CN102604879A - 生产红霉素的工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生产红霉素的工程菌及其应用。本发明保护将重组质粒导入红色糖多孢菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ermE*启动子、eryBII蛋白的编码基因和eryF蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒中由ermE*启动子启动所述eryBII蛋白的编码基因和所述eryF蛋白的编码基因的表达；所述红色糖多孢菌的ATCC编号为11635。本发明的提供的工程菌可直接发酵得到红霉素，发酵液中的红霉素效价可达8000U/ml，生产成本低，是一种具有生产应用价值的生产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及生产红霉素的工程菌及其应用。
背景技术
红霉素是一类大环内酯类抗生素，广泛应用于抑制革兰氏阳性菌的感染。自1952年发现以来，红霉素及其衍生物在临床上得到了广泛的应用。目前红霉素类抗生素年销售额超过35亿美元，位居抗生素销售额第三位，被认为是下一代治疗耐药性细菌的抗生素，随第二代红霉素(如阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等)、第三代红霉素(如泰利霉素)在日本和欧洲上市，国内外市场对红霉素的需求大大增加。
目前我国是世界最大的红霉素原料生产国，但是主要还是依靠发酵生产，普遍存在红霉素效价低的问题。国内提高红霉素发酵效价主要是通过传统的育种工作，如使用有效的化学或放射线随机诱导菌种突变以提高菌株的抗生素产量，或者使用天然杂交或原牛质体融合技术从突变筛选系的分支处组合预期基因以得到高产量的菌株。传统的育种方法存在一些局限性，如目标性差，筛选工作繁重，周期长等。
发明内容
本发明的目的是提供生产红霉素的工程菌及其应用。
本发明保护将重组质粒导入红色糖多孢菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ermE*启动子、eryBII蛋白的编码基因和eryF蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒中由ermE*启动子启动所述eryBII蛋白的编码基因和所述eryF蛋白的编码基因的表达；所述红色糖多孢菌的ATCC编号为11635；所述ermE*启动子如序列表的序列1所示；所述eryBII蛋白如序列表的序列2所示；所述eryF蛋白如序列表的序列4所示。
所述eryBII蛋白的编码基因可如序列表的序列3所示；所述eryF蛋白的编码基因可如序列表的序列5所示。
所述重组质粒中，自上游至下游可依次包括所述ermE*启动子、所述eryBII蛋白的编码基因和所述eryF蛋白的编码基因。
所述出发载体具体可为载体pSET152。
所述重组质粒具体可为将所述ermE*启动子插入所述载体pSET152的XbaI酶切位点、所述eryBII蛋白的编码基因插入所述载体pSET152的BamHI和EcoRI酶切位点之间、所述eryF蛋白的编码基因插入所述载体pSET152的EcoRI酶切位点得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSE0015。红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSE0015简称红色糖多孢菌MFSE0015，已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2012052。
以上任一所述重组菌均可用于生产红霉素。
本发明还保护一种生产红霉素的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到红霉素。
所述发酵的条件可为33.5℃、振荡培养6天。所述发酵采用的发酵培养基具体如下：由溶质和水组成；每50ml发酵培养基含如下溶质：35g玉米淀粉、30g黄豆饼粉、30g糊精、0.6ml正丙醇、2g硫酸铵、12ml豆油和6g碳酸钙。所述发酵培养基的pH具体可为7。
所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液是将所述重组菌接种至种子培养基进行培养得到的。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比具体可为1∶10。所述培养的条件可为33.5℃、振荡培养2天。所述种子培养基由溶质和水组成；每50ml种子培养基含如下溶质：50g玉米淀粉、15g黄豆饼粉、12ml玉米浆、1.5g氯化钠、1.5g硫酸铵、7ml豆油和6g碳酸钙。所述种子培养基的pH具体可为7。
