CN101624573B - 一种酿造石榴酒的酵母菌及发酵生产制备的石榴酒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产石榴酒的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3027和利用此菌株发酵酿造的石榴酒。本发明通过不同途径分离纯化多株酵母菌，通过酒精、SO₂、高低温、高糖耐受力试验及杏酒发酵试验，筛选出酿酒性能优良的石榴酒酵母菌，并且确立了石榴酒发酵工艺，经主发酵25℃密闭发酵，后发酵控制温度为18～22℃，酿造出了色泽为鲜红色，澄清透明，具有典型的石榴果香气，酒精度以V/V计为6.6％-9.7％，总糖为180g/L，总酸为4g/L，有良好的醇香；酒体丰满、细腻柔和、协调性好、酸度适中，广泛应用于石榴酒工业生产领域。

Description

一种酿造石榴酒的酵母菌及发酵生产制备的石榴酒

发明领域

本发明涉及微生物及发酵工业领域。具体的说，本发明涉及一种石榴酒酿造的酵母菌、制备方法及其获得的石榴酒。

背景技术

石榴(Punica granatum L.)，属石榴科，石榴属，落叶灌木或小乔木，又名若榴、丹若、沃丹、天浆、金罂，新疆维吾尔语称阿娜尔，原产于伊朗和阿富汗等中亚地区，汉朝时经丝绸之路传入中国。石榴树和果实具有较高的药用价值，医学界用石榴果实治疗肝病、高血压、动脉硬化等。石榴汁有效预防和治疗动脉粥样硬化引发的心脏病，对防治乳腺癌有特效。《本草纲目》和《食疗本草》记载：“榴者，天浆也，止泻、化淤、清渴、祛火。”石榴汁含有的多种氨基酸和微量元素能有助消化、抗胃酸过多、抗胃溃疡、软化血管、降血脂和血糖，降低胆固醇等多种功能，能生津、化食、健脾、益胃，食后可开胃、滋阴、平肝、补肾、明目。

近年来，石榴产量迅速增加，大量的鲜果单靠通过贮藏延长供应时间来推动石榴产业化发展仍然很困难，因此其深加工的问题亦就日益突出。而利用石榴酿酒是石榴深加工的一个方向.石榴果酒的酒精度低，营养丰富，含有多种有利于人体健康的天然成分，且同时又富有佳酿特有的风味，因而受到消费者喜爱。石榴酒酿造是以石榴果品为原料，通过酵母菌株的生理代谢作用，生成石榴果酒，因而菌种性能的好坏直接影响到果酒的质量。目前石榴果酒生产上常用的酵母菌多为活性干酵母，一些厂家还选用葡萄酒酿造酵母或购买其它商业菌株来进行石榴果酒的酿制，这使石榴酒在感官质量上存在某些缺陷。目前尚无专门适宜石榴果酒酿制的酵母菌种，关于筛选适宜酿制石榴果酒的菌种的研究尚未见报道。因此，分离筛选酿制石榴果酒的优良酵母菌种，不仅可提高石榴果酒的产品质量，扩大石榴果酒的生产，而且对于开发和利用丰富的微生物资源具有重要意义。

目前，大多数厂家选用安琪活性干酵母或购买其他商业菌株来进行石榴果酒的酿制。但由于活性干酵母在生产上多经好氧培养，因其厌氧发酵性能、低温发酵性能及耐乙醇性能等较差，因而生产的石榴果酒颜色过深、或过氧化味较浓、风味平淡、缺乏香气，口感很差，在感官质量上存在缺陷。而在国外，果酒的酿造大多使用企业实验室自己分离筛选保藏的菌种，这些菌种都是由自然界基质中分离得到的，对每种水果都有较强的针对性，因此所酿果酒香气浓郁，非常典型，能反映水果自身的特点。目前国内，人们已对苹果、柿子、梨、桃、桑葚、木瓜、杏、枸杞、红枣等多种果品酿酒进行了相应的研究和探索，对石榴果酒的研究也有若干报道，但多为酿造工艺的探讨，关于石榴果酒专用酵母的分离筛选及应用研究尚未见报道。

