CN103205369A

CN103205369A - 一株具有降解l-苹果酸性能的酿酒酵母新菌株及其应用

Info

Publication number: CN103205369A
Application number: CN2013100981084A
Authority: CN
Inventors: 王英; 周剑忠; 黄开红; 刘小莉; 马艳弘; 李莹; 仇小妹
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: CN103205369B

Abstract

本发明涉及一株具有降解L-苹果酸性能的酿酒酵母新菌株及其应用，属于生物工程技术领域。从黑莓自然发酵果酒中分离、筛选到1株具有降解L-苹果酸性能的酿酒酵母新菌株，经⁶⁰Co进行辐照诱变，选育出一株降L-苹果酸能力增加的突变株，命名为FM-S-115，经鉴定为酿酒酵母，FM-S-115不仅具有优良的酒精发酵能力，而且具有较强的降解果酒中L-苹果酸的能力。该菌株于2012年10月18在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCC NO.6680，本发明的酿酒酵母FM-S-115对降低果酒中刺激性酸含量，提高果酒品质，增加果酒的市场占有率具有很大的作用。

Description

一株具有降解L-苹果酸性能的酿酒酵母新菌株及其应用

一、技术领域

本发明涉及一株具有降解L-苹果酸性能的酿酒酵母新菌株及其应用，属于生物工程技术领域。

二、背景技术

果酒在发酵酿制的过程中使用的菌种多为葡萄酒酿酒酵母，但不同水果之间成分差别大，用葡萄酒酵母酿造不能更好的突出各种水果的特有的香气。因此选育发酵性能优良的适合特定水果发酵的酵母是目前果酒酿造的研究热点。

果酒中有机酸含量是决定果酒质量的一个重要因素，是果酒的重要风味物质之一，对果酒的感官质量起到很重要的作用，适量的有机酸能使果酒醇厚且爽口，同时能够平衡果酒中的苦味，并且能够抑制细菌活动，但过高的有机酸含量能够造成酒味过酸，酒体粗糙，难以入口，并还会造成酒液失光浑浊。果酒中有机酸主要包括酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸等。其中L-酒石酸和L-苹果酸的含量占总有机酸的70-90%。苹果酸不仅影响果酒的酸味，并且作为乳酸菌可以利用的底物导致果酒装瓶后的二次发酵，最终导致酒的腐败变质，因此去除果酒中过多的L-苹果酸是确保果酒的物理、生物化学、微生物稳定及质量稳定的一个重要措施。

目前果酒的降酸方法主要包括物理降酸、化学降酸和生物降酸三种方法，化学方法和物理方法都会过多的去除酒石酸，降低果酒的感官质量，并且都需要耗费大量的能源和辅料且不能对影响果酒风味的有机酸尤其是苹果酸起作用。因此近年来比较流行用生物降酸法进行果酒降酸处理。

生物降酸主要利用的微生物有乳酸菌和酵母菌两类，乳酸菌是在酒精发酵结束后通过苹果酸-乳酸发酵(Malolactic Fermentation，MLF)途径来分解苹果酸，产生乳酸和CO₂，但其存在耗时过长、过程不易控制等缺点。栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）降酸效果最好，通过苹果酸-乙醇发酵(maloethanolic fermentation，MEF)途径将苹果酸分解为乙醇和CO₂，从而达到降酸的目的，但栗酒裂殖酵母存在酿造性能力并不尽如人意，并且会产生一些使果酒呈现不好风味的物质，因此限制了其应用。具有降酸功能并具有优良的酒精发酵性能的菌株的筛选及开发利用是果酒酿造业中的一个亟待解决的问题。

三、发明内容

技术问题 针对发酵果酒中存在过酸的问题和缺陷，本发明提供一株具有优良发酵性能并能有效降低果酒中L-苹果酸的菌株FM-S-115及其用法，用于黑莓、蓝莓果酒的发酵生产，为解决发酵果酒中酸度过大问题提供新的菌种资源和方法。

