CN108774624A

CN108774624A - 菌株及其应用

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Publication number: CN108774624A
Application number: CN201810398722.5A
Authority: CN
Inventors: 刘延琳; 秦义; 宋育阳; 叶冬青; 冯莉; 杜青
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2018-11-09
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108774624B

Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及菌株及其应用。该菌株26s D1‑D2区具有如I、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一项：I、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；Ⅱ、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。实验表明，该菌株具有优良的降解苹果酸的能力和发酵葡萄酒的性能。

Description

菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及菌株及其应用。

背景技术

随着我国人民生活水平的提高，果酒越来越受到消费者的认可。果酒质量受多种因素的影响，其中，酸度是影响果酒质量一个至关重要的因素。适量的酸度可以很好的平衡甜味和苦味，但过量的酸则会形成酒味酸涩、酒体粗糙等现象。

苹果酸(2-羟基丁二酸)是三羧酸循环中的主要中间代谢产物(Etienne et al.,2013；Yoshida et al.,2012)，是二元羧酸，其亦是许多果酒发酵中的主要有机酸，也是果酒降酸处理的关键对象之一。苹果酸作为葡萄中主要的有机酸之一，在葡萄酒的酿造中主要通过苹果酸-乳酸发酵进行降酸，通常情况下是由乳酸菌来完成。然而，在葡萄酒较低的pH下，乳酸菌的生长和发挥作用受到很大的挑战，在高酸的葡萄汁中效果往往不尽人意。例如作为我国主要的野生葡萄品种之一的山葡萄，富含花青素等多种抗氧化物质(Liet al.,2016；Ma et al.,2017)，山葡萄酿造的葡萄酒，香气浓郁，深受消费者的喜爱(Zhao etal.,2016)。但山葡萄酸含量很高，总酸可达20g/L(蒋志东,2009)，容易造成酒体不平衡等缺点，而苹果酸是山葡萄最主要的有机酸之一，也是酿造工艺中的关键控制点。因此，降酸技术的研究是保证山葡萄酒品质的重要方法之一。王立芳(2011)筛选出一株既能降解苹果酸又能降解柠檬酸的酵母菌，鉴定为陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)，但其发酵特性尚未见相关报导。

医学研究表明：葡萄的营养很高，而以葡萄为原料的葡萄酒也蕴藏了多种氨基酸、矿物质和维生素，这些物质都是人体必须补充和吸收的营养品。已知的葡萄酒中含有的对人体有益的成分大约就有600种。葡萄酒的营养价值由此也得到了广泛的认可。据专家介绍：树龄在25岁以上的葡萄树树根在地下土壤里扎根很深，相对摄取的矿物质微量元素也多，以这种果实酿造出来的葡萄酒最具营养价值。

葡萄酒是具有多种营养成分的高级饮料。适度饮用葡萄酒能直接对人体的神经系统产生作用，提高肌肉的张度。除此之外，葡萄酒中含有多种氨基酸、矿物质和维生素等，能直接被人体吸收。因此葡萄酒能对维持和调节人体的生理机能起到良好的作用，尤其对身体虚弱、患有睡眠障碍者及老年人的效果更好。

因此，提供降解苹果酸并可应用于酸含量较高的果酒发酵的优良菌株具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了菌株及其应用。该菌株具有较好的降解苹果酸的能力，具有葡萄酒发酵应用潜力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了菌株，其26s D1-D2区具有如I、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一项：

I、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰包括成倍扩增。

在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。

在本发明的一些具体实施方案中，核苷酸序列的缺失为缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。

在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的菌株为东方伊萨酵母(I.orientalis)

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的菌株的保藏编号为CGMCCNO.14648。

本发明还提供了上述的菌株在降解苹果酸中的应用。

本发明还提供了上述的菌株在葡萄酒发酵中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，葡萄酒为赤霞珠干红葡萄酒。

本发明还提供了一种降解苹果酸的组合物，包括上述的菌株。

本发明还提供了一种降解苹果酸的方法，取上述菌株或上述苹果酸降解物与原料混合发酵。

本发明还提供了一种用于葡萄酒发酵的组合物，包括上述菌株。

本发明还提供了一种葡萄酒的发酵方法，取上述菌株或上述苹果酸降解物与原料混合发酵。

本发明提供了菌株，其26s D1-D2区具有如I、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一项：I、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；Ⅱ、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。

本发明获得的菌株具有如下效果：

(1)通过对筛选出的20株能够降解柠檬酸的酵母菌菌株在苹果酸酸培养基和YPD-苹果酸培养基中进行降酸能力筛选，共得到9株非酿酒酵母可以有效的降解苹果酸，分别为菌株M100、M130、B9S-2、B6-1、B4-19、GS1-1、GS1-20、M1-1和GS1-18。9株酵母菌在分别苹果酸培养基中和YPD-苹果酸培养基中，苹果酸降解率均高于20％。

(2)随后对9株菌株进行发酵性能研究及有机酸测定，结果显示，除对照菌株NX11424外，所有试验菌株均表现出优良的降酸能力和发酵性能，总酸降解率为27.10％～35.63％，且发酵结束后残糖＜2g/L，酒度为9.54～10.63％(v/v)。通过对发酵过程进行有机酸监控，结果显示，在发酵过程中，苹果酸呈现先上升后下降变化趋势，其中，对照菌株NX11424降解苹果酸效果最差，试验菌株M1-1效果最好，可将11.12g/L的苹果酸降低到6.19g/L，降酸率达44.7％。

(3)将筛选出的9株优良降酸酵母用于加酸赤霞珠干红葡萄酒发酵，得出菌株M1-1降酸效果最强，可将15.28g/L的总酸降低到5.84g/L，总酸降解率达61.78％，将3.32g/L的苹果酸降低到1.13g/L，苹果酸降解率达66.09％，且发酵结束后，酒质较好，说明菌株M1-1在果酒苹果酸降酸处理上有一定的应用价值。

(4)对赤霞珠干红葡萄酒进行香气测定分析，结果显示，对照菌株NX11424与试验菌株香气成分差异显著，菌株M1-1与其他试验菌株香气成分差异显著，正戊醇、硬脂酸乙酯、乙酸己酯为试验菌株M1-1特征香气物质，果香浓郁。