以上任一所述重组菌均可用于生产微生物抑制剂。所述微生物可为短小芽孢杆菌，具体可为CMCC编号为63202的短小芽孢杆菌。
本发明还保护一种生产微生物抑制剂的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到微生物抑制剂。
所述发酵的条件可为33.5℃、振荡培养6天。所述发酵采用的发酵培养基具体如下：由溶质和水组成；每50ml发酵培养基含如下溶质：35g玉米淀粉、30g黄豆饼粉、30g糊精、0.6ml正丙醇、2g硫酸铵、12ml豆油和6g碳酸钙。所述发酵培养基的pH具体可为7。
所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液是将所述重组菌接种至种子培养基进行培养得到的。每100毫升所述种子液中含有10-15g湿重的菌体。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比具体可为1∶10。所述培养的条件可为33.5℃、振荡培养2天。所述种子培养基由溶质和水组成；每50ml种子培养基含如下溶质：50g玉米淀粉、15g黄豆饼粉、12ml玉米浆、1.5g氯化钠、1.5g硫酸铵、7ml豆油和6g碳酸钙。所述种子培养基的pH具体可为7。
所述微生物可为短小芽孢杆菌，具体可为CMCC编号为63202的短小芽孢杆菌。
本发明运用代谢工程的手段对红霉素产生菌进行分子改造，在强启动子ErmE*作用下增加红霉素代谢途径中关键酶eryBII基因及eryF基因的拷贝数，从而提高红霉素效价。本发明提供的工程菌可直接发酵得到红霉素，发酵液中的红霉素效价可达8000U/ml，生产成本低，是一种具有生产应用价值的生产菌株。
附图说明
图1为载体pSET152的结构示意图。
图2为重组质粒pSET152一ermE*的结构示意图。
图3为重组质粒pSET152一ermE*-eryBII的结构示意图。
图4为重组质粒pSET152-ermE*-eryBII-eryF的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)，又称糖多孢红霉菌，获自美国模式培养物集存库(http://www.atcc.org/，简称ATCC)，编号为11635，简称红色糖多孢菌11635，是一类放线菌类微生物。
短小芽孢杆菌：购自国家微生物菌种资源库(简称CMCC，网址为：http://matrs.com/)，编号为63202，简称短小芽孢杆菌63202。
红霉素(标准品)：购自国家标准物质信息库，C13203490-红霉素标准品。
实施例1、重组质粒pSET152-ermE*-eryBII-eryF的构建
一、重组质粒pSET152-ermE*的构建
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子(序列1中，自5’末端第10至225位核苷酸为红酶素启动子ermE*，第4至9位核苷酸为XbaI酶切识别序列，第226至231位核苷酸为XbaI酶切识别序列)。
2、用限制性内切酶XbaI酶切步骤1合成的双链DNA分子，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶XbaI酶切载体pSET152(长沙赢润生物技术有限公司，结构示意图见图1，大肠杆菌和链霉菌的穿梭质粒)，回收载体骨架(约5700bp)。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pSET152-ermE*。重组质粒pSET152-ermE*的结构示意图见图2。根据测序结果，对重组质粒pSET152-ermE*进行结构描述如下：在载体pSET152的XbaI酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第10至225位核苷酸所示的DNA分子。
二、重组质粒pSET152-ermE*-eryBII的构建
1、以红色糖多孢菌11635的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-CGGGATCCATGACCACCGACGCCGCGACG-3’(下划线标注BamHI酶切识别序列)；
R1：5’-CGGAATTCTCACTGCAACCAGGCTTCCGG-3’(下划线标注为EcoRI酶切识别序列)。
F1和R1的靶序列如序列表的序列3所示(序列表的序列3所示基因即为eryBII基因，编码序列表的序列2所示的eryBII蛋白)。
PCR扩增条件：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟、56℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，30个循环；72℃保温10分钟。
