CN112322523A - 一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法，以解决现有技术中，甜瓣子发酵缺少专用菌株、发酵菌株单一以及发酵速度慢的问题。本发明中所述复合菌剂按重量比包括下述重量份原料：米曲霉曲精0.03‰‑0.1‰、红曲霉曲精0.03‰‑0.1‰、乳酸菌0.01‰‑0.05‰和酵母菌0.05‰‑0.1‰。本发明所生产出的甜瓣子具有较高的营养价值，制备过程中的发酵速度较快。

Description

一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法
技术领域
本发明属于微生物制备技术领域，具体涉及一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法。
背景技术
现阶段郫县豆瓣是我国西南地区一种特色发酵蚕豆酱，以其味辣香醇、红棕油亮、瓣粒酥脆、粘稠绒实、酱香浓郁的特点为人所知，在烹饪与食品工业中具有广泛应用。郫县豆瓣是以红辣椒、蚕豆为主要原料，食用盐、小麦粉等为辅料酿制而成。其生产工艺主要包括制曲、甜瓣子发酵、辣椒醅及混合后发酵生香等阶段。在郫县豆瓣的甜瓣子发酵和混合后熟中，制曲时所产生的酶、微生物的代谢以及各类化学反应共同作用，水解原料中大分子物质，同时生成各类呈色、呈味和呈香物质，对郫县豆瓣产品质量有着重要的影响。因此，改进甜瓣子发酵工艺，提升甜瓣子品质对郫县豆瓣酱品质的提升有重要意义。
目前甜瓣子发酵存在以下几个问题：(1)缺乏专用菌种，发酵菌剂存在纯度不高，杂菌多，孢子活菌数低，繁殖能力和产酶能力不稳定等问题；(2)目前制曲多采用单一菌种，或开放环境下制作的菌种，因此产生的酶系比较单一，菌种的数量和质量不可控，产品的风味单调，产品存在不可控性；(3)生产周期长，由于采用自然发酵，受到环境因素影响大，发酵速度较慢。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法，以解决现有技术中，甜瓣子发酵缺少专用菌株、发酵菌株单一以及发酵速度慢的问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种复合菌剂，按重量比包括下述重量份原料：米曲霉曲精0.03‰-0.1‰、红曲霉曲精0.03‰-0.1‰、乳酸菌0.01‰-0.05‰和酵母菌 0.05‰-0.1‰。
进一步地，所述所述复合菌剂按重量比包括下述重量份原料：米曲霉曲精0.07‰、红曲霉曲精0.07‰、乳酸菌0.03‰和酵母菌0.07‰。
进一步地，所述米曲霉曲精为郫酿M003，所述红曲霉曲精为郫酿PM001，所述乳酸菌剂为乳酸片球菌R036的菌剂；所述的酵母菌剂为鲁氏接合酵母郫酿 J028的菌剂。
进一步地，所述米曲霉曲精郫酿M003和红曲霉曲精郫酿PM001的孢子活菌数大于100亿/g，发芽率大于90％；乳酸菌剂活菌数大于1011CFU/g，酵母菌剂活菌数大于1010CFU/g。
本发明提供的一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法，其特征在于：
(1)烫瓣：将脱壳的干蚕豆瓣中的杂质去除，加入沸水中漂洗、烫热 2-3min，直到瓣子变软、可弯折；取出瓣子用冷水降温至常温并沥干；
(2)接种制曲：按质量比加入重量份15％-17％的面粉、0.03‰-0.1‰米曲霉曲精和0.03‰-0.1‰红曲霉曲精并拌匀，得到混合曲精；
(3)将步骤(2)中所述混合曲精倒入曲床铺开，保持曲床湿度在88％-92％，温度在30-36℃，培养48-72h得到成品曲精；
(4)将步骤(3)所得成品曲精加入步骤(1)所得瓣子中得到霉瓣子；将霉瓣子与水按质量比1:1混合，并加入12％-15％的盐，充分混匀搅拌，装入玻璃罐中摇匀，在30-38℃下密封发酵4-8d后，得到初步发酵的瓣子；
(5)向步骤(4)中所得的初步发酵的瓣子中加入0.01‰-0.05‰乳酸菌剂进行强化发酵8-15d，得到强化发酵的瓣子；