技术方案本发明涉及一株具有降解L-苹果酸性能的酿酒酵母新菌株及其应用，其内容和实施方案如下：

在对黑莓自然发酵果酒的研究中分离、筛选到1株具有降解L-苹果酸性能的酿酒酵母新菌株，经⁶⁰Co进行辐照诱变，选育出一株降L-苹果酸能力增加的突变株，命名为FM-S-115，经鉴定为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），FM-S-115不仅具有优良的酒精发酵能力，而且具有较强的降解果酒中L-苹果酸的能力。该菌的主要生物学特性为单细胞，球形或椭圆形，大小3~8μm；多边或单边出芽，产生子囊孢子，每个子囊中含1-4个球形子囊孢子，能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖，不能发酵乳糖、半乳糖，不利用硝酸盐、盐酸乙胺。该菌株于2012年10月18在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏号是CGMCCNO6680。

本发明菌株FM-S-115能有效降低黑莓和蓝莓果酒中刺激性酸L-苹果酸的含量，提高果酒品质和稳定性。

有益效果

本发明针对黑莓、蓝莓等水果酿制的果酒因有机酸含量高，特别是L-苹果酸含量的过高造成的酒味过酸、酒体粗糙、难以入口、酒液失光浑浊等问题而限制了黑莓、蓝莓等水果酿造业的发展；并进而影响黑莓、蓝莓等种植和加工产业发展的现实，从黑莓自然发酵果酒分离筛具有降酸功能的并且具有优良的酿造性能的菌株，并提供该菌株的果酒酿造方法及工艺，用于黑莓、蓝莓水果的果酒酿造的生产，从根本上解决因黑莓、蓝莓果酒的过酸问题而造成的果酒加工业的发展滞后的现状。本发明的酿酒酵母FM-S-115除具有良好的降酸能力外，还具有较优的酒精发酵能力，利用该菌株进行黑莓、蓝莓果酒的酿造，能有效的降低黑莓、蓝莓果酒中的苹果酸、草酸的含量，使果酒的口感柔和、协调，为提高黑莓和蓝莓的果酒品质提供的可靠地菌种资源。从而加速黑莓果酒酿造业的发展，增加黑莓和蓝莓果酒的市场占有率具有很大的作用。

本发明的主要优点和积极效果如下：

1. 酿酒酵母FM-S-115分离自自然发酵的黑莓果酒中，具有优良的酒精发酵性能，适用于黑莓、蓝莓等高酸性的果酒的酿造，具有优良的酒精发酵性能，果酒的残糖量低于0.38%。用该菌进行黑莓果酒的酿造能有效突出黑莓果酒特有的自然风味，解决了目前黑莓果酒发酵缺乏专用菌种的问题。

2．酿酒酵母FM-S-115不仅具有较好的酒精发酵能力，而且具有较强的L-苹果酸降解能力，为果酒的生物降酸提供优良的菌种资源。从而使酿造的果酒口感柔和、协调，为提高果酒品质奠定了菌种基础，同时还解决了黑莓、蓝莓等果酒产业中因过酸而需要进行降酸处理导致果酒产品质量不易控制、产量降低、能源浪费等问题。

四、附图说明

图1 FM-S-115平板菌落形态

图2 FM-S-115菌体形态

五、具体实施方式

1、菌株的筛选

从江苏溧水黑莓基地采摘自然成熟的黑莓鲜果，经过挑选、清洗、打浆后，置5L的发酵罐中室温自然发酵，当有大量气泡并有较浓酒味产生时，取样，将样品用无菌水进行梯度稀释（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6），取后四个梯度样品100 ul均匀涂布至PDA琼脂培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，自来水1000ml，pH自然）上，每个梯度做3个平行，28℃恒温培养36 h，挑选具有典型酵母菌落形态的单菌落在PDA平板上进行划线纯化，传代3-4次，经镜检为纯种后，结合菌落形态，经初筛获得23株酵母菌。初筛菌落经杜氏管发酵实验，获得5株产气能力强且不会在培养液的表面产生膜状物的菌株。将其编号为FM-S-1、FM-S-2、 FM-S-3、 FM-S-4 、FM-S-5。

将上述获得的菌株分别以3%的接种量（菌体含量在1.02×10⁷∽4.01×10⁷cfu/ml）接种至100 mL黑莓汁（总糖含量23%、总SO₂含量120mg/L）25℃发酵14 d，以产酒精能力，残糖含量、降L-苹果酸能力、感官评定为评价指标，筛选出适用于黑莓果酒发酵，且具有降解L-苹果酸能力的酿酒酵母，结果如表1，实验结果显示，FM-S-1具有较好的酒精发酵能力和降L-苹果酸能力。