2、回收PCR扩增产物(约1000bp)并用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pSET152-ermE*，回收载体骨架(约5900bp)。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒
pSET152-ermE*-eryBII。根据测序结果，对重组质粒pSET152-ermE*-eryBII进行结构描述如下：在重组质粒pSET152-ermE*的BamHI和EcoRI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的DNA分子。重组质粒pSET152-ermE*-eryBII的结构示意图见图3。
三、重组质粒pSET152-ermE*-eryBII-eryF的构建
1、以红色糖多孢菌11635的基因组DNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-CGGAATTCATGACGACCGTTCCCGATCTC-3’(下划线标注EcoRI酶切识别序列)；
R2：5’-CGGAATTCTCATCCGTCGAGCCGCACCGG-3’(下划线标注EcoRI酶切识别序列)。
F2和R2的靶序列如序列表的序列5所示(序列表的序列5所示基因即为eryF基因，编码序列表的序列4所示的eryF蛋白)。
PCR扩增条件：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟、56℃退火1分钟、72℃延伸1分钟10秒，30个循环；72℃保温10分钟。
2、回收PCR扩增产物(约1200bp)并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶EcoRI酶切重组质粒pSET152-ermE*-eryBII，回收载体骨架(约6900bp)。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒
pSET152-ermE*-eryBII-eryF。根据测序结果，对重组质粒pSET152-ermE*-eryBII-eryF进行结构描述如下：在重组质粒pSET152-ermE*-eryBII的EcoRI酶切位点插入了序列表的序列5所示的DNA分子。重组质粒pSET152-ermE*-eryBII-eryF的结构示意图见图4。
实施例2、工程菌的构建
将重组质粒pSET152-ermE*-eryBII-eryF电击转化红色糖多孢菌11635原生质体，然后用F1和R2组成的引物对进行PCR鉴定(显示约2200bp的特异条带的为PCR鉴定阳性)得到重组菌。
将一株重组菌命名为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSE0015。红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSE0015简称红色糖多孢菌MFSE0015，已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2012052。
实施例3、应用红色糖多孢菌MFSE0015生产红霉素
一、应用红色糖多孢菌MFSE0015生产红霉素
1、将红色糖多孢菌MFSE0015接种于斜面培养基，33.5℃培养7天(产生大量孢子)。
斜面培养基由溶质和水组成；溶质及其在斜面培养基中的浓度如下：玉米淀粉1g/100ml、玉米浆1.2g/100ml、硫酸铵0.3g/100ml、氯化钠0.3g/100ml、碳酸钙0.25g/100ml和琼脂粉2.0g/100ml。
2、从步骤1的斜面培养基取1cm2大小的方块接种至50ml种子培养基(在500毫升三角瓶中)，33.5℃、240rpm振荡培养2天，得到种子液(每100毫升种子液中含有10-15g湿重的菌体)。
种子培养基(pH7)由溶质和水组成；每50ml种子培养基含如下溶质：50g玉米淀粉、15g黄豆饼粉、12ml玉米浆、1.5g氯化钠、1.5g硫酸铵、7ml豆油和6g碳酸钙。
3、取5ml的种子液转接至50ml发酵培养基(在500毫升三角瓶中)，33.5℃、240rpm振荡培养6天。
发酵培养基(pH7)由溶质和水组成；每50ml发酵培养基含如下溶质：35g玉米淀粉、30g黄豆饼粉、30g糊精、0.6ml正丙醇、2g硫酸铵、12ml豆油和6g碳酸钙。
4、将步骤3的发酵体系离心(4500rpm、15min)，收集上清液(发酵液)。
二、对照液的制备
将红色糖多孢菌11635代替红色糖多孢菌MFSE0015进行步骤一的实验，收集上清液(对照液)。
三、测定发酵液的红霉素的效价(磷酸法，为红霉素效价测定的通用方法)
1、标准曲线绘制
(1)将红霉素(标准品)先用少量乙酸溶解，然后用蒸馏水配成1000U/ml的母液。