生物保藏说明

生物材料：CEC M11，分类命名：东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，于2017年09月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCCNO.14648。本发明所提供的生物材料CEC M11即对应本发明各实施例中所述的试验菌株M1-1。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示不同菌株苹果酸模拟汁生长曲线；

图2示不同菌株苹果酸模拟汁发酵曲线；

图3示不同菌株苹果酸模拟汁发酵有机酸变化曲线；其中，图3(A)示B9S-2；图3(B)示B6-1；图3(C)示B4-19；图3(D)示M100；图3(E)示GS1-1；图3(F)示GS1-20；图3(G)示M1-1；图3(H)示M130；图3(I)示GS1-18；图3(J)示NX11424；

图4示优选代表菌株糖消耗曲线和有机酸变化曲线；

图5示赤霞珠干红葡萄酒酿造工艺；

图6示不同菌株赤霞珠发酵曲线；

图7示赤霞珠酒样香气物质的主成分散点图；

图8示不同菌株发酵的赤霞珠酒样的主成分散点图；

图9示不同菌株猕猴桃汁发酵曲线。

具体实施方式

本发明公开了菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

(1)将实验室保藏的130株非酿酒酵母进行柠檬酸降酸能力筛选，结果显示共有20株菌表现出优良的降酸能力和发酵性能，分别为菌株GS1-18、M131、M1-1、B6-1、M118、M144、M117、FS-2-7、C735、C734、C392、C84、B9S-2、C396、C732、GS1-1、M130、M100、GS1-20、B4-19。

(2)将菌株GS1-18、M131、M1-1、B6-1、M118、M144、M117、FS-2-7、C735、C734、C392、C84、B9S-2、C396、C732、GS1-1、M130、M100、GS1-20、B4-19进行苹果酸降酸能力筛选和发酵性能研究，结果显示，共有9株菌表现出优良的降酸能力和发酵性能，分别为菌株M100、M130、B9S-2、B6-1、B4-19、GS1-1、GS1-20、M1-1和GS1-18，苹果酸降解率为33.52％～44.7％。对发酵过程进行有机酸监控，结果显示，苹果酸呈现先上升后下降变化趋势，其中试验菌株M1-1效果最好，可将11.12g/L的苹果酸降低到6.19g/L。

(3)将菌株M100、M130、B9S-2、B6-1、B4-19、GS1-1、GS1-20、M1-1和GS1-18进行加酸赤霞珠干红葡萄酒酿造，结果显示，菌株M1-1降酸效果最强，可将3.32g/L的苹果酸降低到1.13g/L，苹果酸降解率达66.09％，且发酵结束后，香气浓郁。

菌株材料：非酿酒酵母(I.orientalis或P.kudriavzevii)菌株GS1-18、M131、M1-1、B6-1、M118、M144、M117、FS-2-7、C735、C734、C392、C84、B9S-2、C396、C732、GS1-1、M130、M100、GS1-20、B4-19。本土酿酒酵母NX11424西北农林科技大学葡萄酒学院微生物实验室保藏。

试剂：

葡萄糖、酵母浸粉、琼脂、蛋白胨、磷酸氢二铵、氯化钙、氢氧化钾、吐温80、95％乙醇、氢氧化钠、甘油、3,5-二硝基水杨酸等均为国产分析纯试剂。

YNB(Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and without Ammoniumsulfate)、果糖、柠檬酸、麦角固醇、L-脯氨酸、DL-色氨酸、精氨酸等为进口分析纯试剂。

柠檬酸，丙酮酸、酮戊二酸，苹果酸，琥珀酸标准品；上海源叶生物科技有限公司等。

培养基：

(1)苹果酸培养基：1％的酵母浸粉，2％的蛋白胨，1％的苹果酸。

(2)YPD-苹果酸培养基：1％的酵母浸粉，2％的蛋白胨，1％的苹果酸，2％的葡萄糖。

(3)苹果酸试剂盒：爱尔兰Megazyme公司。

(4)苹果酸模拟汁

本实验中模拟汁具体配方参照Spiropoulos et al.(2000)等修改。

ergo stock：12.5mL Tween80，37.5mL 95％乙醇，0.125g麦角固醇，于4℃保存；

溶液A：100g葡萄糖，100g果糖，4mL ergo stock溶解，去离子水定容到500mL；

溶液B：10g苹果酸去离子水定容到250mL；

溶液C：1.7g YNB，2g酸水解酪蛋白，6mg肌醇，0.2g无水氯化钙，0.8gL-精氨酸，1gL-脯氨酸，0.1g DL-色氨酸，1g磷酸铵溶解，去离子水定容到250mL。

将A、B、C溶液混合，用0.22μm滤膜过滤除菌，配方中除ergo stock可于4℃保存外，其他溶液均需现配现用，配制时间超过12h后会产生沉淀。

仪器与设备：见表1。

表1实验仪器及设备

设备型号	名称	公司
			MJPS-250	霉菌培养箱	上海精宏实验设备有限公司
ZHWY-2102C	恒温培养振荡器	上海智城分析仪器制造有限公司
			KQ-300DE	超声波清洗机	昆山市超声仪器有限公司
DHG-9071A	鼓风干燥箱	上海精宏实验设备有限公司
			FRESC017	高速冷冻离心机	美国Thermo公司
DYY-10C	电泳仪	北京市六一仪器厂
			C1000	PCR仪	BioRAD公司
GBOX-EF	凝胶成像系统	SYNGENE公司
			SS325	高压蒸汽灭菌锅	日本Tomy公司
UV1800	紫外可见分光光度计	日本岛津公司
			SW-CJ-2FD	洁净工作台	苏州安泰空气技术有限公司
AUW-220D	十万分之一天平	日本岛津公司
			NanoDrop-1000	微量紫外分光光度计	基因有限公司
BK1301	生物显微镜	重庆光电仪器有限公司
			LC-10ATVP	液相色谱仪	日本岛津公司

数据分析及处理运用软件Excel 2010及SPSS 20，数据绘图运用软件Origin 9.0。

本发明提供的菌株及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1酵母菌的降解苹果酸性能筛选

将西北农林科技大学葡萄酒学院刘延琳教授实验室筛选得到的具有降解柠檬酸效果的20株菌株进行苹果酸降酸性能筛选。

本发明菌株材料在柠檬酸培养基(1％的酵母浸粉，2％的蛋白胨，1％的柠檬酸)中生长状况及降酸效果如表2所示。

表2本发明菌株材料在柠檬酸培养基中的降酸效果

注：OD₆₀₀为菌株培养前后差值，^A以柠檬酸计。

Note：△OD₆₀₀＝OD_600after-OD_600before；^A：citric acid.