表1 不同菌株的发酵及降酸效果比较

菌株	PH	酒精度（% ，v/v）	L-苹果酸（g/L）	总糖（%，葡萄糖计）	感官评价
						FM-S-1	3.12	13.5	5.35	0.38	90
FM-S-2	2.93	11.1	8.18	0.98	70
						FM-S-3	2.87	9.8	9.81	1.67	55
FM-S-4	3.01	10.3	7.77	1.23	75
						FM-S-5	2.98.	10.3	8.69	1.33	70

将经上述两个筛选步骤筛选出的的酵母菌FM-S-1接以3%（（菌体含量在1.02×10⁷∽4.01×10⁷cfu/ml）的接种量接种到含不同乙醇体积分数(8%、10％、12％、14％、16％、18％)、不同SO₂质量浓度(80、110、140、170、210、240mg／L)、不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5)、不同糖度 (14、17、21、24、27、30⁰Bx) 的带杜氏小管的PDA液体培养基试管中， 28℃培养5d，观察杜氏管中的气泡产生情况，考察酵母菌株FM-S-1对乙醇、SO₂、pH值和糖度的耐受程度，结果显示，FM-S-1具有较强的耐受果酒酿造的高糖高SO₂含量的环境的能力。在15%酒精体积分数下，起酵能力依然很强；含量为210mg/L SO₂ 的PDA液体培养基中，仍具有较强的产气能力；在糖度低于25 ^oBx糖溶液中能够发酵良好；该菌株具有较好的耐酸性能，在pH 3.0的条件下仍然生长良好。

2、菌株的诱变

为获得降L-苹果酸能力更强的菌株，采用⁶⁰Co对FM-S-1进行诱变，将培养至对数期的FM-S-1接种至酵母生孢培养基上，28℃培养7d，用无菌生理盐水制成孢子悬液，调整孢子浓度为10⁷个/ml，用⁶⁰Co进行辐照诱变，剂量为0.8 kGy。诱变之后的孢子悬液用无菌水稀释不同倍数涂布于固体PDA平板上，避光28℃培养30h，挑选菌落形态正常且大的菌落接种至含4g/L L-苹果酸的PDA液体培养基试管中，28℃下150r/min培养72h，共挑选出1000株突变株，依次编号为FM-S-01～FM-S-1000，以出发菌株FM-S-1为对照，分别对所挑选的突变株进行降苹果酸能力检测，用HPLC方法测定苹果酸含量，获得一株具有高效降解L-苹果酸能力的突变株，编号为FM-S-115，其降酸能力比出发菌株提高20.5%，并对该菌株的遗传稳定做了检测，该株菌具有良好的遗传稳定性。

3、菌株的鉴定

提取FM-S-115的基因组，利用18S rDNA通用引物，以基因组为模版进行PCR扩增，扩增出的产物经纯化后送上海生物工程有限公司进行测序。用Blast搜索程序从GenBank数据库中调出相似性较高的相关菌株的18S rRNA基因序列，经过序列多重比对和系统发育进化分析，发现菌株FM-S-115与酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)序列相似性高达99%，并且系统发育分析结果显示该菌与酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)自然聚为一支，说明该菌株是酿酒酵母属的成员。结合形态及主要生物学特性把菌株FM-S-115鉴定为Saccharomyces cerevisiae。FM-S-115的菌落和菌体形态分别见图1和图2。该菌的主要生物学特性为单细胞，球形或椭圆形，大小3~8μm；多边或单边出芽，产生子囊孢子，每个子囊中含1-4个球形子囊孢子，能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖，不能发酵乳糖、半乳糖，不利用硝酸盐、盐酸乙胺。

4、FM-S-115在黑莓果酒酿造中的应用

将经过挑选和清洗的黑莓鲜果进行打浆，然后加入黑莓质量含量的0.25%果胶酶（济宁和美生物工程有限公司，酶活是35000U/g）和0.25%复合果浆酶（济宁和美生物工程有限公司，酶活是35000U/g）在45℃条件下酶解3-4 h，酶解液过滤后按照SO₂终浓度为100mg/L 的量加入焦亚硫酸钠和15%的蔗糖。