(2)将母液用蒸馏水依次稀释为如下浓度的标准品溶液：100U/ml、150U/ml、200U/ml、300U/ml、400U/ml。
(3)吸取2.0ml标准品溶液于25ml容量瓶中，加入10ml 10M磷酸水溶液，在沸水浴中煮沸3分钟，然后冷却至室温，再用10M磷酸水溶液定容至25ml，摇匀，采用用721分光光度计在485nm处测定吸光度(采用1cm比色皿；用蒸馏水作为空白对照)。
(4)以效价为纵坐标(单位为U)，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
标准曲线方程：Y＝801.96X+37.615。
2、测定发酵液的红霉素的效价
将步骤一得到的发酵液(或步骤二得到的对照液)用蒸馏水稀释至10倍体积，然后吸取2.0ml于25ml容量瓶中，加入10ml 10M磷酸水溶液，在沸水浴中煮沸3分钟，然后冷却至室温，再用10M磷酸水溶液定容至25ml，摇匀，采用用721分光光度计在485nm处测定吸光度(采用1cm比色皿；用蒸馏水作为空白对照)。
将吸光度值代入标准曲线，再乘以稀释倍数，得到发酵液的红霉素效价。
发酵液的红霉素效价为8000U/ml，而对照液的红霉素效价为3680U/ml。
四、红霉素发酵液的抑菌作用
利用管碟法进行发酵液和对照液的抑菌实验。
取直径约90mm、高16mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基(蛋白胨5g/L、牛肉浸出粉3g/L、磷酸氢二钾3g/L、琼脂20g/L，其余为水)20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上凝固，作为底层；另取5ml培养基加热融化后，冷却至45℃，加入3mL浓度为1×106cfu/mL的短小芽孢杆菌63202菌悬液，摇匀，倒入双碟中，作为上层含菌层。放置水平台上冷却后，在碟中以等距离安置牛津杯(直径为6.0mm)四个，备用。将发酵液(或对照液)用无菌PBS缓冲液稀释至10倍体积后，加入牛津杯中(每个牛津杯加入100μL)，37℃培养15小时后，测量抑菌圈大小。
PBS缓冲液(pH7.8)：取5.59g磷酸氢二钾和0.41g磷酸二氢钾，用水溶解并定容至1000mL，过滤；115℃灭菌30min。。
发酵上清液抑菌圈的大小约2.23cm，对照液抑菌圈的大小约为1.03cm。
Claims (10)
1.将重组质粒导入红色糖多孢菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ermE*启动子、eryBII蛋白的编码基因和eryF蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒中由ermE*启动子启动所述eryBII蛋白的编码基因和所述eryF蛋白的编码基因的表达；所述红色糖多孢菌的ATCC编号为11635；所述ermE*启动子如序列表的序列1所示；所述eryBII蛋白如序列表的序列2所示；所述eryF蛋白如序列表的序列4所示。
2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述eryBII蛋白的编码基因如序列表的序列3所示；所述eryF蛋白的编码基因如序列表的序列5所示。
3.如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述重组质粒中，自上游至下游依次包括所述ermE*启动子、所述eryBII蛋白的编码基因和所述eryF蛋白的编码基因。
4.如权利要求1或2或3所述的重组菌，其特征在于：所述出发载体为载体pSET152。
5.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组质粒为将所述ermE*启动子插入所述载体pSET152的XbaI酶切位点、所述eryBII蛋白的编码基因插入所述载体pSET152的BamHI和EcoRI酶切位点之间、所述eryF蛋白的编码基因插入所述载体pSET152的EcoRI酶切位点得到的重组质粒。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSE0015，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2012052。
7.权利要求1至6中任一所述的重组菌在生产红霉素中的应用。
8.一种生产红霉素的方法，包括如下步骤：将权利要求1至6中任一所述的重组菌进行发酵，得到红霉素。
9.权利要求1至6中任一所述的重组菌在生产微生物抑制剂中的应用。
10.一种生产微生物抑制剂的方法，包括如下步骤：将权利要求1至6中任一所述的重组菌进行发酵，得到微生物抑制剂。
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