CN105039189B - 一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建与应用 - Google Patents
一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105039189B CN105039189B CN201510350298.3A CN201510350298A CN105039189B CN 105039189 B CN105039189 B CN 105039189B CN 201510350298 A CN201510350298 A CN 201510350298A CN 105039189 B CN105039189 B CN 105039189B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lysozyme
- chicken
- production
- genetic engineering
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 title claims abstract description 57
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 title claims abstract description 45
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 38
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 23
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 208000024753 bloody sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 1
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建方法与应用，公开了一株产鸡溶菌酶的基因工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCC No.10780。本发明采用重组DNA技术将鸡(Gallus gallus)的溶菌酶(lysozyme)cDNA克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，并转化毕赤酵母X‑33，经筛选鉴定得到一株产高活性鸡溶菌酶的重组毕赤酵母x‑33pPICZαA‑α‑lysozyme。该菌株表达的鸡溶菌酶在摇瓶中的酶活为5000‑7000u/ml，为鸡溶菌酶的大规模生产奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种产鸡溶菌酶的基因工程菌，属于基因工程技术领域。
背景技术
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。
溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等，溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产鸡溶菌酶的基因工程菌NCY-02，用于鸡溶菌酶的生产。本发明的基因工程菌已于2015年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10780，分类学命名为毕赤酵母(Pichia pastoris)x-33-pPICZαA–lysozyme。
本发明的技术方案如下：一株产鸡溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCC No.10780。
本发明第二方面公开了前述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)合成SEQ ID NO：1所示的鸡溶菌酶表达序列；
2)将步骤1)所述鸡溶菌酶表达序列连接到毕赤酵母载体pPICZα上，得到重组质粒pPICZαA-lysozyme；
3)将步骤2)的重组质粒pPICZαA-lysozyme转化毕赤酵母x-33，得到产鸡溶菌酶的基因工程菌毕赤酵母x-33-pPICZαA–lysozyme。
进一步，步骤2)中，将鸡溶菌酶表达序列采用限制性内切酶xho I和Not I进行双酶切，连接到同样用xho I和Not I双酶切回收后的毕赤酵母载体pPICZα上，获得重组质粒pPICZαA-lysozyme。
本发明第三方面公开了前述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌在鸡溶菌酶生产中的应用。
进一步，产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的种子培养基采用YPD培养基；基本发酵培养基采用BMGY培养基；诱导培养基为BMMY培养基。
本发明的有益效果是：本发明的产鸡溶菌酶酵母基因工程菌表达的鸡溶菌酶在摇瓶培养后的酶活可以达到5000-7000u/ml左右，10L机械搅拌生物反应器水平上发酵酶活可以达到20000u/ml以上。该构建菌株发酵生产鸡溶菌酶取代目前从蛋清中提取的生产方法，具有生产周期短、分离纯化成本低等一系列优点，而且发酵生产过程中产生的废弃物——酵母细胞有着广泛的应用价值，这为该菌株大规模生产鸡溶菌酶奠定了良好的基础。
附图说明
图1：pPICZαA质粒图谱；
图2：重组质粒的酶切图谱(其中，M为DL5000 DNA marker，编号1是线性化质粒pPICZα，编号2-7为双酶切的重组质粒pPICZαA-lysozyme)；
图3：质粒酶切结果(其中，M为DL5000 DNA marker,编号1是线性化质粒pPICZα，编号2-5为Bglll线性化重组质粒pPICZα-lysozyme)；
图4：重组毕赤酵母诱导表达后考马斯亮蓝染色电泳图(其中，M1和M2为蛋白标准品，编号1-8为诱导表达后的重组蛋白)。
具体实施方式
以下结合附图1-4对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1重组菌的构建及鉴定
通过NCBI收录的鸡溶菌酶基因GenBank:J00882.1，设计出鸡溶菌酶表达序列(两端插入了xhoI和xbaI酶切位点)，如SEQ ID NO：1所示，并交由上海生工生物工程股份有限公司合成，连接于puc57载体，获得puc57-lysozyme。
用限制性内切酶xho I和Not I分别双酶切puc57-lysozyme和酵母载体pPICZα，并回收。用T4DNA连接酶于4℃过夜连接，连接产物转化进入感受态大肠杆菌，37℃摇菌1小时，涂布在含有博来霉素(zeocin，0.25ug/ul)的LB平板上，37℃过夜培养，挑选菌落并提质粒，最终获得含有鸡溶菌酶基因的重组表达质粒pPICZαA-lysozyme，用双酶切进行验证，验证结果如图2所示。