对20株菌株进行苹果酸降酸性能筛选。

(1)初筛

将筛选材料酵母菌于5mL的YPD试管中28℃活化24h。取适量菌液划线于YPD固体培养基上，28℃培养3d。挑取单菌落于装有1mL苹果酸培养基的离心管中，制备菌悬液。将制备好的菌悬液分别接种到装有杜氏管的8mL苹果酸培养基试管中，每个试验做三个平行，28℃培养6d。培养结束后，观察菌株生长状况，采用NaOH滴定法(文连奎等,2011)测定总酸含量。由于苹果酸培养基中主要含有有机酸为苹果酸，所以总酸含量以苹果酸计。根据培养前后总酸(苹果酸)浓度差计算总酸(苹果酸)降解率。根据计算结果，从中筛选出降酸率高于20％的菌株做进一步的筛选。

式中C₀为培养之前总酸(苹果酸)的质量浓度；C₁为培养结束后总酸(苹果酸)的质量浓度。

(2)复筛

将上述筛选出的总降酸率高于20％的菌株，于5mL的YPD试管中28℃活化24h。取适量菌液划线于苹果酸固体培养基上，28℃培养3d。挑取单菌落于装有1mL YPD-苹果酸培养基的离心管中，制备菌悬液。将制备好的菌悬液200μL接种到8mL YPD-苹果酸培养基的试管中，每个试验三个平行，28℃培养6d。培养结束后，测定菌液中总酸(文连奎等,2011)含量及苹果酸(Mafakher et al.,2010)含量，根据培养前后总酸、苹果酸浓度计算总酸、苹果酸降解率。从中筛选出降解苹果酸较好的菌株。

实验中苹果酸含量测定方法参照Mafakher et al.(2010)等中运用苹果酸试剂盒的方法，Megazyme Malic Acid Assay Procedure(70Manual Assays per kit)试剂盒购于爱尔兰Megazyme公司。

为进一步筛选出即可以降解柠檬酸又可以降解苹果酸的酵母菌株，以第二章柠檬酸初筛得出的20株非酿酒酵母菌株为材料，用苹果酸培养基(含1％苹果酸)和YPD-苹果酸培养基(含1％苹果酸和2％葡萄糖)进行菌株苹果酸降酸效果筛选。结果显示，所有菌株在苹果酸培养基中均未产气。由表2可知，不同菌株在苹果酸培养基中，降酸效果差异显著，其中，菌株B4-19降酸效果最好，可将11.75g/L的总酸含量降低到6.92g/L，降酸率达41.85％，其次为菌株B9S-2，降酸率达41.16％。综合比较数据结果，共有12株菌总酸降解率在20％以上，分别为菌株M131、C396、C392、GS1-20、M1-1、M100、GS1-1、GS1-18、B6-1、M130、B9S-2、B4-19，因此选择这12株菌做进一步的复筛实验。

表3不同菌株在苹果酸培养基中的降酸效果

菌株	初始总酸^A(g/L)	结束总酸^A(g/L)	总酸降解率(％)
				C84	11.75	11.15±0.06	5.17
C732	11.75	10.84±0.11	7.78
				M118	11.75	9.85±0.29	16.16
C735	11.75	9.82±0.08	16.48
				C734	11.75	9.73±0.08	17.18
M117	11.75	9.69±0.04	17.55
				FS-2-7	11.75	9.65±0.03	17.93
M144	11.75	9.42±0.08	19.88
				M131	11.75	9.3±0.27	20.86
C396	11.75	8.15±0.13	30.68
				C392	11.75	8.1±0.12	31.05
GS1-20	11.75	7.85±0.16	33.24
				M1-1	11.75	7.64±0.12	34.96
M100	11.75	7.57±0.19	35.57
				GS1-1	11.75	7.49±0.13	36.27
GS1-18	11.75	7.39±0.12	37.11
				B6-1	11.75	7.38±0.05	37.20
M130	11.75	7.19±0.16	38.83
				B9S-2	11.75	6.92±0.1	41.16
B4-19	11.75	6.83±0.13	41.85

注：^A：以苹果酸计；Note：^A：malic acid.

将苹果酸培养基初筛得到的12株酵母菌菌株用YPD-苹果酸培养基进行复筛。由表4可知，不同菌株在YPD-苹果酸培养基中降酸效果差异显著。其中，菌株GS1-18在YPD-苹果酸培养基中苹果酸降解率最高，可将9.56g/L的苹果酸降低到4.55g/L，苹果酸降酸率达53.11％，且该菌株总酸降解率也高，达27.18％。

表4不同菌株在YPD-苹果酸培养基中降酸效果

注：^A：以苹果酸计；Note：^A：malic acid.

由表5可知，菌株在苹果酸培养基和YPD-苹果酸培养基中的总酸降解率不同。其中，除菌株M131外，其他菌株在YPD-苹果酸培养基中的总酸降解率均低于在苹果酸培养基中的总酸降解率。比较分析YPD-苹果酸培养基中苹果酸降解率和总酸降解率，结果显示，所有菌株的苹果酸降解率均高于总酸降解率，说明在2％葡萄糖存在条件下，菌株对苹果酸仍具有降解效果。

表5不同菌株苹果酸、YPD-苹果酸培养基中降酸效果对比

综合考虑，筛选全部降酸率总和高于70％的菌株做进一步的研究，即菌株GS1-20、M1-1、M100、GS1-1、GS1-18、B6-1、B9S-2和B4-19。由于菌株M100在柠檬酸降酸效果筛选中，表现出较强的降解柠檬酸的能力，且在苹果酸筛选中，全部降酸率总和接近于70％，因此，最终选出菌株GS1-20、M1-1、M100、GS1-1、GS1-18、B6-1、M130、B9S-2和B4-19，共9株菌做进一步发酵性能筛选研究。

