CN110305804A - 一种非酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非酿酒酵母菌株及其应用。本发明提供的非酿酒酵母菌YLL16（Hanseniaspora thailandica），是从南丰蜜桔自然发酵醪中分离得到的，于2018年3月18日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018140，该菌株既具有良好的酒精发酵能力，还具有很强降解有机酸能力。该菌株可应用于生物发酵和酿制果酒，利用该菌株发酵柑桔压榨果汁酿制柑桔果酒，具有良好的酒精发酵能力以及很强的生香除涩能力，这对于改善柑桔果酒口感和提高柑桔果酒品质具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种酵母菌株及其应用，尤其是涉及一种非酿酒酵母菌株，但是其可以用于酿酒。
背景技术
当前以水果为原料，酿造风味独特的果酒已成为一种趋势。以新鲜柑桔汁为原料，酿造生产柑桔果酒不仅能够减少柑桔资源的浪费，而且可以满足人们对高档果酒消费的需要，也是蜜桔深加工研究的方向之一。柑桔果酒具有酒度低、营养高、益脑健身等特点，且柑桔果酒中含有柑桔中大部分的营养物质，如糖类、维生素类、柠檬酸、黄酮类化合物等物质，均对人体具有益处。
然而，由于柑桔含糖量高，不易储藏，极易腐烂，所以柑桔主要用于鲜食，用于深加工量极少，严重制约柑桔产业的发展。而且，果酒往往因为有机酸含量较高，导致酒体酸涩、粗糙感较强，这已成为果酒产业进一步拓宽市场和规模化发展的瓶颈制约。在柑桔果酒的酿造过程中，酵母菌参与果酒的发酵过程。在发酵过程中，酵母菌将果汁中的绝大部分糖转化为酒精和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、醛、酯等代谢产物，直接影响果酒的香气及口感，决定着果酒的质量，对果酒特色的形成至关重要。
目前，柑桔果酒的酵母多为延用葡萄酒酵母或果酒干酵母，专用酵母菌的研究很少，缺乏适用的酵母菌株，导致柑桔果酒风味不突出、风味欠佳的缺陷，影响了柑桔果酒的品质及销量。对于果酒酿造而言，菌种的选择决定着果酒的质量。果酒酵母通常分为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非酿酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）。通常，酿酒酵母有较好的产酒精能力，但产香能力相对较弱；非酿酒酵母产香能力相对较强，能够生成多种芳香类物质，对果酒风味有积极的影响。因此，选择优良的果酒酵母已不只局限于酿酒酵母，还包括相关环境中的一些非酿酒酵母。
陈清婵等从柑桔果实上分离得到优良的产香酵母JZ-3，该菌株发酵得到的柑桔果酒酒体丰满、香气浓郁、典型性强，整体品质较高。剧柠等从枸杞果园土壤、鲜果及自然发酵液中筛选到适宜枸杞果酒发酵的孢汉逊酵母（Hanseniaspora thailandica）GF-60，与商用酿酒酵母混合发酵有更多种类的香气成分。Luy等研究发现，戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）和耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）发酵的榴莲酒中高级醇和乙基酯含量更高，酒风味更浓厚，口感更丰富。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酵母菌株,其是一种非酿酒酵母菌株，但是其可以用于酿酒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种酵母菌株，其为非酿酒酵母菌株YLL16（Hanseniaspora thailandica），于2018年3月18日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO：M2018140，所述菌株为孢汉逊酵母属酵母菌。
进一步的，所述菌株是从南丰蜜桔自然发酵醪中分离得到的。
本发明一方面提供了所述非酿酒酵母菌株在生物发酵中的应用。
进一步的，所述生物发酵包括果汁发酵，优选柑桔汁发酵，最优选蜜桔汁发酵。
本发明另一方面提供了所述酿酒酵母菌株在酿造果酒中的应用。
进一步的，所述果酒为柑桔果酒，优选为蜜桔果酒。
本发明还提供了一种制备果酒的方法，所述方法包括采用上述非酿酒酵母菌株YLL16发酵果汁的过程。
进一步的，所述方法包括将所述非酿酒酵母菌株YLL16以1.11×106~9.88×107cfu/mL接种量接入总SO2浓度50~200 mg/L，pH为3.0~6.0的果汁中，在20~25℃下发酵5~20天。
进一步的，所述果汁为柑桔果汁，更优选为蜜桔果汁。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