(6)向步骤(5)中所得的强化发酵的瓣子中加入0.05‰-0.1‰酵母菌剂进行最终发酵37d-48d，得到甜瓣子成品。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
(1)本发明提供的一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法，所采用的米曲霉曲精郫酿M003具有很强的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在较广的pH范围内都具有活性，能耐受较高的温度，稳定性好，作为发酵菌株能提高甜瓣子成品的营养价值。
(2)本发明提供的一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法，采用的红曲霉PM001在生长过程中可以产生多种酶类，大大提高发酵的速度；且其发酵过程中的产物洛伐他丁对健康十分有益，具有降血脂将血压的明显作用。
(3)本发明提供的一种复合菌剂及其用于发酵甜瓣子的方法，采用复合的专用菌株进行发酵，发酵速度较快，效率更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中的菌株郫酿PM001的进化树；
图2为本发明红曲霉菌株郫酿PM001产洛伐他丁的色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
一、制备实施例
实施例1：
制备米曲霉曲精：
(1)接种高产酶的米曲霉郫酿M003至黄豆汁培养基斜面，30℃培养72h。
(2)配制麸皮培养基，121℃灭菌30min，挑取斜面菌丝和孢子接种，搅匀，30℃培养16h后摇散继续培养；培养24h后第二次摇瓶；继续培养至 72h，置于4℃备用。
(3)种曲机扩大培养：称取100kg麸皮，100kg水，混匀，粉碎，分装于发酵罐托盘。将盖扣紧，关闭阀门，通蒸汽升温升压，121℃灭菌20min，冷却水冷却，待物料冷却至30℃左右接种。30℃、相对湿度85％培养72h，前56h通净化空气和水蒸气保持培养罐内湿度和水汽循环，72h后菌丝和孢子全部转为黄绿色。麸曲于50℃通循环风干燥至孢子能脱离麸皮，约24h。采用振荡筛过滤，依次采用40目和60目两道筛分离孢子得到曲精。
(4)检测得到曲精孢子数为150亿/g，发芽率为91.45％，符合使用条件。
制备红曲霉曲精：
(1)以传统发酵的玫瑰腐乳，红曲米为对象，采用红曲霉筛选培养基筛选，挑取红曲霉菌株于PDA培养基划线纯化，以PDA上产红曲红色素最多的菌株郫酿PM001为研究对象。
(2)红曲霉筛选培养基：称取200g去皮土豆，加入800mL蒸馏水，煮沸20min，采用纱布过滤，加入20g葡萄糖，100mL无水乙醇，20g乳酸，琼脂40g，补加蒸馏水至1000mL；将红曲霉郫酿PM001接种于马铃薯土豆培养基中，30℃培养5d。
(3)采用Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪检测培养液中洛伐他丁含量，检测结果显示郫酿PM001培养液中洛伐他丁的含量为0.43g/L。
(4)接种高产酶和红曲红色素的红曲霉郫酿PM001至黄豆汁培养基斜面， 30℃培养72h。
(5)配制糙米培养基(糙米和水5∶4混合，分装至1L三角瓶，60g/ 瓶)，121℃灭菌30min，挑取斜面菌丝和孢子接种，搅匀，30℃培养72h，置于4℃备用。
(6)种曲机扩大培养：称取100kg糙米，80kg水，混匀，浸泡一晚，糙米分装于发酵罐托盘。将盖扣紧，关闭阀门，通蒸汽升温升压，121℃灭菌 20min，冷却水冷却，待物料冷却至30℃左右接种。30℃、相对湿度85％培养72h。采用振荡筛过滤，粉碎机粉碎得到红曲霉曲精。
(7)经检测得到曲精孢子数为120亿/g，发芽率为93.20％。
制备乳酸菌剂：
(1)挑取高产酸乳酸片球菌R036单菌落接种至30mL MRS液体培养基中活化，37℃培养18h；将活化液转移至3L MRS液体培养基中，37℃培养18 h得到种子液。