菌株鉴定：

将9株菌株经过26S rDNA鉴定，如表6显示，菌株B6-1、B4-19、M100、GS1-1、M1-1和菌株M130鉴定为I.orientalis，菌株B9S-2、GS1-20为P.kudriavzevii，P.kudriavzevii又称I.orientalis(Chan et al.,2012)。有研究表明，I.orientalis可耐高浓度的琥珀酸、衣康酸、己二酸和乙酸(Xiao et al.,2014)，在本研究中，筛选的I.orientalis可在含1％柠檬酸的培养基中代谢生长，说明筛选的I.orientalis耐酸性强。

表6优良降酸菌株的分子鉴定结果

注:T：模式菌株；CBS:霉菌中心保藏所，荷兰NRRL；美国农业研究菌种保藏中心，美国。

实施例2降苹果酸酵母菌的发酵性能筛选

为获得发酵性能优良的降酸菌株，将筛选得到的降酸能力强的菌株进行苹果酸模拟汁(Spiropoulos et al.,2000)发酵(模拟汁中有机酸只含有1％苹果酸)，由于筛选所得菌株均为非酿酒酵母，而通常发酵果汁采用的是酿酒酵母，因此，此试验中添加酿酒酵母NX11424作为对照菌株，以更好的研究分析试验菌株(I.orientalis或P.kudriavzevii)的发酵性能。

发酵液为苹果酸模拟汁，发酵瓶为500mL锥形瓶。将酵母种子液接种于装有300mL苹果酸模拟汁的发酵瓶中，20℃，150rpm振荡培养。酵母细胞接种量为5×10⁵cells/mL，每个试验做三个平行。发酵期间，每24h测定还原糖含量和酵母菌生物量。发酵结束后，测定酒度、挥发酸、残糖、总酸含量及苹果酸含量。

还原糖含量测定、生物量测定、理化指标测定和有机酸分析如下所示：

(1)还原糖含量测定

还原糖含量测定采用DNS法(王春晓等,2012)。

(2)生物量的测定

为研究发酵过程中酵母菌的生长状况，每24h取样1mL，测定其在600nm处的吸光值OD₆₀₀。

(3)理化指标测定

发酵结束后，根据GBT 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定发酵液中酒度、挥发酸、残糖及总酸含量。

(4)有机酸测定

采用高效液相离子排阻色谱法(姚浔平等,2008)测定发酵过程中及发酵结束后有机酸含量。

色谱柱：Phenomenex Rezex ROA有机酸分析柱(150mm×7.8mm×8μm)；

色谱条件：流动相：0.005M H₂SO₄(HPLC等级水溶液)；流速：0.5mL/min；柱温：室温；检测波长：210nm；进样量：20μL。

标准溶液配制：分别称取200mg柠檬酸、200mg酒石酸、200mg苹果酸、50mg丙酮酸、50mg α-酮戊二酸、50mg琥珀酸、25mg草酸标准品，依次定容至1mL，获得标准品母液。随后，分别取50μL柠檬酸、酒石酸、苹果酸标准液、40μL琥珀酸、丙酮酸、酮戊二酸、草酸标准液混合，用去离子水定容至2mL，配成混合标准母液，其中柠檬酸5g/L，酒石酸5g/L、苹果酸5g/L、丙酮酸1g/L、酮戊二酸1g/L、琥珀酸1g/L、草酸0.5g/L。

标准曲线绘制：分别取混合标准溶液100μL，200μL，300μL，400μL，500μL加去离子水至500μL，经0.22μm滤膜过滤，进样量20μL。以各标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定：将样品进行稀释，使样品中待测有机酸的浓度介于检测范围之间，0.22μm滤膜过滤，进样量20μL。根据检测到样品中各物质的峰面积，依据标准曲线，计算各物质的浓度。

为获得具有优良降酸能力和发酵性能的菌株，将9株降苹果酸酵母菌株进行苹果酸(有机酸只含1％苹果酸)模拟汁发酵。为更好的研究优选的9株降酸菌株(非酿酒酵母)的酿酒特性，此发酵试验中添加酿酒酵母NX11424作为对照菌株。

不同菌株模拟汁发酵能力：

分析比较9株降酸菌株在1％苹果酸模拟汁中的生物量曲线图(图1)，结果显示，相比对照菌株NX11424，所有试验菌株在发酵初期生长速率均慢于对照菌株，但随着发酵的进行，试验菌株生长速度加快，且其最大生物量明显高于对照菌株，说明在含1％苹果酸的模拟汁中，试验菌株生长能力较强。比较分析不同试验菌株生物量曲线图，各个菌株之间差异不大，其中菌株M1-1生长速率稍快于其他菌株。

分析比较9株降酸菌株的发酵曲线(图2)，结果显示，与对照菌株NX11424相比，所有试验菌株在含有1％苹果酸的模拟汁中都可以很好的完成发酵，残糖低于2g/L。在130h时基本结束发酵，其中菌株M1-1相比其他菌株发酵速度较快。而对照菌株在高酸(初始总酸为11.62g/L，初始苹果酸11.21g/L)，低pH值(pH＝2.49)的模拟汁中，发酵速度较慢，在发酵进行到226h时，残糖为8.08g/L时停止发酵。

不同菌株模拟汁发酵理化指标：

模拟汁发酵结束理化指标测定结果显示(表7)，相比对照菌株NX11424，所有试验菌株，发酵结束后，还原糖含量均在0.1～1.0g/L，且酒度都达到(10.00±0.8)％(v/v)。说明所有试验菌株在含1％(11.12g/L)苹果酸模拟汁中，可以很好的完成发酵，且酒精耐受性优良。通过比较分析挥发酸含量可知，对照菌株NX11424挥发酸含量最高，在高酸(1％苹果酸)、低pH(pH＝2.49)条件下，其发酵性能受到影响。

表7不同菌株苹果酸模拟汁发酵结束酒样的理化指标

菌株

残糖(g/L)

酒度％(v/v)

总酸^A(g/L)

