CN104357342B - 一种新疆地方特色馕面团优质酵母及其在制馕中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新疆地方特色馕面团优质酵母及其在制馕中的应用。通过从从新疆传统的馕面团中筛选分离获得酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）CCTCC No：M 2014415；并通过利用该编号为24M的馕面团优质酵母菌应用在馕制品中，在保留和继承传统馕制品原有风味、保证成品干酵母的稳定性、食品安全性等方面获得显著的技术效果，是实现馕工业化烤制进程的必要途径，也是一个新产业发展的增长点，具有极大地社会经济价值，具有广泛的应用前景。

Description

一种新疆地方特色馕面团优质酵母及其在制馕中的应用
技术领域
本发明涉及一种功能微生物菌种及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种新疆地方特色馕面团优质酵母及其应用的技术领域。
背景技术
“馕”一词源于波斯语，曾在阿拉伯半岛、土耳其、中亚、西亚诸国流行。但烤馕却并非源自于这些地区。据考证，维吾尔人烤馕的历史距今已有2000余年，维吾尔族俗语说：“可以一日无菜，但绝不可以一无馕。”可见，不仅烤馕是维吾尔族最主要的面食品，而且食馕已成为维吾尔人的一种习俗、文化。
近年来随着我国经济的发展，人民生活水平的不断提高和生活节奏的加快，城镇居民对馕商品的需求量急剧增加，同时对馕的质量也提出了更高的要求，馕的工业化生产已成为现代社会的需求。馕是以小麦面、玉米面或高梁面为原料，加少许盐水和酵面烤制而成的一种面饼，是维吾尔族的传统主食之一在馕的制造过程中，馕面团发酵是一个很重要的环节，与成品的质量有着密切的关系。馕面团发酵最关键的是酵母菌，它会影响馕面团发酵特性和馕的品质，当前制馕中馕面团发酵大都采用自然发酵或者直接采用外购普通的酵母，而熟知制馕工艺或者喜爱馕的人都明白酵母对于馕的口感和风味都具有重要的作用。
很多新疆人都非常爱吃用传统的馕面团发酵的馕。馕面团又称老酵、酵头、老肥、面种、面头，发酵是我国的传统面团发酵方法，在新疆广大城乡居民家庭中至今仍被广泛应用。这种方法不但成本低廉，简便易行，使馕保持原汁原味，但是馕面团中大量杂菌的存在，不但具有传播病源的风险，还导致面团发酵过酸，需要添加苏打进行中和酸味。对碱过量，面制品偏碱发黄，馕饼表面易开裂，风味也不好。目前常见的各种安琪酵母等厂家生产的商品酵母粉产品虽然驰名国内外，但尚未见到能被新疆原居民广泛采用和在口感上认可的馕面团发酵酵母粉；这主要可能是馕发酵酵母是本地区保存的特殊酵母品系，他们与酵母粉制品中的酵母是不同的酵母品种或品系，因而产生的代谢产物有差异；酵母粉发酵馕饼面团导致馕饼口感变味，降低了馕饼应有的食用价值和观赏性。
目前，酵母菌在食品工业中占有极其重要的地位。利用酵母菌生产的食品种类很多, 酵母不仅在发酵面团过程中产生风味物质, 为发酵产品提供特有的质构和风味, 还会增加营养价值,酵母菌与人们的生活有着十分密切的关系，几千年来劳动人民利用酵母菌制作出许多营养丰富、味美的食品和饮料。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。可在缺氧环境中生存。目前已知有1000多种酵母。在我国目前目前对酵母菌资源的开发利用中，新疆农垦科学院的罗晓玲等1991年根据酵母的生理生化、形态学特征及发酵特征，筛选出6株独特气候条件的优良酿酒酵母。2007年8月，内蒙古农业大学的倪慧娟从新疆少数民族家庭采集28份传统工艺酿造酸马奶样品中分离得到87株酵母菌，将其鉴定到4个种。2008年西北农林科技大学的王泽举等人对新疆玛纳斯葡萄酒的发酵过程中不同阶段出现的酵母种类及动态变化进行探讨，用WL营养琼脂培养基进行鉴定，共得到8个属9个种。2009年石河子大学的李宝坤等从自然发酵的5种哈密瓜汁中分离得到25株酵母菌并从中筛选得到1株产酒精能力高的酿酒酵母。2006年本研究室的杨艳艳同学分离鉴定了一株产β-胡萝卜素的粘性红圆酵母，申请获得了国家发明专利，同一年她从工业污水池中分离鉴定了一株耐碱酵母等研究报道，未见有关筛选利用馕面团优质酵母的报道。
国内外对各种食品中酵母菌的分离鉴定已进行了许多研究，如酱油，苹果原料、发酵刺梨、鸭梨酒、信阳民间传统米酒、酸马奶酒、绿橄榄等，甚至还对“神舟”五号飞船搭载过的茅台酒大曲中的酵母菌进行过鉴定，但对民间传统面食中酵母菌的分离鉴定却未见报道。
馕面团发酵是传统面团发酵方法，但是馕面团中存在大量杂菌，存在食品卫生安全隐患；长期保存，长途运输难度大。国内外尚未见到能被新疆原居民广泛采用和在口感上认可的新疆特色馕面团发酵酵母粉，筛选新疆地方特色馕面团优质酵母及其应用都具有现实的作用。
发明内容
针对现有技术未见有关新疆地方特色馕面团优质酵母菌的筛选相关研究的技术现状，本发明旨在提供一种新疆地方特色馕面团优质酵母及其在制馕中的应用，从而发掘出耐低温、麦芽糖和二氧化碳产率高、发酵速率高和制作馕饼口感与风味俱佳的“土著”新菌种，为提高馕加工品质和增加馕饼特有口感风味都具有重要的作用。
本发明采用的主要技术方案：