发明内容

针对目前没有发酵性能优良、耐受性好的石榴酒专用菌种，现有石榴果酒生产多用酵母菌为活性干酵母、葡萄酒酿造酵母或购买其它商业菌株来进行石榴果酒的酿制，这使石榴酒在感官质量上存在某些缺陷。使用活性干酵母在生产上多经好氧培养，因其厌氧发酵性能、低温发酵性能及耐乙醇性能等较差，因而生产的石榴果酒颜色过深、或过氧化味较浓、风味平淡、缺乏香气，口感很差，在感官质量上存在缺陷。而果酒的酿造大多使用自己筛选菌种，这些菌种都是由自然界基质中分离得到的，对每种水果都有较强的针对性，因此现有酿石榴菌种、工艺及获得石榴酒典型性都未能反映石榴自身的特点。

本发明石榴果酒酿造是以石榴果品为原料，提供了一种耐受性好，发酵性能优良的酿造石榴酒的酵母菌种，通过添加提供保藏酵母菌株的生理代谢作用发酵产生以乙醇和二氧化碳为主、以酯类、酸类等次级代谢产物为辅的代谢产物，制备获得的石榴酒果香良好，酒体统一、入口细腻柔和，回味深长。

本发明通过以不同的培养温度、pH值、培养基、酒精浓度为富集条件，从新疆喀什市周边城市石榴园中取样，以石榴树叶、新鲜石榴果皮、烂石榴果皮及石榴园土壤为分离源，从中共分离得到71株酵母菌，以各菌株起酵和发酵能力、产酒精能力、不同的SO₂浓度、酒精浓度为筛选条件，经过三级筛选，结合感官评定，获得多株适宜石榴酒酿造的酵母菌，其中编号为SL20经鉴定为酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株确定的发酵工艺能生产优良的石榴酒。

本发明具体提供了一种耐受性好，发酵性能优良的酵母菌种，命名为SL20，参照Barnett等编著的《酵母菌：特征与鉴定》对SL20菌株进行形态学，生理生化鉴定。SL20菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2009年4月16日，保藏号是CGMCC No.3027。经微生物学鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。该酵母菌细胞呈椭圆形，三角瓶壁无膜或蹼，细胞大小为(3.02～7.05)×(1.66～3.17)μm，无性繁殖方式是一端出芽。在PDA固体培养基上生长的菌落为乳白色，奶油状，表面平滑，边缘整齐。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上培养，形成假菌丝。在生孢培养基上30℃培养2周后，有子囊孢子形成，每个子囊有1～2个子囊孢子，孢子呈圆形。

该菌株为酵母属中的成员，通过API20CAUX菌种鉴定系统，表明本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3027为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。该酵母营专性或兼性好氧生活，在缺乏氧气时，通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量。能发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、棉子糖、蜜二糖，不能发酵乳糖。

本发明提供的培养基：

1、酵母菌分离培养基：PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂15～20g)、YPD(葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸膏10g，水1000mL)；分离出的菌种保存在PDA培养基试管斜面上，4℃恒温保存，一个月转接一次。

2、酵母菌筛选培养基：PDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)、石榴汁。

3、酵母菌鉴定培养基采用本领域熟知的培养基，其配方及其配制参考《Theyeasts：a taxonomic study》和《常见与常用真菌》。

A.PDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)。

B.玉米粉琼脂培养基：将12.5g黄玉米粉溶于300mL水中，搅匀，以60℃热水预保温1小时，用滤纸过滤，滤液加水至300mL，加琼脂3.8g。该培养基于121℃灭菌15分钟，趁热用脱脂棉过滤，然后在112℃灭菌15分钟。

C.麦氏培养基(产子囊孢子培养基)：葡萄糖1g，KCL 1.8g，酵母浸膏2.5g，醋酸钠8.2g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，113℃灭菌20分钟。

同时，在本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3027菌株的基础上，本发明提供了一种石榴酒的生产制备工艺，其制备方法采用本领域熟知的发酵工艺，本发明提供具体步骤如下：

1、原料选择：选择的鲜果要求完全成熟，颜色鲜红，无霉烂。

2、人工去皮：石榴皮含有大量的单宁，如不将其除去而混入发酵罐中，会使发酵罐中单宁的浓度过高，从而阻碍酵母发酵。石榴皮皮质坚硬，且有内膜，籽粒易破碎，故难以用机械去皮，一般用手工去皮。