挥发酸^B(g/L)

pH

总酸降解率％

B9S-2

0.31±0.07^a

10.63±0.12^d

7.88±0.32^cd

0.13±0.01^a

2.48±0.06^ab

35.18

B6-1

0.36±0.09^a

10.63±0^d

8.04±0.1^cd

0.14±0^a

2.52±0.06^b

33.64

B4-19

0.24±0.01^a

10.58±0.31^d

7.97±0.13^cd

0.13±0.02^a

2.52±0.01^b

34.36

M100

0.21±0.06^a

10.54±0.07^d

8.47±0.04^d

0.15±0.01^a

2.47±0.03^ab

29.63

GS1-1

0.26±0.05^a

10.38±0.25^cd

8.44±0.08^d

0.14±0.01^a

2.47±0.03^ab

29.88

GS1-20

0.31±0.01^a

10.17±0.14^bc

7.48±0.17^a

0.15±0.01^a

2.45±0.01^a

38.99

M1-1

0.52±0.1^a

9.96±0.19^b

8.13±0.13^c

0.18±0.01^a

2.48±0.06^ab

32.81

M130

0.17±0.01^a

10.54±0.07^d

7.73±0.09^ab

0.16±0.01^a

2.45±0.01^a

36.57

GS1-18

0.27±0.04^a

10.46±0.07^cd

7.91±0.22^cd

0.17±0.01^a

2.5±0.02^ab

34.87

NX11424

8.08±1.59^b

9.54±0.26^a

15.78±0.3^e

4.71±0.22^b

2.44±0.01^a

-39.20

注：^A：以苹果酸计；^B：以乙酸计

Note:^A：malic acid；^B：acetic acid.

比较不同菌株发酵结束后总酸含量，结果显示，除对照菌株NX11424的总酸含量高于初始值外，其他试验菌株的总酸含量均有所下降，说明，所有试验菌株在含1％苹果酸模拟汁中具有一定的降酸效果。其中，菌株GS1-20的总酸含量最低，即其在含1％苹果酸的模拟汁中，总酸降解效果最好，可将11.62g/L总酸降低到7.48g/L，降酸率达38.99％。

不同菌株模拟汁发酵有机酸测定：

不同菌株对苹果酸降解效果不同，由表8可知，对照菌株NX11424与试验菌株发酵结束后苹果酸含量差异显著，其中，对照菌株NX11424含量最高为9.76g/L，显著高于其他试验菌株6.19～7.45g/L。比较不同试验菌株的苹果酸降解率，结果显示，试验菌M1-1在含1％苹果酸的模拟汁中降解苹果酸效果最好，可将11.12g/L的苹果酸降低到6.19g/L，降酸率达44.7％。其次为菌株B4-19、B6-1、B9S-2、M100对苹果酸降解效果较好，降解率高于38％。菌株GS1-1对苹果酸降解效果较弱，降解率为33.52％。

表8不同菌株苹果酸模拟汁发酵结束酒样的有机酸含量

分析不同菌株有机酸变化情况(图3)，结果显示，所有菌株苹果酸均呈现先上升后下降的趋势，且在发酵58h时达到最大值。苹果酸是TCA循环的主要中间代谢物，上游可由酮戊二酸经琥珀酸、延胡索酸转化而来，下游可代谢为柠檬酸。酵母发酵过程即酵母将葡萄糖转化为酒精的过程，在酵母发酵旺盛期，大量的葡萄糖经过糖酵解途径形成丙酮酸进入TCA循环，经过柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸进而转化为苹果酸，增加发酵液中苹果酸含量。比较其他有机酸变化曲线，结果发现，所有菌株在发酵过程中未检测到柠檬酸，检测到较低含量的酮戊二酸和琥珀酸，推测在酵母代谢中，由苹果酸、丙酮酸转化而来的柠檬酸又迅速转化为酮戊二酸和琥珀酸，因此检测不到。

比较不同菌株苹果酸下降趋势，结果发现，除对照菌株外，所有试验菌株苹果酸在第二阶段即58～96h间下降趋势较缓，在第三阶段即96～106h间，下降速度最快。

比较代表性试验菌株M1-1、M100和对照菌株NX11424苹果酸变化曲线(图4)，结果表明，试验菌株M1-1苹果酸下降趋势整体较快，在96～106h下降速度稍有加快，但变化幅度不大，且其苹果酸代谢能力总体较强。而对照菌株NX11424苹果酸整体下降趋势缓慢，且在不同阶段下降趋势变化不大，说明其代谢苹果酸能力较弱。在酵母细胞中，位于线粒体中的苹果酸可经过苹果酸脱氢酶发生氧化反应生成草酰乙酸参与TCA循环，位于细胞质中的苹果酸可经过脱羧反应生成丙酮酸参与酵母细胞的氨基酸代谢及其他生物合成途径(Saayman and Viljoenbloom,2006)。不同酵母菌株对苹果酸的代谢情况不同。酵母细胞胞外苹果酸的转运途径、胞内苹果酸脱氢酶的活性、菌株培养条件中葡萄糖及氧气含量均会影响酵母菌株对苹果酸的代谢能力。有研究显示，在酿酒酵母细胞内不存在苹果酸通透酶，胞外苹果酸只能通过简单扩散方式进入酵母细胞内，相比某些非酿酒酵母(含有苹果酸通透酶)，进入酿酒酵母细胞内的苹果酸较少(Saaymanand Viljoenbloom,2006)。酿酒酵母只有在葡萄糖或其他可同化碳源存在条件下才可以利用苹果酸，有研究者猜测是因为葡萄糖代谢可产生能量，可促使细胞外的苹果酸进入酿酒酵母细胞内(Casal et al.2008)。而一些非酿酒酵母可以在无葡萄糖存在条件下，直接利用苹果酸，其对苹果酸的代谢能力要强于酿酒酵母。此外，本研究中筛选得到的降酸菌株属于I.orientalis，是好氧菌种(Jollyet al.,2014)，相比对照菌株酿酒酵母，在摇瓶发酵条件下，该菌种酵母细胞内TCA循环中代谢酶的活性更高，即位于线粒体内苹果酸脱氢酶的活性更高，有利于该菌种对苹果酸的吸收代谢。因此，本研究中非酿酒酵母I.orientalis对苹果酸的降解效果强于对照菌株酿酒酵母。

综合分析结果得出，不同菌株降解苹果酸效果差异显著，其中，对照菌株NX11424降解苹果酸效果最差，试验菌株M1-1效果最好。在整个发酵过程中，苹果酸呈现先上升后下降变化趋势，高浓度的葡萄糖(＞60g/L)会抑制酵母菌菌株对苹果酸的代谢，低浓度(20～60g/L)葡萄糖会促进菌株对苹果酸的代谢。