(2)采用发酵罐灭菌500L MRS液体培养基，调整培养基pH至6.0，接入3L种子液，37℃培养基18h。低温离心得到菌体，按1:1(质量体积比)加入20％海藻糖保护剂后，采用冷冻干燥机干燥48h得到乳酸菌剂。
(3)经检测得到乳酸菌剂R036活菌数为5.8×1011CFU/g。
制备酵母菌剂：
(1)将产香鲁氏接合酵母郫酿J028以106细胞/mL的密度接入3L麦芽汁培养基中，30℃培养24h得到种子液，将种子液接入500L发酵罐中，30℃培养24h。离心发酵液以获得酵母细胞，加入10％的海藻糖后冷冻干燥，以获得产香酵母冻干菌剂。
(2)经检测得到，酵母菌剂J028中活菌数为6.3×1010CFU/g。
1.1原料：
脱壳的干蚕豆瓣1kg；0.15kg面粉；0.12kg盐；米曲霉曲精0.03‰；红曲霉曲精0.03‰；乳酸菌0.01‰；酵母菌0.05‰。
1.2制备方法：
(1)烫瓣：将脱壳的干蚕豆瓣中的杂质去除，加入沸水中漂洗、烫热2min，直到瓣子变软、可弯折；取出瓣子用冷水降温至常温并沥干；
(2)接种制曲：按质量比加入准备好的面粉、米曲霉曲精和红曲霉曲精并拌匀，得到混合曲精；
(3)将步骤(2)中所述混合曲精倒入曲床铺开，保持曲床湿度在88％，温度在30℃，培养48h得到成品曲精；
(4)将步骤(3)所得成品曲精加入步骤(1)所得瓣子中得到霉瓣子；将霉瓣子与水按质量比1:1混合，并加入准备好的的盐，充分混匀搅拌，装入玻璃罐中摇匀，在30℃下密封发酵4d后，得到初步发酵的瓣子；
(5)向步骤(4)中所得的初步发酵的瓣子中加入准备好的乳酸菌剂进行强化发酵8d，得到强化发酵的瓣子；
(6)向步骤(5)中所得的强化发酵的瓣子中加入准备好的酵母菌剂进行最终发酵37d，得到甜瓣子成品。
实施例2：
制备米曲霉曲精：
除步骤(4)中经检测得到曲精孢子数为150.8亿/g，发芽率为91.85％；其余同实施例1。
制备红曲霉曲精：
除步骤(3)中采用Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪检测培养液中洛伐他丁含量，检测结果显示PM001培养液中洛伐他丁的含量为0.45g/L 和步骤(7)中经检测得到曲精孢子数为118亿/g，发芽率为92.40％；其余同实施例1。
制备乳酸菌剂：
除步骤(3)中经检测得到乳酸菌剂R036活菌数为5.9×1011CFU/g，其余同实施例1。
制备酵母菌剂：
除步骤(2)中经检测得到，酵母菌剂J028中活菌数为6.4×1010CFU/g，其余同实施例1。
2.1原料：
脱壳的干蚕豆瓣1kg；0.17kg面粉；0.15kg盐；米曲霉曲精0.1g；红曲霉曲精0.1g；乳酸菌0.05g；酵母菌0.1g。
2.2制备方法：
(1)烫瓣：将脱壳的干蚕豆瓣中的杂质去除，加入沸水中漂洗、烫热3min，直到瓣子变软、可弯折；取出瓣子用冷水降温至常温并沥干；
(2)接种制曲：按质量比加入准备好的面粉、米曲霉曲精和红曲霉曲精并拌匀，得到混合曲精；
(3)将步骤(2)中所述混合曲精倒入曲床铺开，保持曲床湿度在92％，温度在36℃，培养72h得到成品曲精；
(4)将步骤(3)所得成品曲精加入步骤(1)所得瓣子中得到霉瓣子；将霉瓣子与水按质量比1:1混合，并加入准备好的盐，充分混匀搅拌，装入玻璃罐中摇匀，在38℃下密封发酵8d后，得到初步发酵的瓣子；
(5)向步骤(4)中所得的初步发酵的瓣子中加入准备好的乳酸菌剂进行强化发酵15d，得到强化发酵的瓣子；
(6)向步骤(5)中所得的强化发酵的瓣子中加入准备好的酵母菌剂进行最终发酵48d，得到甜瓣子成品。
实施例3：
制备米曲霉曲精：
除步骤(4)中经检测得到曲精孢子数为150.9亿/g，发芽率为91.86％；其余同实施例1。
制备红曲霉曲精：
除步骤(3)中采用Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪检测培养液中洛伐他丁含量，检测结果显示PM001培养液中洛伐他丁的含量为0.46g/L 和步骤(7)中经检测得到曲精孢子数为118.4亿/g，发芽率为92.48％；其余同实施例1。