3、压榨取汁：采用气囊式压榨机，这样可避免将内核压破，因内核中含有脂肪、树脂、挥发酸等物质会影响石榴酒的风味。

4、成分调整：加蔗糖调整总糖含量为180g/L，以柠檬酸调整总酸含量为4g/L

5、澄清杀菌：石榴汁在发酵前应进行澄清和杀菌处理。澄清剂可用果胶酶，加入量为石榴汁的0.1％，并用SO₂杀菌，一般用量为100mg/L。

6、主发酵：按1％的接种量将酵母菌活化液加入澄清石榴汁中，加发酵栓、25℃密闭发酵，每24h测定一次总糖、总酸、酒精度、酵母数，总糖降到5g/L以下时主发酵结束。

7、后发酵：后发酵需要在较低的温度下进行，将发酵容器置入恒温培养箱中，控制温度为18～22℃，需20～25d。在发酵结束后，及时分离酒脚。

8、后处理：后发酵结束后，要进行过滤，以除去酒中的沉淀和杂质，保证成品酒的质量。可采用小型硅藻土过滤机过滤，也可在果酒中加入硅藻土后进行真空抽滤。过滤后的果酒要求外观澄清透明，无悬浮物质，无沉淀。澄清的酒液尚需调配达到一定的质量指标后进行灌装、压盖，然后采用水浴加热杀菌。杀菌方法为：将酒瓶置于水浴中，缓慢升温至78℃，并保持25min，然后分段迅速冷却至室温，即为成品。

本发明还进一步提供了利用菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3027采用本领域熟知的酿造工艺得到的石榴酒，具备优良品质的石榴酒产品，获得的石榴酒是一种具备石榴典型性和石榴酒典型性的混合物：理化指标：

酒精度：6.6％-9.7％(V/V)

总糖：180g/L

总酸：4g/L

感官指标：

色泽：鲜红色，澄清透明

气味：具有典型的石榴果香气，有良好的醇香

口感：酒体丰满、细腻柔和、协调性好、酸度适中、具有石榴酒的典型性。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，达到以下有益效果：

A：获得了一株发酵性能良好，耐受性好的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No.3027。接种量在1％，25℃发酵时，在糖份等营养成分充足的情况下，酿造的石榴酒酒精度可达6.6％-9.7％(V/V)，并且石榴酒的感官评价非常出色；本发明选用菌株的低温(25℃)发酵性能优于安琪酵母；其中在25℃时的发酵周期比对照菌株少24h，酒精度达到9.7％(v/v，20℃)，并且所酿造的石榴酒香味浓郁纯正。同时，该菌株表现出了优良的耐SO₂性能(100mg/L～150mg/L)。经感官评定，选用酵母菌所酿造的石榴酒明显优于安琪活性干酵母所酿的石榴酒。最终确定石榴酒适宜的发酵温度为25℃、SO₂添加量为100mg/L。弥补了目前石榴酒专用酵母缺乏的现状。

B：本发明将选用的菌株与安琪活性干酵母在等同条件下酿造的石榴酒和市售石榴酒进行感官评定，并对选用菌株与安琪酵母酿制的石榴酒进行香气成分的测定。感官评定结果如下：本发明酿造的石榴酒样品，色泽鲜红，果香良好，酒体统一、细腻柔和，具备石榴酒的典型性；安琪酵母酿造的酒闻香具异香，口感欠统一，酒质差，酸涩味较重，市售的石榴酒，酒体氧化，酒精味较浓，涩味较突出，入口后余香味不柔和。经气质联用仪的色谱分析结果表明：本发明提供的菌株所酿造的石榴酒所含的四种主要酯类(甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯)的含量均高于安琪酵母所酿造的石榴酒含酯量。

附图说明

图1为25℃时酵母降糖的变化曲线。

图2为25℃时酵母产酒精的变化曲线。

图3为25℃时酵母产酸量的变化曲线。

图4为25℃时酵母细胞数的变化曲线。

图5为SO₂对SL20菌株降糖的影响曲线图。

图6为SO₂对SL20菌株产酒精的影响曲线图。

图7为SO₂对SL20菌株产酸的影响曲线图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指重量百分比。

本发明中主要设备和材料有：

VITEK全自动微生物鉴定仪(法国梅里埃股份有限公司)。PHILIPScomfortHR1727榨汁机(珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司)。Eppendorf Centrifuge5417R离心机(MADE IN GERMANY)。SPX智能型生化培养箱(宁波东南仪器有限公司)。Olympus显微镜。THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器(国华企业CHA-S)。立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。GC2000型气相色谱仪(美国Finnigan公司)。PE Clarus500气质联用仪(美国PerkinElmer公司)。