本发明当中采用现代微生物技术，从新疆传统的馕面团中筛选出一批的发酵酵母菌，从优化分离筛选出一株编号为24M的菌株，经确认为一种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，经生理生化鉴定和分子水平分类确定为酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M），该菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072, 保藏日期是2014年09月14日，保藏号是CCTCC No：M 2014415；并通过利用该编号为24M的馕面团优质酵母菌应用在馕制品中，在保留和继承传统馕制品原有风味、保证成品干酵母的稳定性、食品安全性等方面获得显著的技术效果，是实现馕工业化烤制进程的必要途径，也是一个新产业发展的增长点，具有极大地社会经济价值。
本发明提供了一种酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）CCTCC No：M2014415，该菌种通过从馕面团中分离，筛选和培养，获得一批馕面团发酵酵母菌，从中筛选出一株编号为24M的菌株，经微生物学分类与鉴定，属于酵母属的Saccharomyces cerevisiae。
本发明通过阿拉伯半岛、土耳其、中亚、西亚诸国和中国新疆各地各样品采集地选择出馕饼的口感纯正，色泽宜人的，馕房，对其馕面团样品进行分离筛选，最后从馕面团分离出一批馕面团发酵酵母菌，通过进一步筛选，驯化选育，获得一株编号为24M。通过对所获菌株进行形态特征，生理生化特性及16S rDNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位，该菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072, 保藏日期是2014年09月14日，保藏号是CCTCC No：M 2014415；同时对该酵母菌的发酵活力，馕饼口感检测等特性进行了深入研究，从而分离的馕面团酵母菌中筛选出发酵活力良好，从而发掘出耐低温、麦芽糖和二氧化碳产率高、面团醒发时间较短，食品安全性高，发酵速率高和制作馕饼口感与风味俱佳的“土著”新菌种。为提高馕加工品质提供技术依据，给馕饼专用干 酵母粉的研制和问世提供菌种、技术支持。
具体的本发明提供了一种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，菌株编号为24M。该菌株已于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072, 保藏日期是2014年09月14日，保藏号是CCTCC No：M 2014415；该菌株最适生长条件为：温度28℃，将菌种接种于新鲜YPD培养基平板上,置28℃培养1-2d进行活化,然后将活化后的菌种划直线接种于新鲜YPD斜面上,28℃，自然pH，培养24-48h后观察记录下述特征：菌落质地奶酪状、菌落颜色乳白色、；菌落表面光滑；菌落边缘全圆。通过《酵母菌的特征与鉴定手册》对菌株24M进行传统形态学测定，生理生化检测确定菌株24M是Saccharomyces 属的成员，酵母菌的形态学特征检测包括宏观特征如在固体培养基上菌落形态,包括菌株的大小，颜色，边缘，外观，质地等特点、液体生长状态，微观特征如光学显微镜或电子显微镜下细胞形态，菌体呈球形，椭圆形，卵圆形，柠檬形；生理生化特征包括对不同糖类的发酵和对碳源、氮源化合物的同化能力，对盐、碱、酸、温度耐受能力等生理学特性。菌株24M是Saccharomyces 属的成员，并经过分子水平测试，所测酵母菌26S rDNA D1/D2区DNA序列在BLAST( http :/ / www. ncbi. nlm. nib.gov/ blast/ blast . cgi )上进行比对。通过BLAST同源比对，菌株24M的26S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，该菌株酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）(KM979345)与亲缘关系最亲的菌株Saccharomyces cerevisiae KDLYH3-3( KM506733)的序列相似性为98.98%，菌种24M与Saccharomyces cerevisiae strainKDLYH3-3处于最小分支，是其仅似种；进而将该菌株24M确定为酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）。
进一步，本发明提供酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）CCTCC No：M2014415用于馕饼面团发酵中的应用。通过将该菌株酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）CCTCC No：M 2014415对馕饼面团的发酵速率高，使面团醒发时间短，让馕饼口感与风味俱佳，馕饼表面光滑，食品安全性高等作用，特别是在制备的馕饼保留传统的口味和口感方面具有突出显著的技术效果。