实施例3降苹果酸酵母菌在葡萄酒发酵中的应用

实验材料：

菌株材料：本土优良降酸酵母B9S-2、B6-1、B4-19、M100、GS1-1、GS1-20、M1-1、M130、GS1-18，西北农林科技大学葡萄酒学院刘延琳教授实验室保藏；本土酿酒酵母NX11424，本实验室优选(其活性干酵母商品名为CECA)。

葡萄：赤霞珠(糖208.86g/L，初始总酸5.87g/L，pH 3.09)，添加酒石酸(6g/L)和苹果酸(3g/L)，使总酸含量为15.28g/L，原料来自陕西张裕瑞那城堡酒庄。

试剂：

维果灵(Velcorin,二甲基二碳酸盐/DMDC)，德国朗盛有限责任公司；

柠檬酸，丙酮酸、酮戊二酸，苹果酸，琥珀酸标准品购自上海源叶生物科技有限公司。

实验方法：

赤霞珠干红葡萄酒酿造工艺：

将葡萄除梗破碎后，加入3g/L苹果酸和6g/L酒石酸，调整总酸含量为15g/L，将调好的葡萄醪分装入2.5L的玻璃发酵罐，每个瓶装2L发酵液，再添加250μL/L DMDC，静止12h。接入酵母菌种子液，20℃酒精发酵。发酵过程中监测含糖量变化，在发酵后期加入150mg/L甘露糖蛋白，当残糖＜4g/L时，发酵结束。酒精发酵结束后，进行皮渣分离。见图5。

还原糖含量测定、理化指标测定、有机酸测定如实施例2记载。

香气成分测定

采用搅拌棒萃取法提取发酵液中的香气物质，具体方法参照(王华等,2015)。

①香气物质的提取

搅拌棒取法(SBSE)：参考Raúletal.(2010)的方法，并稍作改进：取20mL酒样置于样品瓶中，加入80μL内标2-辛醇(5.526g/L)，放入搅拌棒，盖上瓶塞，置于磁力搅拌器上，于室温下进行萃取，转子转速1100rpm，萃取时间60min。萃取结束后，用镊子取出搅拌棒，用蒸馏水冲洗直至搅拌棒上无残留样品，然后用滤纸将水分吸干，最后放入热解析玻璃管，供气相色谱分析用。

②香气成分的GC/MS分析

GC条件：色谱柱为DB-MAX(30m×0.25mm×0.25μm)，以He为载气，流速设为1mL/min。柱温升温程序为40℃保持3min，随后以4℃/min的速度升至160℃，7℃/min至230℃，在此温度下保持8min。连接杆温度设为230℃。脱附流速设为45mL/min，加热阀温度设为245℃，脱附管温度为270℃，脱附15min。传输线温度为255℃。冷阱捕集温度设为-30℃，以40℃/min升至255℃(二级解吸冷阱温度)，出口分流比为3:1。

MS条件：全扫描范围为45～450amu，每秒扫描1次。以EI⁺为电离源，离子源温度设为230℃，电子能量设为70eV，灯丝流量设为0.2mA，检测器电压350V。

③数据处理方法

将各色谱峰对应的质谱图进行人为解析及计算机检索(NIST02图谱)，确定各成份；采用内标法进行定量分析。

结果与分析：

赤霞珠干红葡萄酒发酵曲线：

经过前期降酸菌株筛选及模拟汁(1％苹果酸)发酵，共筛选出9株优良降酸非酿酒酵母B9S-2、B6-1、B4-19、M100、GS1-1、GS1-20、M1-1、M130和GS1-18进行葡萄酒发酵。由图6分析可知，所有菌株均可以完成发酵。其中，对照菌株NX11424相比试验菌株起酵速度快，且在整个发酵过程中，对照菌株发酵速度快于试验菌株。

赤霞珠干红葡萄酒发酵理化指标：

分析比较不同菌株发酵指标(表9)，结果显示，试验菌株总酸含量与对照菌株差异显著，其中，对照菌株NX11424总酸含量最高为9.6g/L，菌株M1-1最低为5.84g/L。说明在加酸赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中，试验菌株具有较强的降酸能力，其中，菌株M1-1降酸能力最强，可将15.28g/L的总酸降低到5.84g/L，总酸降解率达61.78％。其次为菌株GS1-18为57.17％。菌株M130可将15.28g/L的总酸降低到7.17g/L，总酸降解率达53.06％。综合分析可知，菌株M130在猕猴桃果酒和加酸赤霞珠葡萄酒发酵中均具有一定的降低总酸的能力。

表9不同菌株葡萄酒发酵结束酒样的理化指标

注：^A：以酒石酸计；^B：以乙酸计

Note:^A：tatric acid；^B：acetic acid.

比较分析其他理化指标，结果显示，所有菌株发酵结束后残糖含量均低于4g/L，说明，筛选出的降酸酵母I.orientalis或P.kudriavzevii可以在含酸量较高条件下完成葡萄酒发酵，具有较强的发酵能力，且发酵结束后，挥发酸含量低于感官阈值0.8g/L。因此，I.orientalis或P.kudriavzeviiI.在发酵果酒或果酒降酸技术上具有一定的应用价值。

赤霞珠干红葡萄酒有机酸测定：

利用高效液相离子排阻色谱法(姚浔平等,2008)测得调酸后赤霞珠初始苹果酸含量为3.32g/L(表8)。分析比较发酵前后有机酸含量，结果显示，发酵结束后，所有菌株发酵葡萄酒中苹果酸含量均有所下降，其中，菌株M1-1苹果酸下降幅度最大，可将3.32g/L的苹果酸降低到1.13g/L，降酸率达66.09％，比对照菌株NX11424降酸率高43.09％。其次为菌株GS1-18，可将3.32g/L的苹果酸降低到1.28g/L，降酸率达61.50％，其后依次为菌株B4-19、B6-1、GS1-1、GS1-20、M130降酸率为37.09～48.78％。综合分析表明。菌株M1-1发酵葡萄酒降解苹果酸效果最好。Redzepovic et al.(2003)等人研究显示，用菌株RO88(Saccharomyces paradoxus)发酵霞多丽葡萄酒，可降低葡萄酒中苹果酸含量，降酸率达38％，且发酵结束后，酒质较好。在本研究中，菌株M1-1(I.orientalis)降酸率达66.09％，且发酵结束后，酒评较好，说明菌株M1-1在果酒降苹果酸处理上有一定的应用价值。