将酿酒酵母FM-S-115接种到种子培养基中(种子发酵培养基的配方：蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，酵母膏10 g， pH 5.5)，28℃ 150rpm 条件下培养到对数后期，4℃ 条件下以5000rpm/min 离心10min，菌体以生理盐水重悬，以1.02×10⁷∽4.01×10⁷cfu/ml 接种量接入到上述黑莓果汁中，同时以商业活性干酵母发酵黑莓汁作为对照，接种活性干酵母的菌含量与FM-S-115的含量相一致，误差控制5%以内。在25±1℃条件下发酵14天。

发酵结束后，对FM-S-115菌株的发酵能力和降L-苹果酸的能力进行考察，结果见表2。从表中可以看出，FM-S-115的发酵性能与商业用活性干酵母的酒精发酵能力相当，发酵结束后，酒精含量比商业用活性干酵母的酒精含量高出0.5%，残糖量低0.9%，有效酸度高0.31，L-苹果酸浓度比商业用活性干酵母发酵的黑莓果酒中L-苹果酸浓度低1.23 g/L,从有效酸度和 L-苹果酸含量可以看出，对FM-S-115能有效改善黑莓果酒的酸度，改善黑莓果酒的口感，感观评定结果也证实了这一点。

表2 FM-S-115和商业活性干酵母的发酵及降酸效果比较

Figure 2013100981084100002DEST_PATH_IMAGE002

5、FM-S-115在蓝莓干红果酒酿造中的应用

将经过挑选和清洗的成熟蓝莓进行打浆，然后加入蓝莓质量的0.25%果胶酶（济宁和美生物工程有限公司，酶活是35000U/g）和0.25%复合果浆酶（济宁和美生物工程有限公司，酶活是35000U/g）在45℃条件下酶解4-5h，酶解液过滤后按照SO₂终浓度为100mg/L 的量加入焦亚硫酸钠和蓝莓质量的16%的蔗糖，获得蓝莓果汁。

将酿酒酵母FM-S-115在种子培养基中，28℃ 150rpm 条件下培养到对数后期，4℃ 条件下以5000rpm/min 离心10min，菌体以生理盐水重悬，以1.02×10⁷∽4.01×10⁷cfu/ml接种量接入到上述蓝莓果汁中，同时以商业活性干酵母发酵上述蓝莓汁作为对照，接入活性干酵母的菌含量与FM-S-115的含量相一致，在25±1℃条件下发酵20天。

发酵结束后，对FM-S-115菌株和商业活性干酵母的发酵能力和降L-苹果酸的能力进行考察。结果见表3，从表中可以看出，FM-S-115的发酵性能与商业用活性干酵母的酒精发酵能力相当，发酵结束后，酒精含量和残糖量都与商业用活性干酵母发酵的蓝莓果酒的酒精含量和残糖量相同，但是，FM-S-115发酵的蓝莓果酒的有效酸度比商业用活性干酵母发酵的蓝莓果酒的有效酸度高出0.3，L-苹果酸浓度比商业用活性干酵母发酵的蓝莓果酒中 L-苹果酸浓度低1.28 g/L,从有效酸度和L-苹果酸含量可以看出， FM-S-115能有效降解L-苹果酸，降低蓝莓果酒的酸度，改善蓝莓果酒的口感。

表3 FM-S-115和商业活性干酵母的发酵及降酸效果比较

Figure 2013100981084100002DEST_PATH_IMAGE004

Claims

1.一株具有降解L-苹果酸特性的发酵新菌株,命名为FM-S-115，经鉴定该菌株为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），该菌株于2012年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCC NO：6680，该菌的主要生物学特性为单细胞，球形或椭圆形，大小3~8μm；多边或单边出芽，产生子囊孢子，每个子囊中含1-4球形子囊孢子，能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖，不能发酵乳糖、半乳糖，不利用硝酸盐、盐酸乙胺。

2.权利要求1所述的发酵新菌株FM-S-115在降解果酒中L-苹果酸的应用。

3.权利要求1所述的发酵新菌株FM-S-115在果酒酿造中的应用，其特征在于：将酿酒酵母FM-S-115在种子发酵培养基中活化后，以1.02×10⁷∽4.01×10⁷cfu/ml接种量接入SO₂浓度在80.00∽145.32mg/L、pH值在2.82∽3.4的黑莓果浆中，在15-25℃条件下发酵8-25天。