本发明提供了一种适用于馕面团的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）CCTCC No：M 2014415的保存条件，采用YEPD培养基， 成分：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂粉20g，水1000mL，灭菌条件：115℃ 15min，培养条件：pH自然，28℃。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
（1）本发明分离筛选提供的适用于馕面团的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415是一种优质的制馕发酵菌株，具有馕饼面团的发酵速率高，使面团醒发时间短，让馕饼口感与风味俱佳，馕饼表面光滑，食品安全性高等作用。
（2）本发明的重心在于对新疆各地传统馕面团中酵母菌种类、多样性、及其种群结构，全面、系统、精确地进行摸底和普查；首次通过深入、系统地探索新疆馕面团中酵母菌的生物多样性、物种特殊性及其发酵特性的科学实验，通过系统发育分析对馕面团的酿酒酵母研究领域内酵母菌的生存现状进行评价;本发明提供的适用于馕面团的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415是一种优质的制馕发酵菌株，对于构建菌种资源库将当地特有的优良酵母菌种群进行拯救、保存和利用开发都具有重要的作用和意义，也为提高馕加工品质提供技术依据，特别是在极端环境下的微生物资源中,存在现代发酵工业需要的优良类型,具有潜在的开发利用价值。
附图说明
图1显示为馕面团酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M2014415的生长曲线图。
图2显示为馕面团酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M2014415的菌落形态图。
图3显示为馕面团酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M2014415的细胞形态图。
图4显示为馕面团酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M2014415的系统发育进化树图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。
本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：
采用的主要试剂原辅材料：葡萄糖、蔗糖（天津市化学试剂三厂）；蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）；氯化钠、醋酸钠、醋酸钾、三水醋酸钠、氢氧化钠、NH4NO3 、 KH2PO4 、 MgSO4·7H2O 、尿素 、可溶性淀粉（天津市福晨化学试剂厂）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；可溶性淀粉（天津市福晨化学试剂厂）；浓盐酸（乌鲁木齐市）；NH4Cl（西安化学试剂厂）；（NH4）2SO4 （天津市博迪化工有限公司）；Tris-Base、EDTA（BBI）；Taq DNA Polymerase 、10 × Taq Buffer (Mg2+ plus ) 、dNTP Mixture、 Marker D2000（北京天根生化科技有限公司）；引物对NL1/NL4 、引物对ITS1/ITS4 、蜗牛酶（上海生工生物工程有限公司）。
采用的主要设备仪器：BM1250-A型和面机，MXP18XCE型XRDX射线衍射仪，GPCV2000型高温凝胶测谱仪，DHG-9245A型恒温鼓风干燥箱，XRW-300BL型热变形维卡软化点测定仪，H-211型pH计，可见光分光光度计， H-8100型透射电子显微镜，凝胶Alphaimage2200TM成像仪，AG204电子分析天平（METTLER TOLRDO）,X21FS1 型显微镜,华SHZ-82气浴恒温振荡器，YY-III-3A水平电泳槽（北京六一仪器厂）,YX-DHS-50×65型恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂），胶Alphaimage2200TM 成像仪DYY-III-3A型平电泳槽（北京六一仪器厂）,CR仪Eppendorf Mastercycler （德国）, 500mL三角瓶，玻璃试管，灭菌吸管，剪刀，镊子，接种环，脱脂棉， 试管筐，水浴锅，EP管，枪头，样板，凝胶样品梳，直流电源，试管，烧杯，量筒，玻璃棒，涂布棒， PH试纸，纱布等。
本发明所使用的所有材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的%都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：新疆地方特色馕面团优质发酵菌株的分离、筛选及鉴定。
（1）菌种的分离和筛选