无水乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)、偏重亚硫酸钾(分析纯，上海试四赫维化工有限公司)、葡萄糖(分析纯，天津市天达净化材料精细化工厂)、酵母浸膏(BR-生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)、琼脂粉、蛋白胨(BR-生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)、果胶酶(上海蓝季科技发展有限公司)、链霉素(上海生工生物工程有限公司)、甲基蓝指示液10g/L、斐林试剂(甲、乙液)、标准NaOH溶液0.05mol/L、酚酞指示液10g/L。

实施例一：酵母菌种的分离、筛选和纯化

1、酵母分离源的采集：

采用随机取样原则采集新疆喀什市周边城市石榴园的新鲜石榴、烂石榴、石榴树叶及其土壤，共采集石榴样品24份，石榴树叶样品12份，石榴园土壤样品8份，分别装入无菌纸袋中，并贮存于4℃冰箱中备用。

2、菌种分离方法：

采用不同的培养基种类、酒精浓度、培养温度、pH值对酵母进行分离，以尽量扩大样本量。富集、分离条件如下：

A.取适量的样品分别加入到已灭菌的分别含3％、6％、9％、12％乙醇的PDA、YPD培养基中，自然pH值，于生化培养箱中30℃培养1～2d。

B.取适量的样品分别加入到已灭菌的pH分别为3.0、5.0、7.0的PDA、YPD培养基中，于生化培养箱中30℃培养1～2d。

C.取适量的样品分别加入到已灭菌的PDA、YPD培养基中，自然pH值，分别于30℃、37℃条件下生化培养箱中培养1～2d。然后取100μL的菌液转接到PDA固体培养基上进行稀释涂布，30℃培养2～3d，待长出菌落后选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离2～3次，经镜检为纯种后分别转入PDA斜面培养基上，低温保存，菌种以阿拉伯数字依次编号。

从44份新鲜石榴皮、烂石榴皮、石榴树叶和石榴园土壤样品中共分离得到酵母菌71株，分别编号，见表1：

表1酵母菌分离结果

将分离得到的71株酵母菌株根据不同的标准进行以下三级筛选。

3、酵母菌的筛选

(1)酵母菌的一级筛选：采用杜氏管发酵法，在相同的培养条件下，测定酵母菌株产气泡的快慢及在规定时间内产气泡的多少，初步比较各株酵母菌的起酵能力和发酵能力，初筛出发酵性能优良的酵母菌株。实验平行重复三次。

菌株活化条件：28℃于20mLPDA中振荡培养10h。见表2

发酵条件：28℃于5mLPDA中静止发酵48h。

接种量：5mLPDA的1％。

表2酵母菌一级筛选结果

“+”表示产气量为杜氏管的1/3，“++”表示产气量为杜氏管的2/3，“+++”表示产气量为杜氏管满管

在试管中发酵24h，产气量为杜氏管满管的菌株有2株；经36h发酵，产气量为杜氏管满管的菌株有23株，经48h发酵，产气量为杜氏管满管的菌株有16株，共41株酵母菌株，这41株菌株所在的试管中都有酒香生成。保留这41株进行下一步筛选。

(2)酵母菌的二级筛选：采用石榴汁取代PDA发酵，在果胶酶的作用下，石榴打浆取汁，放入三角瓶内，菌种活化后接入三角瓶中进行发酵，7d后采用气相色谱法比较各菌株产酒精能力的大小，进一步确定实验菌株的发酵能力。实验平行重复三次。见表3

菌株活化条件：28℃于20mLPDA中振荡培养10h。

发酵条件：28℃于50mL石榴汁中静止发酵7d。

接种量：石榴汁的1％。

表3酵母菌二级筛选结果

初筛的41株菌经小瓶石榴汁(100mL)培养6d后，取发酵液1mL，用气相色谱仪进行酒精度的测定，酒精度在5％～6％(v/v)的有1株菌、在6％～7％(v/v)的有3株菌、在7％(v/v)以上的有7株菌。酒精度在6％(v/v)以上的共10株，保留进入下一步筛选。

(3)酵母菌的三级筛选：采用杜氏管发酵法，将酵母菌分别接入含不同乙醇浓度(8％、10％、12％、14％、16％、18％)和不同SO₂浓度(60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L)的PDA中，在相同的条件下进行培养，观察杜氏管的气泡产生情况，比较各酵母菌株对乙醇和SO₂的耐受程度，进一步确定适合石榴酒酿造的菌株。实验平行重复三次。