将验证正确的重组质粒pPICZαA-lysozyme电击转化毕赤酵母x-33(Pichiapastoris x-33)感受态细胞，得到基因工程菌，并经过鉴定命名为毕赤酵母(Pichiapastoris)x-33-pPICZαA-lysozyme。
毕赤酵母的转化采用电转化法为：将毕赤酵母x-33于50mL YPD中培养至OD 600＝1.2，1500g离心收集细胞；依次用50mL,25ml冰冷的无菌水洗两次细胞，再用10mL冰冷的1mol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于100ul 1mol/L山梨醇液中，获得感受态细胞。取80μL酵母感受态细胞，与5-10μg线性化重组质粒DNA(BglII酶切)混合，转入冰冷的电转杯，放置5分钟；电击感受态细胞与线性化DNA的混合物(2kv，15ms)；加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，吸入15ml离心管中，在30℃静止放置1h；然后涂布于固体YPDS培养基，在30℃培养4～6天后挑取单克隆，获得产鸡溶菌酶的基因工程菌株，用BglII酶切进行验证，验证结果如图3所示。
实施例2重组菌的诱导表达和蛋白电泳
1.培养基的配制
YPD培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；
YPDS固体培养基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g,182.2g山梨醇，20g琼脂粉；
BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)，40mg生物素；
BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇5mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)，40mg生物素。
2.鸡溶菌酶诱导表达方法
以实施例1获得的产鸡溶菌酶酵母基因工程菌为生产菌株，活化后，将30℃，220rpm下培养过夜的种子(YPD培养基)以10％的接种量转入基本发酵培养基(BMGY培养基)，于30℃、220rpm条件下培养至OD值为1.2～1.5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中诱导蛋白的产生。
通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小在10kDa和15kDa之间的蛋白条带，如图4所示(蛋白标准品商品名Page Ruler Prest，厂商Them Scientific，范围10-110KD)，能看到在15kD之下有一条染色最深的条带,为目的条带。
3.酶活
参考GB/T25879-2010方法检测发酵液中的酶活力，检测结果显示，本实施例摇瓶培养获得的鸡溶菌酶酶活可以达到5000-7000u/ml。
实施例3重组蛋白的发酵培养
以实施例1获得的溶菌酶产生菌CNY-02为生产菌株，接种于YPD培养基中，在30℃、220rpm下培养18小时后作为种子液，按照10v/v％的接种量转入容积为10L的机械搅拌式生物反应器内，发酵培养基采用无机盐培养基。发酵温度30℃，搅拌转速：350r/m，通风比：0.2VVM，起始pH值为5.0。
发酵培养基成分如下：
将配置好的发酵培养基灭菌冷却到30℃，氨水调节pH值为5.0后接种种子液。
发酵24小时后添加甲醇，浓度为10ml/L开始诱导溶菌酶蛋白。以后每24小时添加一次甲醇，甲醇浓度仍为10ml/L。诱导96小时后发酵过程结束。
经GB/T25879-2010方法检测鸡溶菌酶酶活，发酵液中溶菌酶的酶活力达到18000-20000u/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一株产鸡溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02，含有SEQ ID NO:1所示的鸡溶菌酶表达序列,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCC No.10780。
2.权利要求1所述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌在鸡溶菌酶生产中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的种子培养基采用YPD培养基；基本发酵培养基采用BMGY培养基；诱导培养基为BMMY培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510350298.3A CN105039189B (zh) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | 一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510350298.3A CN105039189B (zh) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | 一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105039189A CN105039189A (zh) | 2015-11-11 |
| CN105039189B true CN105039189B (zh) | 2018-04-17 |
Family
ID=54446164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510350298.3A Expired - Fee Related CN105039189B (zh) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | 一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105039189B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018501814A (ja) | 2014-11-11 | 2018-01-25 | クララ フーズ カンパニー | 卵白タンパク質産生のための方法および組成物 |
| AU2020309602A1 (en) | 2019-07-11 | 2022-02-24 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
| US12096784B2 (en) | 2019-07-11 | 2024-09-24 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