通过梯度稀释法和富集培养法，将来自阿拉伯半岛、土耳其、中亚、西亚诸国和中国新疆各地不同样品地点的馕面团样品适当稀释后，分别涂布于马铃薯膏固体培养基、YEPD固体培养基上28℃下培养36小时，按常规方法初步筛选出发酵速率高、发酵面团醒发时间短食品安性高的菌株。进一步进行感官实验，最后筛选出馕饼口感与风味俱佳的菌株以备后续实验。
通过在馕面团中分离，筛选和培养，获得一批馕面团优势的酵母菌，从中选出一株编号为24M的菌株，按《酵母菌的特征与鉴定手册》进行分类与鉴定，属于酵母属的Saccharomyces cerevisiae。
筛选确定的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株编号为24M。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心（ChinaCenter for Type Culture Collection，CCTCC））。地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学，邮编：430072。保藏日期是2014年9月15日，保藏号是CCTCC NO.M2014415，该菌株最适生长条件为：温度28℃，将菌种接种于新鲜YPD培养基平板上,置28℃培养1-2d进行活化,然后将活化后的菌种划直线接种于新鲜YPD斜面上,25℃培养24-48h后观察记录下述特征：菌落质地奶酪状、菌落颜色为乳白色、菌落表面光滑，菌落边缘为全圆，生长较快，，参见附图1、2和3。通过《酵母菌的特征与鉴定手册》对菌株24M进行传统形态学测定，生理生化检测，确定菌株24M是Saccharomyces属的成员，所测酵母菌26S rDNA D1/D2区DNA序列在BLAST( http :/ / www. ncbi. nlm. nib. gov/ blast/ blast . cgi )上进行比对。进而将该菌株24M确定为酵母属的Saccharomyces cerevisiae。通过BLAST同源比对，菌株24M的26S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，该菌株24M与Saccharomyces cerevisiae strain KDLYH3-3处于最小分支，是其仅似种；进而将该菌株24M确定为Saccharomyces cerevisiae。
本发明提供的菌株24M培养时使用的主要氮源为蛋白胨，硝酸铵，硫酸铵，但不能利用尿素，见表1所示结果可知馕面团酵母对各种氮源的利用率表现为蛋白胨>硝酸铵>硫酸铵>尿素；使用的主要碳源为葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，但不能利用乳糖如表2所示结果可知馕面团酵母对葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖的利用率分大小别为葡萄糖>麦芽糖>蔗糖>乳糖。本发明所提供的菌株24M的面团发酵温度为28℃,面团发酵所需时间40分钟 ，面团发酵前后的pH范围5.22-5.34。
通过上述对24M菌株进行形态学测定，并对菌株24M形状，大小，生理生化反应进行检测，本发明的24M菌株生物学特性如表1所示：
表1：馕面团酵母的氮源同化实验
实验氮源 蛋白胨 硝酸铵 硫酸铵 空白 尿素
菌落大小 0.5-3.5ml 0.1-0.5ml 0.1-0.4ml 0.2-1.2ml 不生长
表2：馕面团酵母的碳源同化实验
实验碳源 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 乳糖
OD值 1.812 1.766 1.682 0.249
通过上述对于菌种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 24M CCTCC NO：M2014415的菌落形态观察、碳源同化实验、氮源同化实验，生长温度测定、耐盐试验、耐糖实验，生长曲线测定均参照《通过《酵母菌的特征与鉴定手册》的方法进行。
（2）26S rDNA 序列比对及系统发育分析。
将测序得到的26S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的26S rDNA序列，用MEGA 5 Neighbor-joining 法构建系统进化树，参见附图4。将24M的26S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后,构建系统进化树。从图4中可以看出菌株24M与Saccharomyces cerevisiae strainKDLYH3-3之间进化距离最短，是Saccharomyces cerevisiae strain KDLYH3-3的近似种。结合24M的形态结构特征及生理生化特性，确定其为酵母属的Saccharomyces cerevisiae。
将所测得的26S rDNA序列输入Genbank，以Blast程序进行同源性比较，发现它与Saccharomyces cerevisiae strain KDLYH3-3的26S rDNA序列的相似性最大（98.98%），从而进一步确定它为Saccharomyces cerevisiae。结合24M的形态结构特征及生理生化特性，确定其为馕面团酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae24M CCTCC NO：M 2014415。
