatgctc cgccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct 540

ttgagtttta gccttgcggc cgtactcccc aggcggggcg cttaatgcgt ttagctacgg 600

cacggaaaca gtggaaccca tccccacacc tagcgcccaa cgtttacggc gtggactacc 660

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attacccacg tgttactcac ccgttcgcca ctcatccaca cccgaaagtg 1370

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种糖多孢菌组合物，其特征在于，含有披发糖多孢菌(Saccharopolysporahirsute)J2和江西糖多孢菌(Saccharopolysporajiangxiensis)J3；

所述披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute)J2，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020103；

所述江西糖多孢菌(Saccharopolysporajiangxiensis)J3，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020104。

2.含有权利要求1所述糖多孢菌组合物的微生物制剂。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述披发糖多孢菌J2和江西糖多孢菌J3的菌体数量之比为1：(0.8～1.2)。

4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，每克或每毫升发酵剂中的糖多孢菌数量≥1×10⁶CFU。

5.根据权利要求2～4任一所述的微生物制剂，其特征在于，含有所述披发糖多孢菌J2的活细胞、冷冻干燥得到的干菌体、固定化的细胞，或者以其他任何形式存在的微生物细胞。

6.应用权利要求1所述糖多孢菌组合物制备的麦曲、麸曲、酒药或其他类型的曲。

7.根据权利要求6所述的麦曲、麸曲、酒药或其他类型的曲，其特征在于，是将制曲的原料破碎、加水搅拌、灭菌后，在无菌环境下接入权利要求1所述的糖多孢菌组合物，于25～55℃培养72～96h。

8.权利要求1所述的糖多孢菌组合物，或权利要求2～5任一所述的微生物制剂，或权利要求6～7任一所述的曲在生产发酵食品、调味品或饮品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食品包括发酵或半发酵食品；饮品包括黄酒或白酒；所述调味品包括食醋、酱油、调味料或香肠。

10.权利要求1所述的糖多孢菌组合物，或权利要求2～5任一所述的微生物制剂，或权利要求6～7任一所述的曲在降低发酵食品或饮品中生物胺含量方面的应用。

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