表10不同菌株葡萄酒发酵结束酒样的有机酸含量(g/L)

处理

草酸

酒石酸

柠檬酸

苹果酸

乙酸

苹果酸降解率(％)

葡萄汁

0.73

7.05

0.28

3.32

0.73

B9S-2

0.88±0.01^e

6.68±0.14^f

0.87±0.07^ab

2.63±0.08^d

0.18±0.01^ab

20.74

B6-1

0.76±0.01^a

4.50±0.55^abc

0.81±0.03^a

1.75±0.54^b

0.22±0.01^cd

47.22

B4-19

0.76±0.00^a

4.83±0.68^bcd

0.9±0.07^ab

1.70±0.34^b

0.21±0.02^cd

48.78

M1-1

0.83±0.03^bc

4.26±0.45^ab

0.87±0.25^ab

1.13±0.02^a

0.19±0.01^bc

66.09

GS1-1

0.75±0.01^a

5.05±0.15^cde

0.87±0.07^ab

2.08±0.02^bc

0.25±0.01^e

37.41

GS1-20

0.85±0.01^cd

5.34±0.33^de

0.87±0.09^ab

2.09±0.01^bc

0.30±0.00^f

37.09

M100

0.82±0.02^b

5.58±0.38^e

0.99±0.05^ab

2.42±0.00^cd

0.16±0.00^a

27.12

M130

0.84±0.01^bc

5.05±0.05^cde

1.05±0.03^b

2.09±0.07^bc

0.30±0.03^f

37.18

GS1-18

0.75±0.00^a

4.01±0.27^a

0.97±0.02^ab

1.28±0.13^a

0.23±0.02^de

61.50

NX11424

0.86±0.01^de

4.90±0.22^cde

0.86±0.22^ab

2.56±0.02^d

0.31±0.01^f

23.00

综合比较菌株葡萄酒发酵中总酸降解率(表9)和苹果酸降解率(表10)，结果显示，菌株M1-1总酸降解率最高，为61.78％，苹果酸降解率最高，为66.09％，即菌株M1-1降酸效果最强。

赤霞珠干红葡萄酒香气成分测定

通过GC-MS对赤霞珠干红葡萄酒进行香气物质测定(表11)，结果显示，葡萄酒中共检测到33种香气物质。其中，酯类物质为主要的香气物质，共21种，其次为醇类物质和酸类物质，分别为5种和6种。

如表11中结果所示，菌株B9S-2菌株酒样比其他非酿酒酵母酒样各类香气物质含量较低，酯类香气以乙酸异戊酯、己酸乙酯等物质为主，醇类香气以苯乙醇为主，含量比对照菌株低，具有桃子、香蕉、绿苹果和草莓等甜果香及花香。

菌株B6-1、B4-19、M100、GS1-1、GS1-20、M1-1、M130、GS1-18所酿酒样的香气物质较为相似，酒样的酯类香气物质中，相比于对照菌株NX1424的酒样，乙酸乙酯含量较高，丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、己酸异戊酯等香气物质含量略低，则非酿酒酵母所酿酒样的果香有所增强，而菠萝、香蕉、桃子、梨等类果香浓度略低；醇类物质以异戊醇、苯乙醇为主，含量略低于对照菌株，酒样的醇香与花香浓度略低；辛酸及2-辛酮含量略低，奶酪及乳香浓度略低。同时非酿酒酵母具有丁二酸二乙酯、棕榈酸乙酯、法呢醇等特征香气，具有令人愉快的香气、香料、可可等气味。

菌株M100酒样的乙酸己酯、十二酸乙酯、硬脂酸乙酯、肉豆蔻酸含量较高，具有浓郁的绿苹果、草莓等甜果香，黄油等脂肪味。菌株GS1-20酒样的乙酸乙酯、乙二酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯及癸酸含量较高，均高于对照菌株，具有浓郁的果香，带有菠萝、梨、椰子等果香及花香，舒适芳香。菌株M130酒样的癸酸乙酯、辛酸3-甲基丁酯、丁二酸二乙酯、十二酸乙酯、棕榈酸乙酯、癸酸、肉豆蔻酸等香气物质较高，具有椰子、甜果等果香，舒适的黄油等脂肪味，烘烤、可可、香料等愉快香气。

表11不同菌株发酵的干红葡萄酒中香气物质(均值±方差，μg/L)

备注：表格中含量为相对含量，标有*的物质在酒样中的浓度单位为mg/L。

对赤霞珠酒样中香气物质进行PCA主成份分析，共提取了两个主成份PC1和PC2，解释了整体方差的62.19％。如图7所示，PC1解释了整体方差的46.27％，与十二酸乙酯、苯乙醇、癸酸乙酯、辛酸、异丁醇等香气物质成正相关，与硬脂酸乙酯、正戊醇、乙酸己酯、棕榈酸乙酯物质呈负相关。PC2解释了整体方差的15.91％，与肉豆蔻酸、硬脂酸乙酯、正戊醇、丁二酸二乙酯、异丁醇等物质成正相关，与壬酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇等物质呈负相关。结合两个主成份分析结果表明，辛酸乙酯、辛酸、十二酸乙酯、癸酸乙酯、癸酸相比较其他物质，贡献率较大。其次为异戊醇、肉豆蔻酸、庚酸乙酯和苯乙醇。肉豆蔻酸乙酯、异丁醇癸二酸二乙酯、癸烯酸和壬酸乙酯对赤霞珠葡萄酒香气物质的贡献率较小。

结合不同菌株赤霞珠酒样香气物质PCA分析(图8)，结果显示，对照菌株NX11424香气物质与其他菌株差异显著，位于第四象限，正己醇、壬酸乙酯、癸烯酸、乙二酸二乙酯为对照菌株NX11424的特征香气物质。菌株M130、B6-1和GS1-18香气物质成份差异不明显，均位于第一象限，乙酸苯乙酯、癸酸、癸酸乙酯、丁酸乙酯等物质为其特征香气物质。菌株B4-19、B9S-2、GS1-20和菌株GS1-1差异不显著，试验菌株M1-1与其他菌株香气成分差异显著，正戊醇、硬脂酸乙酯、乙酸己酯为其特征香气物质。综合结果显示，对照菌株酿酒酵母与试验菌株非酿酒酵母之间香气物质成分差异显著，正己醇、壬酸乙酯、癸烯酸、乙二酸二乙酯为对照菌株NX11424的特征香气物质，正戊醇、硬脂酸乙酯、乙酸己酯为试验菌株M1-1特征香气物质。