26S rDNA基因扩增及测序
>Saccharomyces cerevisiae 24M (KM979375)
AGGAAAAGAAACCCACCGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATTTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTTTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTTTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTTTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCCCTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGA
用真核生物26S rDNA基因通用引物进行扩增：
正向引物NL1:(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')]
反向引物NL4:(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')
PCR 扩增反应体系为50 μL，反应条件为：94°C，5 min；94°C，1 min，56°C， 1 min，72°C，1 min，36Cycles； 72°C，10min。扩增产物(约 600 bp)，PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物进行测序，将菌株24M进行26S rDNA序列测定，经测定，馕面团酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 24M CCTCC NO.M2014415的26s rDNA基因序列为589bp，参见附后提供的基因序列表，具体为：
aggaaaagaa acccaccggg attgccttag taacggcgag tgaagcggca aaagctcaaa 60
tttgaaattt ggtaccttcg gtgcccgagt tgtaatttgg agagggcaac tttggggccg 120
ttccttgttt atgttccttg gaacaggacg tcatagaggg tgagaatccc gtgtggcgag 180
gagtgcggtt ttttgtaaag tgccttcgaa gagtcgagtt gtttgggaat gcagctctaa 240
gtgggtggta aattccatct aaagctaaat attggcgaga gaccgatagc gaacaagtac 300
agtgatggaa agatgaaaag aactttgaaa agagagtgaa aaagtacgtg aaattgttga 360
aagggaaggg catttgatca gacatggtgt tttgtgccct ttgctccttg tgggtagggg 420
aatctcgcat ttccctgggc cagcatcagt tttggtggca ggataaatcc ataggaatgt 480
agcttgcctc ggtaagtatt atagcctgtg ggaatactgc cagctgggac tgaggactgc 540
gacgtaagtc aaggatgctg gcataatggt tatatgccgc ccgtcttga 589
26S rDNA 序列比对及系统发育分析：本发明通过总DNA的提取、26S rDNA基因的PCR扩增和测序。根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank数据库中调出相似性较高的相关酿酒酵母菌株的26S rDNA基因序列，用CLUSTAL X 进行多序列比对，并采用 Saitou和Nei 的邻接法（Neighbor Joining）用MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建。结果参见附图4所示，从树状图中可以看出，该菌株24M与Saccharomyces cerevisiae strain KDLYH3-3在同一分支上是其仅似种，表明二者的亲缘关系最近，比对结果表明，24M与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同源性最高，依据微生物分类方法，将菌种编号为24M菌株初步鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
实施例二：酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415的生长因子.