菌株活化条件：28℃于20mLPDA中振荡培养10h。

发酵条件：28℃于5mLPDA中静止发酵96h。

接种量：5mLPDA的1％。见表4、5

表4酵母菌在不同乙醇浓度情况下三级筛选结果

表5酵母菌在不同SO₂浓度下三级筛选结果

10株酵母菌分别在含不同乙醇浓度(8％、10％、12％、14％、16％、18％)(表4)和不同SO₂浓度(60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L)(表5)的PDA中进行培养，比较10株菌对乙醇和SO₂的耐受程度，最终18号、20号菌株，在乙醇浓度分别为8％、10％、12％(v/v)时，在两天内均产气，SO₂浓度在160～180mg/L时，在两天内均产气，并且两株菌七天内发酵酒精度分别为7.2％、7.1％(v/v)，发酵液香气浓郁，因而将保留菌株SL18和SL20，进行下一步的鉴定。

实施例二：酵母菌种的鉴定

1、酵母菌的形态学鉴定

A.形态和培养特征：

将菌种接种到PDA液体培养基中，28℃培养3～7d，观察是否发酵、培养液是否混浊，是否形成环或岛，沉淀量多少及松紧状况，并染色于显微镜下观察，记录酵母的无性繁殖方式与细胞的形状，以目镜测微尺测其营养细胞大小，将酵母在PDA固体培养基上划线，30℃培养2～3d，观察其菌落形态：

SL20菌株在PDA液体培养基中培养3～7d，细胞呈椭圆形，三角瓶壁无膜或蹼，细胞大小为(3.02～7.05)×(1.66～3.17)μm，无性繁殖方式是一端出芽。在PDA固体培养基上生长的菌落为乳白色，奶油状，表面平滑，边缘整齐。

B.酵母假菌丝的观察：菌株于30℃活化后，在玉米粉琼脂培养基平板上划线接种(每个平板2～3条)，在菌线上盖上无菌盖玻片，30℃培养5～10d。

C.酵母子囊孢子的观察：

菌株在PDA固体培养基上30℃重新培养1～2d，进行活化。将活化好的酵母在产子囊孢子培养基上划线，30℃培养1～2周，镜检是否有子囊孢子，每个子囊孢子的数目，孢子的颜色。

SL20在加盖片的玉米粉琼脂培养基上培养，形成假菌丝。在生孢培养基上30℃培养2周后，有子囊孢子形成，每个子囊有1～2个子囊孢子，孢子呈圆形。

2、生理生化鉴定：

利用VITEK全自动微生物鉴定仪进行包括发酵糖类试验、同化碳源试验、同化氮源(硝酸钾、乙胺、尸胺)试验、生成类淀粉化合物试验、无维生素生长测试、50％(w/w)葡萄糖-酵母膏中生长测试和1000mg/L放线菌酮抗性试验等七项生理生化检测。见下表6

表6：API生化鉴定反应

测试项目	对比菌株SL18	SL20
			半乳糖(GAL)	+	+
乳糖(LAC)	-	-
			蔗糖(SUC)	+	+
麦芽糖(MLT)	-	-
			纤维二糖(CEL)	-	-
甲基葡萄糖甙(AMG)	+	+
			木糖(XYL)	-	-
阿拉伯糖(ARA)	-	-
			海藻糖(TRE)	-	-
松三糖(MLZ)	-	-
			棉子糖(RAF)	+	+
N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)	-	-
			木糖醇(XLT)	-	-

卫矛醇(DUL)	-	-
			侧金盏花醇(ADO)	-	-
古老糖(PAL)	-	-
			丙三醇(GLY)	-	-
山梨醇(SOR)	-	-
			赤鲜醇(ERY)	-	-
蜜二糖(MEL)	-	+
			环乙糖胺(CYC)	-	-
葡萄糖(GLU)	+	+
			肌醇(INO)	-	-
硝酸盐(NIT)	-	-
			酮基葡萄糖(2KD)	-	-
尿素(URE)	-	-

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

根据以上表6鉴定结果，本发明提供的SL20和对比菌株SL18均为酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