制备乳酸菌剂：
除步骤(3)中经检测得到乳酸菌剂R036活菌数为5.85×1011CFU/g，其余同实施例1。
制备酵母菌剂：
除步骤(2)中经检测得到，酵母菌剂J028中活菌数为6.42×1010CFU/g，其余同实施例1。
3.1原料：
脱壳的干蚕豆瓣1kg；0.16kg面粉；0.14kg盐；米曲霉曲精0.07g；红曲霉曲精0.07g；乳酸菌0.03g；酵母菌0.07g。
3.2制备方法：
(1)烫瓣：将脱壳的干蚕豆瓣中的杂质去除，加入沸水中漂洗、烫热3min，直到瓣子变软、可弯折；取出瓣子用冷水降温至常温并沥干；
(2)接种制曲：按质量比加入准备好的面粉、米曲霉曲精和红曲霉曲精并拌匀，得到混合曲精；
(3)将步骤(2)中所述混合曲精倒入曲床铺开，保持曲床湿度在90％，温度在35℃，培养60h得到成品曲精；
(4)将步骤(3)所得成品曲精加入步骤(1)所得瓣子中得到霉瓣子；将霉瓣子与水按质量比1:1混合，并加入准备好的盐，充分混匀搅拌，装入玻璃罐中摇匀，在37℃下密封发酵6d后，得到初步发酵的瓣子；
(5)向步骤(4)中所得的初步发酵的瓣子中加入准备好的乳酸菌剂进行强化发酵12d，得到强化发酵的瓣子；
(6)向步骤(5)中所得的强化发酵的瓣子中加入准备好的酵母菌剂进行最终发酵44d，得到甜瓣子成品。
实施例4：
4.1原料：
脱壳的干蚕豆瓣1kg；0.16kg面粉；0.14kg盐；米曲霉曲精0.07g。
4.2制备方法：
(1)烫瓣：将脱壳的干蚕豆瓣中的杂质去除，加入沸水中漂洗、烫热3min，直到瓣子变软、可弯折；取出瓣子用冷水降温至常温并沥干；
(2)将准备好的米曲霉曲精倒入曲床铺开，保持曲床湿度90％，温度35℃，培养60h得到成品曲精；
(3)将步骤(2)所得成品曲精加入步骤(1)所得瓣子中得到霉瓣子；将霉瓣子与水按质量比1:1混合，并加入准备好的盐，充分混匀搅拌，装入玻璃罐中摇匀，在37℃下密封发酵60d后，得到发酵的甜瓣子成品。
实施例5：
5.1原料：
脱壳的干蚕豆瓣1kg；0.16kg面粉；0.14kg盐；0.07g目前已公布的一种可用于发酵的红曲霉菌株LF-914，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16087。
5.2制备方法：
同实施例4。
实施例6：
6.1原料：
脱壳的干蚕豆瓣1kg；0.16kg面粉；0.14kg盐；0.07g目前已公布的一种可用于发酵的红曲霉菌株LF-914，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16087；0.07g米曲霉曲精。
6.2制备方法：
(1)烫瓣：将脱壳的干蚕豆瓣中的杂质去除，加入沸水中漂洗、烫热3min，直到瓣子变软、可弯折；取出瓣子用冷水降温至常温并沥干；
(2)接种制曲：按质量比加入准备好的面粉、米曲霉曲精和红曲霉曲精并拌匀，得到混合曲精；
(3)将步骤(2)中所述混合曲精倒入曲床铺开，保持曲床湿度在90％，温度在35℃，培养60h得到成品曲精；
(4)将步骤(3)所得成品曲精加入步骤(1)所得瓣子中得到霉瓣子；将霉瓣子与水按质量比1:1混合，并加入准备好的盐，充分混匀搅拌，装入玻璃罐中摇匀，在37℃下密封发酵60d后，得到发酵的甜瓣子成品。
二、实验结果
将实施例1-3中所得成品甜瓣子按照实施例1-3的顺序进行编号为实验例 1-3，将实施例4-6中所得成品甜瓣子按照实施例4-6的顺序进行编号为对比例 1-3；对实验例1-3和对比例1-3中的甜瓣子进行总酸、氨基酸态氮含量的检测，检测标准参考GB 5009.235-2016；再对甜瓣子中的有机酸含量进行检测，检测标准参考GB5009.157-2016；再对甜瓣子的产香能力采用GC-MS进行分析，包括下述步骤：取2g甜瓣子于15mL固相微萃取瓶，滴加2μL0.5μg/mL 的4-甲基-2-戊醇溶液作为内标物，混匀后60℃预热2min，固相微萃取纤维 60℃恒温吸附50min。萃取完毕后，将固相微萃取纤维插入气质联用仪进样孔，气相色谱分析以氦气为载气，柱流量0.93mL/min，不分流，进样口温度 250℃。