参见如下方式：但是应根据本发明提供的适用于制馕面团的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415特性确定其具体的生长因子，把菌株24M接种培养，结果见表3。
表3：温度、PH、盐、糖对菌株24M生长的影响
温度 20℃ 25℃ 28 37℃ 45℃
生长情况 + ++++ +++ ++ —
PH 2 3 5 7 9 11 12
生长情况 — + +++ ++++ ++ ++ +
NaCl浓度 0.5% 2.5% 5% 10%
生长情况 +++ ++++ ++ +
糖浓度 5% 10% 20% 40%
生长情况 +++ ++ + +
生长曲线及培养条件：按照如上方式将适用于制馕面团的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415进行培养，菌种的培养条件为：培养基为YEPD固体培养基，培养条件： 自然pH，温度28°C条件下培养36个小时，其生长曲线参见附图1。
通过以上结果得出酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M2014415 作为种子的最佳培养时间为18h。
实施例三：酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415适用于馕面团的发酵工艺研究
通过糖、盐浓度、pH值，温度等的优化来实现发酵获得制剂的目的。
（1）培养基pH的确定：按PH值3, 5, 7.0, 9,12，在200 r/min，温度 28℃条件下培养，得出最适生长pH值为7.0。
表4：pH优化结果
pH 3 5 7 9 12
OD值 0.098 2.113 2.147 2.079 1.430
由表4得出, 菌株24M最适合生长因子。
通过以上结果得出将馕面团酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 24M CCTCCNO：M 2014415的最适生长pH为7.0。
（2）培养温度对馕面团酵母的影响
表5：温度对葡萄酵母生长的影响
温度 20℃ 25℃ 28℃ 37℃ 45℃
OD值 1.681 2.236 2.131 1.969 不能生长
从表5可看出馕面团酵母生长的最佳温度约为25℃，温度降低或升高，馕面团酵母的生长速度降低，特别是温度过高时，酵母菌会被杀死，停止生长，所以通过以上结果得出将馕面团酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 24M CCTCC NO：M 2014415的最适生长温度为25℃。
（3）糖浓度和NaCl 浓度对馕面团酵母生长的影响
种子液体培养基： 酵母粉10g, 蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL, pH为6.0，在种子培养基的基础上继续优化。
表6：糖浓度对馕面团酵母生长的影响
不同的糖浓度 5% 10% 20% 40%
OD值 1.377 1.144 0.950 0.830
表7：NaCl浓度对馕面团酵母生长的影响
不同的NaCl浓度 0.5% 2.5% 5% 10%
OD值 2.197 2.036 1.904 0.607
从表6和表7中可以看出将馕面团酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 24MCCTCC NO：M 2014415的糖浓度为5%，NaCl浓度为0.5%时生长最佳。
实施例三：馕面团主要酿酒酵母的分离、纯化与保存
（1）馕面团主要酿酒酵母的分离、纯化与保存。馕面团酵母从各样品采集地选择出馕饼口感纯正，色泽宜人的馕房，从其馕面团样品中分离的。采用富集培养和梯度培养法进行酵母菌的分离。首先将样品在超净工作台中打开，用灭菌的环境下获取样品l0g左右，是馕面团样品时加入到一个盛有50ml无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，28℃振摇30min将样品充分打散、混匀。然后吸取1ml的液体加入到含链霉素的PDA液体培养基，28℃摇床培养1天，吸取1ml的培养液接种到一新的含链霉素的PDA液体培养基中，28℃摇床培养1-2天。用接种针粘取培养液在含链霉素的固体PDA培养基上进行4区划线。28℃培养箱倒置培养2-3天，挑取形态不同的菌落进行划线分纯，将纯化好的的菌株接入斜面备用。