实施例4降酸菌株M1-1在猕猴桃果酒发酵中的应用

猕猴桃去皮打浆，加入果胶酶60mg/L，调整糖度到180g/L，分装入1L的玻璃发酵罐，每个瓶装600mL发酵液，添加250μL/L DMDC，静止12h。按体积分数8％接种量接入酵母菌种子液，20℃下进行酒精发酵。发酵过程中，每隔24h测定还原糖含量。发酵结束后，分离皮渣并添加1.5g/L10％的膨润土进行澄清。发酵结束后，测定酒度、挥发酸、残糖及总酸含量。

还原糖含量测定、理化指标测定及有机酸测定如实施例2记载。

香气成分测定如实施例3记载。

结果与分析

猕猴桃果酒发酵曲线：

将筛选出的优良降酸菌株M1-1进行猕猴桃果酒发酵，考察其发酵性能及应用效果。比较试验菌株与对照菌株发酵能力，从图9可见，相比对照菌株酿酒酵母NX11424，试验菌株(非酿酒酵母)发酵速度较慢。Castor(1954)表示，非酿酒酵母发酵能力弱，在通常情况下不能完成发酵。但在此试验中，实验菌株可以完成发酵。说明筛选出的非酿酒酵母菌菌株M1-1具有发酵果酒的潜能。

不同菌株猕猴桃发酵理化指标：

分析比较猕猴桃果酒发酵指标(表12)，试验菌株挥发酸的含量显著低于对照菌株，总酸降低了11.31％。猕猴桃果酒通常采用苹果酸—乳酸发酵来降低总酸含量，但总体降酸效果不明显(Arrieta et al.,2014)。在郝雅兰(2014)的研究中显示，其红阳猕猴桃干型酒酒精发酵结束后总酸含量为13.45g/L，后期经过苹果酸—乳酸发酵后，总酸含量下降16.17％，下降效果不明显。可见，果酒酸度的降低对发酵微生物的要求较高。

比较分析其他有机酸，从表12可见，发酵前后苹果酸和琥珀酸含量均有所升高，推测其原因是因为柠檬酸、苹果酸和琥珀酸均为三羧酸循环(TCA)中的中间代谢物，一方面由于葡萄糖代谢，使得苹果酸和琥珀酸含量升高，另一方面可能是由于柠檬酸含量较高，在TCA循环中，柠檬酸代谢为其他有机酸，包括苹果酸和琥珀酸，从而使得苹果酸和琥珀酸含量增加。

表12不同菌株猕猴桃果汁发酵结束酒样的理化指标

注：^A：以柠檬酸计；^B：以乙酸计

香气成分测定：

通过GC-MS对猕猴桃果酒进行香气物质测定(表13)，结果显示，猕猴桃果酒中共检测到29种香气物质。其中，酯类物质为主要的香气物质，共19种，其次为醇类物质和酸类物质。

不同菌株的香气成分含量差异显著。菌株M1-1、NX11424均检出了21种香气物质。庚酸乙酯、辛酸甲酯、反式-4-癸烯酸乙酯、顺-3-己烯醇为对照菌株NX11424独有香气物质。对照菌株中乙酸己酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、正己醇、辛酸、癸酸含量显著高于试验菌株，乙酸乙酯含量显著低于试验菌株。M1-1具有乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯等乙酸酯类香气物质，含量显著高于对照菌株，其酒样具有桃子、香蕉、绿苹果、草莓等甜果香及浓郁的花香，而辛酸乙酯、苯甲酸乙酯，乙酸苯乙酯等高含量的酯类香气会赋予M1-1酒样菠萝、梨等浓郁的果香与花香；同时苯乙醇和肉豆蔻酸、2-辛酮的含量也很高，使得酒样具有较浓郁的花香、甜果香和乳香。

综上所述，菌株M1-1具有较高的酯类、苯乙醇、肉豆蔻酸及2-辛酮产生能力，可赋予果酒菠萝、梨等浓郁的果香、花香及乳香。

表13不同菌株发酵的猕猴桃果酒中香气物质的含量(均值±方差，μg/L)

注：表格中含量为相对含量，标有*的物质在酒样中的浓度单位为mg/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 菌株及其应用

<130> MP1721577

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 584

<212> DNA

<213> M1-1 26S D1-D2 区序列(26S d1-d2 sequence of M1-1)

<400> 1

ccggaagcat gcctcagtag cggcgagtga agcggcaaga gctcagattt gaaatcgtgc 60

tttgcggcac gagttgtaga ttgcaggttg gagtctgtgt ggaaggcggt gtccaagtcc 120

cttggaacag ggcgcccagg agggtgagag ccccgtggga tgccggcgga agcagtgagg 180

cccttctgac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctccaa gcgggtggta aattccatct 240

aaggctaaat actggcgaga gaccgatagc gaacaagtac tgtgaaggaa agatgaaaag 300

cactttgaaa agagagtgaa acagcacgtg aaattgttga aagggaaggg tattgcgccc 360

gacatgggga ttgcgcaccg ctgcctctcg tgggcggcgc tctgggcttt ccctgggcca 420

gcatcggttc ttgctgcagg agaaggggtt ctggaacgtg gctcttcgga gtgttatagc 480

cagggccaga tgctgcgtgc ggggaccgag gactgcggcc gtgtaggtca cggatgctgg 540

cagaacggcg caacaccgcc cgtcttgaac cacgggaccc atag 584

Claims

1.菌株，其特征在于，其26s D1-D2区具有如I、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一项：

I、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，其为东方伊萨酵母(I.orientalis)。

3.根据权利要求1或2所述的菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.14648。

4.根据权利要求1至3任一项所述的菌株在降解苹果酸中的应用。

5.根据权利要求1至3任一项所述的菌株在果酒发酵中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述果酒为葡萄酒。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述葡萄酒为赤霞珠干红葡萄酒。

8.一种降解苹果酸的组合物，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的菌株。

9.一种用于葡萄酒发酵的组合物，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的菌株。

10.一种降解苹果酸的方法，其特征在于，取如权利要求1至3任一项所述的菌株或如权利要求8所述的组合物与原料混合发酵。