以不同的培养温度、pH值、培养基、酒精浓度为富集条件，以石榴树叶、新鲜石榴果皮、烂石榴果皮及石榴园土壤为分离源，从中共分离得到71株酵母菌，以各菌株起酵和发酵能力、产酒精能力、不同的SO₂浓度、酒精浓度为筛选条件，经过三级筛选，结合感官评定，获得最适宜石榴酒酿造的酵母菌编号为SL20经鉴定为酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

实施例三：酵母菌种的基本酿酒性能试验

1、不同温度条件下自选酵母的发酵特性(以安琪酵母为对照)：

将筛选出的酵母菌株分别在20℃、25℃和30℃三个温度下进行石榴酒发酵，同时以安琪活性干酵母为对照菌株，各重复三次。参见附图1-4。

菌株活化：酵母先在50mL PDA液体培养基中振荡培养10h，然后转入50mL含有10°Brix石榴汁的三角瓶中继续扩大培养10h。安琪活性干酵母按要求于2％糖水中在35℃条件下复水活化，然后转入50mL含有10°Brix石榴汁的三角瓶中继续扩大培养10h。

接种量：石榴汁的1％。

石榴汁的处理：对石榴汁进行杀菌(SO₂的添加量为100mg/L，相当于偏重亚硫酸钾添加量为200mg/L)，同时加入果胶酶，加入量为石榴汁的0.1％。

石榴汁糖酸调整：加蔗糖调整总糖含量为180g/L，以柠檬酸调整总酸含量为4g/L

总糖、还原糖、总酸等指标按GB/15038-1994葡萄酒、果酒通用试验方法进行测定。测酒精度使用气相色谱仪，其条件如下：

色谱仪：GC-2000型气相色谱仪

编号：NYS002

色谱柱：FFAP(30m×0.32mm×0.25μm)

检测器：FID

进样口温度：250℃

检测器温度：200℃

柱温：采用程序升温至60℃，保持2min，然后以10℃/min的速度升至100℃，保持2min。

载气：N2流量5ml/min

分流比：10∶1

进样量：1μL

表7温度对酵母发酵性能的影响结果

由表7可知，温度对酵母发酵性能影响较大，随发酵温度的升高，3株酵母的起酵时间和发酵周期依次缩短。SL20菌株在25℃时的发酵周期比对照菌株和SL18少一天，酒精度达到6.6-9.7％(v/v，20℃)，并且酵母凝集性好，经感官评定，SL20所酿造的石榴酒果香味浓郁、口感醇厚，酒体统一、柔和，具备石榴酒的典型性，而SL18在25℃时虽然发酵周期与对照菌株相同，但所酿造的石榴酒香味和口感比对照菌株要浓郁纯正，说明自选菌株SL20和SL18的低温(25℃)发酵性能优于安琪酵母；30℃时，3株菌起酵速度都比较快，SL20和SL18的发酵周期比对照菌株少一天，SL20菌株的酒精度高于SL18和对照菌株，为10.1％(v/v)，但3株菌发酵的石榴酒香味没有20℃和25℃浓郁。同时，不同温度下发酵，主酵结束时酒液中总糖含量、总酸含量和挥发酸含量各不相同但相差不大，自选菌株和安琪酵母在3个温度下主酵结束时发酵液残糖量均小于5g/L，挥发酸的含量均小于1g/L。

2、不同SO₂条件下自选酵母的发酵特性(以安琪酵母为对照)

将筛选出来的酵母菌株分别于50mg/L、100mg/L和150mg/L三个二氧化硫浓度条件下进行石榴酒发酵，发酵温度为28℃。其中酵母的活化、接种量、石榴汁糖酸调整以及所需测试项目与不同温度条件下酵母的活化、接种量、石榴汁糖酸调整以及所需测试项目相同。各重复三次。参见附图5-7

随着二氧化硫浓度升高，3菌株的起酵速度减慢，发酵周期延长，当二氧化硫浓度为50mg/L时，SL18、SL20和安琪酵母的发酵周期均为9天；二氧化硫浓度为100mg/L时，SL18、SL20和安琪酵母的发酵周期分别为7天、10天和10天；当二氧化硫浓度为150mg/L时，SL18、SL20和安琪酵母的发酵周期分别为9天、10天和10天；发酵液中二氧化硫浓度不同，各菌株降糖及产酒精性能也不相同，当二氧化硫浓度较低时，3株菌发酵初期即开始降糖，发酵液中酒精含量迅速增加，其中自选菌株酒精含量增加速度快于安琪酵母；随着二氧化硫浓度的升高，3株菌降糖速率略有下降，相应的酒精含量增加也趋于缓慢；同时还可看出，添加二氧化硫后，发酵前期降糖慢，中期快，后期慢，这主要是由于二氧化硫的添加抑制了酵母的生长与繁殖，使得发酵前期对糖的利用较慢，当酵母度过适应期后，代谢旺盛，降糖速度加快；发酵后期由于酒精的抑制作用以及发酵液中营养成分的减少，使酵母发酵速度又有所下降。但总体上SO2浓度的增加对酵母降糖和产酒精影响不是很明显。