（2）馕面团中优质酵母菌的分离阶段。从各地采集地选择出馕饼口感纯正，色泽宜人的馕房，从其馕房的面团中分离到了125株酿酒酵母，26株是C.humilis,23是株毕赤酵母，其中酿酒酵母占整个馕面团菌株的55.1%，称作为占优势的馕面团酵母菌，通过BLAST比对进一步得到61株突变酿酒酵母，通过发酵性能检测得到了8株发酵活力佳的菌株，进行馕饼口感测试多次筛选后最后得到一株馕面团优良菌株。
（3）馕面团优质酵母的保藏。采用平板菌落技术法，根据菌落形态特征，挑取明显分开的单菌落，如有几种不同形态的单菌落同时存在，则分别挑取到对应分离平板培养基上，进行单菌落分离培养。以保证分离出的菌必需是纯菌。斜面保藏：用1.5ml的离心管制备对应培养基斜面培养基。制备好的斜面常温下放置一周，以确保斜面没被污染。将分离纯化好的纯菌挑取到斜面上，28℃培养一周。待斜面培养物长出后，将斜面放置4℃保藏。甘油管保藏：制备20%的甘油，灭菌后取0.5ml装入1.5ml的离心管。将分离纯化好的纯菌挑取到装有甘油的离心管中混匀，放置-20℃保藏。
实施例四：酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415对馕面团发酵的影响。
1.优质酵母菌的发酵性能检测
1.1面团制备：称取2.0氯化钠，加约72.5mL水溶解，制成盐水溶液（以下简称为盐水）。称取140.0g中筋小麦粉，倒入和面机中。另称取3.0g鲜酵母样品（若样品已冷藏，应事先在30℃下放置一个小时）至50ml的 小烧杯中用少量上述盐水溶解鲜酵母，将溶解后的鲜酵母倒入和面机内并用少量盐水洗涤小烧杯两次，洗涤液和剩下的盐水一并倒入和面机内混合搅拌5分钟，面团温度应为30℃±0.2。
1.2 发酵力的测定：将揉制好的面团迅速称量70 g，将其置于500mL的量筒中，用木棒将其填充实于量筒底部并将面团顶部压平，记录初体积，并每隔0.5 h 记录面团体积增长量。读取体积时，将木棒伸入量筒内，使其低端轻触面团最高部位，并贴于量筒读数一侧以减小读数误,对30株菌株进行发酵性能检测，其中以菌株编号为24M的对馕面团发酵性能最好，面团体积膨胀达到119ml,这说明适用于制馕面团的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415酵母产二氧化碳(CO2)的能力较强，气体填充面团，由于面筋网络的存在，气体的累积使面团体积膨胀，从而发生面团体积变化,产二氧化碳(CO2)的能力越高这说明发酵能力也越高，产二氧化碳(CO2)能力和发酵能力成正比，从表8的结果来看24M的发酵能力和产二氧化碳(CO2)能力比常见的酵母高，结果如表8所示，：
表8：24M和常见的菌株之间的发酵性能检测比较
发酵时间（min） 30 60 90 120
24M(ml) 57ml 105ml 113ml 119ml
Pakmaya 酵母P4(ml) 13ml 45ml 75ml 90ml
1.3馕面团优质酵母对面团醒发时间的影响：搓圆是将不规则的小面块搓成圆形，排除部分二氧化碳，使其结构均匀，心子结实，表面光滑。手工搓圆要领是掌心向下，五指握住面团，在面案上顺一方向旋转并向下轻压，将面团搓成圆球形。
静置赤称醒发，目的是使面筋恢复弹性，使酵母适应新的环境恢复活力，使馕饼外形端正，表面光滑，温度为27℃-29℃相对湿度75％。通过观察醒发结果发现我们所选的编号为24M的菌株醒发时间最短，醒发时间为18min，见表9。
表9：24M和常见的菌株之间的醒发时间检测比较
菌株名称 醒发时间（min）
酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M） 18
常见酵母Pakmaya 酵母P4 35
实施例五：酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）CCTCC NO：M 2014415的馕饼口感测试。
（1）馕面团的配方：此配方属于新疆普遍采用的制馕配方，属公知技术领域：面粉800g，酵母菌 4g，加碘精制盐 10g，消毒纯牛奶 100g，水(30℃)250ml。