| US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
| CN111019851A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-04-17 | 浙江新银象生物工程有限公司 | 一种含高拷贝数蛋清溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101050467A (zh) * | 2007-03-20 | 2007-10-10 | 李浙烽 | 一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0547171A1 (en) * | 1990-09-05 | 1993-06-23 | The Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. | Production of human lysozyme in methylotrophic yeast cells and efficient secretion therefrom |
| CN1252257C (zh) * | 2001-03-02 | 2006-04-19 | 复旦大学 | 人类g型溶菌酶、其编码序列、制法及用途 |
-
2015
- 2015-06-23 CN CN201510350298.3A patent/CN105039189B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101050467A (zh) * | 2007-03-20 | 2007-10-10 | 李浙烽 | 一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Codon optimization, constitutive expression and antimicrobial characterization of hen egg white lysozyme (HEWL) in Pichia pastoris;Jun Li等;《African Journal of Biotechnology》;20120712;第11卷(第56期);第11887-11893页 * |
| Expression of chicken egg white lysozyme by Saccharomyces cerevisiae;Jacques Oberto等;《gene》;19851231;第40卷;第57-65页 * |
| High yield secretion of the sweet-tasting protein lysozyme from the yeast Pichia pastoris;Tetsuya Masuda等;《Protein Expression and Purification》;20041102;第39卷;第35-42页，尤其是第35页摘要第2-3、9-10行，第36页左栏第4段-第37页左栏第4段，第39页图1 * |
| 毕赤酵母表达系统;韩雪清等;《微生物学杂志》;20030731;第23卷(第4期);第35-40页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105039189A (zh) | 2015-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105039189B (zh) | 一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建与应用 | |
| CN105087456B (zh) | 一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌构建的方法 | |
| CN101450964B (zh) | 一种基因工程抗菌肽及其制备方法与应用 | |
| CN105176874B (zh) | 凝结芽孢杆菌fm603及其应用 | |
| CN105175518B (zh) | 凝结芽孢杆菌fm603产生的细菌素及其制备方法 | |
| CN103250568A (zh) | 一种制备富硒猴头菌的方法 | |
| CN103923869A (zh) | 一种产n-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN105062947B (zh) | 一种高芽孢率地衣芽孢杆菌的生产方法 | |
| CN102115718B (zh) | 一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用 | |
| CN104996166A (zh) | 一种液体菌种的培养方法 | |
| CN108220190A (zh) | 一种反刍专用复合微生态制剂的制备方法 | |
| CN103789282B (zh) | 一种高温甘露聚糖酶ManAHr的制备方法及其基因和应用 | |
| CN103451163B (zh) | 一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体 | |
| CN103555646B (zh) | 一种共表达l-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌 | |
| CN102634553B (zh) | 一种海南霉素的发酵方法 | |
| CN106906197B (zh) | 发酵工艺制备溶菌酶的方法 | |
| CN106701867B (zh) | 一种提高尼可霉素产量的方法 | |
| CN102061295A (zh) | 透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高黑曲霉产糖化酶产量的方法 | |
| CN106520579B (zh) | 一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌发酵液培养基 | |
| CN103960483B (zh) | 一种主产纤维素酶饲用益生菌制剂的液态发酵生产方法 | |
| CN105062906B (zh) | 一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法 | |
| CN103865832A (zh) | 植物乳杆菌bs10及其在调节猪血脂方面的应用 | |
| CN103103062A (zh) | 复合益生菌制备桑葚营养饮料方法 | |
| CN107058266B (zh) | 一种通过发酵工艺制备溶菌酶的方法 | |
| CN102899347B (zh) | 通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180417 |