在向发酵液中添加二氧化硫，对发酵液具有增酸作用。当二氧化硫浓度为50mg/L时，SL18菌株、SL20菌株和安琪酵母发酵液最终酸度分别为5.10g/L、5.16g/L和5.12g/L；当浓度为100mg/L时，其最终酸度分别为5.18g/L、5.28g/L和5.28g/L；当浓度为150mg/L时，酸度分别为5.32g/L、5.36g/L和5.34g/L。但添加二氧化硫对发酵液中最终酸度的影响不是很大。从上述数据也可看出，在同一个二氧化硫浓度下，SL20株菌的产酸量稍多一些。

实施例四：石榴酒的感官评定

根据自选酵母发酵性能测试结果，确定石榴酒发酵温度为25℃，SO₂添加量是100mg/L，果胶酶添加量为石榴汁的0.1％，石榴汁糖酸调整为：加蔗糖调整总糖含量为180g/L，以柠檬酸调整总酸含量为4g/L，接种量为：石榴汁的1％。以此条件进行石榴酒的发酵并对酿造的石榴酒进行感官评定和香气成分测定。

1、分析型感官评定

邀请酿酒专家对自选酵母所酿石榴酒、安琪活性干酵母所酿石榴酒及市售石榴酒进行感官评定，评定项目有色泽、香气、滋味和典型性：

A.本发明提供的SL20酿造的石榴酒样品，色泽鲜红，果香良好，酒体统一、细腻柔和，具备石榴酒的典型性。

B.对照菌株酿造的石榴酒样品的色泽、果香与SL20雷同，酒味与SL20相比稍差，酸味略突出。

C.安琪酵母酿造的酒闻香具异香，口感欠统一，酒质差，酸涩味较重。

D.市场上随机抽样的石榴酒，酒体氧化，酒精味较浓，涩味较突出，入口后余香味不柔和。

2、嗜好型感官评定

选取10名评审员，按照顺序法(ranking method)对上述石榴酒进行嗜好型感官评定。按以下样式的问答卷，对4个样品排出自己喜欢的顺序。试验代号采用随机的2位数字，供试条件相同。为了消除品尝顺序带来的影响，品尝时采用随机摆放方法。

采用嗜好性感官评定，由10名评审员参加，指出产品美味的顺序，结果见表8、9

石榴酒样品：

A：酵母菌SL18酿制的石榴酒        B：酵母菌SL20酿制的石榴酒

C：安琪酵母酿制的石榴酒          D：市售的石榴酒

表8四种石榴酒嗜好型感官评定

对m(样品数)＝4，n(评审员人数)＝10，结果如表9：

由于S_imin＝14，S_imax＝36，所以在信度为1％时，4个石榴酒样品的美味之间存在差异。对于自选酵母SL18所酿制的石榴酒A，S_i＝16，说明在信度为1％时，A与其他三个石榴酒样品之间存在差异；对于自选酵母SL20所酿制的石榴酒B，S_i＝14，说明在为1％时，B与其他三个石榴酒样品之间存在差异。总之，从总排名上看，选自本发明菌株所酿制的石榴酒在嗜好性方面均优于对照菌株所酿造的石榴酒、安琪酵母酿造的石榴酒和市售的石榴酒。

由感官评定可知，菌种SL20发酵的石榴酒色泽鲜红、果香良好，酒体统一、细腻柔和，具备石榴酒的典型性；产生的酒精度最高为9.7％(V/V)。

采用气质联用仪对石榴酒中四种主要酯类(甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯)进行了测定，结果见表10。

表10石榴酒中的酯类物质含量

从表10可以看出，对照菌株和本发明SL20所酿的石榴酒中，甲酸乙酯和乙酸乙酯的含量明显高于安琪酵母所酿制的石榴酒。这与感官评定的结果相符。

Claims (1)

1.一种酿造制备石榴酒的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3027。

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