（2）馕制作按照常见的方式制作，按照成品的重量要求，将面团短时间内分块和称重，搓面和静置-手工搓圆要领是掌心向下，五指握住面团，在面案上顺一方向旋转并向下轻压，将面团搓成圆球形。在27-29℃进行静置赤称醒发；馕坑的温度调到150℃，进行打馕。
（3）观察馕面团的发酵速度和馕饼的风味。
表10：24M的馕饼口感测试结果
(4)24M的馕饼总的质量指标
感官指标：色泽：肉馕表面金黄色，色泽均匀一致，四周下边为棕红色；组织形态：皮薄，分层，软硬适中；外形完整，丰满；口感及风味：香甜脆嫩，鲜香不腻，清香宜人、可口，无异味。
微生物指标：菌落总数个／g≤1000；大肠杆菌MPN／1009≤30；致病菌未检出；铅(以铅计，n∥kg)0.2，砷(以砷计In∥kg)≤0.2。
根据以上的结果进行分析：馕面团酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M） CCTCC NO.M2014415发酵速度最快，使馕风味也最佳，做出来的馕饼表皮光滑、没有起皱，口感香甜，松软，爽口、不黏牙，软硬适中；外形完整，丰满．香甜脆嫩，鲜香不腻，清香宜人，没有酸味或没有异味等特点，完全符合感官指标和微生物指标的要求,非常适合新疆各民族人民的口味。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆大学
<120> 一种新疆地方特色馕面团优质酵母及其在制馕中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 1436
<212> DNA（26rDNA）
<213> 酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae 24M）
<400> 1
aggaaaagaa acccaccggg attgccttag taacggcgag tgaagcggca aaagctcaaa 60
tttgaaattt ggtaccttcg gtgcccgagt tgtaatttgg agagggcaac tttggggccg 120
ttccttgttt atgttccttg gaacaggacg tcatagaggg tgagaatccc gtgtggcgag 180
gagtgcggtt ttttgtaaag tgccttcgaa gagtcgagtt gtttgggaat gcagctctaa 240
gtgggtggta aattccatct aaagctaaat attggcgaga gaccgatagc gaacaagtac 300
agtgatggaa agatgaaaag aactttgaaa agagagtgaa aaagtacgtg aaattgttga 360
aagggaaggg catttgatca gacatggtgt tttgtgccct ttgctccttg tgggtagggg 420
aatctcgcat ttccctgggc cagcatcagt tttggtggca ggataaatcc ataggaatgt 480
agcttgcctc ggtaagtatt atagcctgtg ggaatactgc cagctgggac tgaggactgc 540
gacgtaagtc aaggatgctg gcataatggt tatatgccgc ccgtcttga 589

Claims (2)

1.一种酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）,其特征在于，所述的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）保藏编号为CCTCC No：M 2014415。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）在馕饼面团发酵中的应用，其特征在于，所述的酿酒酵母24M（Saccharomyces cerevisiae24M）CCTCC No：M2014415用于馕饼面团发酵中的应用。
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