柱箱初始温度50℃，程序开始后10℃/min升温至85℃，保持1.5 min；5℃/min升温至100℃，保持1min；2.5℃/min升温至175℃，保持 1.5min；10℃/min升温至250℃；保持2min。质谱离子源温度230℃，质荷比扫描范围为35.0～350.0m/z，电子轰击能量70eV，检测器电压0.1kV。挥发性化合物的鉴定挥发性成分的鉴定利用NIST05谱库检索结果与人工图谱解析共同确定；相对含量采用内标法进行定量分析。所得结果如下表1、表2、图1和图2所示：
表1-甜瓣子的理化检测结果对照表
Figure BDA0002747992650000111
表2-甜瓣子挥发性风味物质相对含量比较
Figure BDA0002747992650000121
根据表1和表2可得出结论：实验例中的氨基态氮含量明显高于单一曲霉发酵的甜瓣子，说明复合菌剂发酵甜瓣子提高了甜瓣子发酵速率，缩短了发酵周期；而添加了红曲霉PM001的甜瓣子中检测出了洛伐他丁，未添加红曲霉 PM001的甜瓣子中未检测出洛伐他丁；说明本发明添加的红曲霉PM001在发酵的时候具有专用型；能够提高甜瓣子的营养价值。
实验例中的甜瓣子中醇和酯类风味物质的相对含量显著高于仅采用曲霉发酵的甜瓣子。说明强化的酵母菌株代谢产风味物质强，加快了风味物质的形成，赋予甜瓣子更好的风味。复合菌剂发酵甜瓣子的方法能有效提高甜瓣子风味。
对实验例1-3和对比例1-3中的甜瓣子进行味觉、嗅觉和视觉的检验，所得结果如表3所示：
表3-甜瓣子的感官检测结果
Figure BDA0002747992650000131
根据表3可得出结论：不管是在色泽、香气和滋味上，实验例都要明显优于对比例。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂按重量比包括下述重量份原料：米曲霉曲精0.03‰-0.1‰、红曲霉曲精0.03‰-0.1‰、乳酸菌0.01‰-0.05‰和酵母菌0.05‰-0.1‰。
2.根据权利要求1所述的一种复合菌剂，其特征在于：所述所述复合菌剂按重量比包括下述重量份原料：米曲霉曲精0.07‰、红曲霉曲精0.07‰、乳酸菌0.03‰和酵母菌0.07‰。
3.根据权利要求1所述的一种复合菌剂，其特征在于：所述米曲霉曲精为郫酿M003，所述红曲霉曲精为郫酿PM001，所述乳酸菌剂为乳酸片球菌R036的菌剂；所述的酵母菌剂为鲁氏接合酵母郫酿J028的菌剂。
4.根据权利要求1所述的一种复合菌剂，其特征在于：所述米曲霉曲精郫酿M003和红曲霉曲精郫酿PM001的孢子活菌数大于100亿/g，发芽率大于90%；乳酸菌剂活菌数大于1011CFU/g，酵母菌剂活菌数大于1010 CFU/g。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的一种复合菌剂用于发酵甜瓣子的方法，其特征在于：
（1）烫瓣：将脱壳的干蚕豆瓣中的杂质去除，加入沸水中漂烫2-3min，直到瓣子变软、可弯折；取出瓣子用冷水降温至常温并沥干；
（2）接种制曲：按质量比加入重量份15%-17%的面粉、0.03‰-0.1‰米曲霉曲精和0.03‰-0.1‰红曲霉曲精并拌匀，得到混合曲精；
（3）将步骤（2）中所述混合曲精倒入曲床铺开，保持曲床湿度在88%-92%，温度在30-36℃，培养48-72h得到成品曲精；
（4）将步骤（3）所得成品曲精加入步骤（1）所得瓣子中得到霉瓣子；将霉瓣子与水按质量比1:1混合，并加入12%-15%的盐，充分混匀搅拌，装入玻璃罐中摇匀，在30-38℃下密封发酵4-8d后，得到初步发酵的瓣子；
（5）向步骤（4）中所得的初步发酵的瓣子中加入0.01‰-0.05‰乳酸菌剂强化发酵8-15d，得到强化发酵的瓣子；
（6）向步骤（5）中所得的强化发酵的瓣子中加入0.05‰-0.1‰酵母菌剂进行最终发酵37d-48d，得到甜瓣子成品。
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