本发明的非酿酒酵母菌株YLL16能够应用于果酒的发酵，具有良好的酒精发酵能力并且具有很强的生香除涩能力，这对于改善果酒口感和提高果酒品质具有重要意义。
附图说明
下面结合附图说明对本发明作进一步说明。
图1是26S rDNA序列系统发育进化树的示意图。
图2是本发明的非酿酒酵母菌株YLL16的平板菌落形态的照片。
图3是本发明的非酿酒酵母菌株YLL16的细胞显微形态的照片。
具体实施方式
实施例1：
非酿酒酵母菌株（产香酵母菌株）YLL16的分离选育
1、非酿酒酵母菌株YLL16的分离
以南丰蜜桔为原料，经挑选、清洗、榨汁，过滤等工艺，制成蜜桔果汁，调节果汁总SO2浓度为80 mg/L，分装在5 L发酵罐中，在20~25℃下自然发酵，作为酵母菌选育菌源。
待果汁样品在发酵罐中有大量气泡时，取发酵液10%接入酵母富集培养基（酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%），28℃培养1天。在无菌条件下将发酵液进行10倍梯度稀释，选取3个适宜的稀释度10-1、10-2和10-3使得平板菌落能够彼此分开，各吸取0.1 mL，涂布于YPD培养基平板上，每个稀释度做2个平行，置于28℃培养箱中恒温培养2天。典型的非酿酒酵母菌落表面光滑、湿润、黏稠，质地柔软，易挑起，多为乳白或奶油色，有酒香味。挑取具有上述典型酵母菌落形态的单菌落，在YPD培养基平板上上划线培养纯化，并通过嗅闻法初步判断是否有酯香或醇香，筛选具有较浓酯香气或特殊果香气的菌株，经显微镜镜检，从采集的样品中共分离得到45株酵母菌株。首先对45株菌株进行TTC试验，挑选岀具有上述典型酵母菌菌落特征的初筛菌株24株。初筛菌经杜氏小管产气试验，得到6株带有酒香的菌株，通过测量6株菌发酵蜜桔果酒的品质指标及感观分析，得到6株产香酵母为YLL6、YLL7、YLL10、YLL14、YLL16、YLL22并分别转移至YPD琼脂斜面培养基上，于4℃条件下保藏、备用。
非酿酒酵母菌株YLL16的平板菌落形态如图2所示。
2、非酿酒酵母YLL16的选育
将分离得到的YLL6、YLL7、YLL10、YLL14、YLL16、YLL22酵母菌分别以1×107~9×107cfu/mL菌量接种于含总SO2 60 mg/L、可滴定酸9.5 g/L(柠檬酸计)的柑桔果汁中，于20~25℃自然发酵10天，以发酵速率、产酒能力、产香水平、感官评价等进行模糊综合评判，筛选岀适于果酒发酵、具有酸代谢能力且综合性能优良的酵母菌株。
结果如表1所示，产香酵母YLL16产酒度最高，果酒残糖含量低于1%，且降酸能力强，酿造的果酒总酸下降了2.0 g/L；从果酒的色泽、澄清度、香气、滋味和典型性进行综合感官评价，也以YLL16酿制的果酒分值最高，为90分，且果酒风味纯正、协调、口感柔顺、圆润，说明产香酵母YLL16是1株优良产香酵母菌株。产香酵母YLL16已保藏位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018140。产香酵母YLL16适宜的种子发酵培养基的组分为：YPD琼脂培养：1% Yeast Extract（酵母膏），2% Peptone（蛋白胨），2% Dextrose(glucose)（葡萄糖），2%琼脂，25~30℃培养2天。
表1 不同菌株发酵对比试验结果
注：酿造前总酸为10.5g/L (柠檬酸计)。
3、非酿酒酵母YLL16的鉴定
(1)非酿酒酵母YLL16的形态学
非酿酒酵母菌株YLL16的细胞显微形态附图3所示。
(2) 26S rDNA D1/D2序列测定与同源性分析
采用试剂盒提取的方法（E.Z.N.A. TM Yeast DNA Kit）提取纯培养目标菌株的基因组DNA。以引物NL1、NL4扩增其26S rDNA D1/D2 基因保守区。NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。
采用40 µL反应体系进行PCR 扩增，反应体系为：premix rTaq 20 µL、NL1 2.0 µL、NL4 2.0 µL、DNA 1 µL、dd H2O 15 µL。扩增条件：95℃预变性2 min，然后95℃变性30 s，52℃退火30 s ，72℃延伸 1 min，共29次循环，最后72℃充分延伸5 min，4℃保存。PCR产物检测：取5 µL的 PCR产物，1 µL的上样缓冲液，在1.0% 琼脂糖凝胶电泳中分离，130 V 20min。用凝胶成像系统进行分析，将含有目标片段的产物进行测序。将YLL16的26S rDNA D1/D2序列输入Genebank，以Blast软件进行序列同源性比较，利用MEGA软件构建系统发育进化树，进行亲缘关系和系统发育分析，其26S rDNA D1/D2 序列系统发育进化树示于图1。结果显示，与YLL16菌株基因序列相似性较高的序列主要为孢汉逊酵母属，与其相似性最高的是该属中的Hanseniaspora thailandica，与Hanseniaspora thailandica同源性达99%以上，说明该菌在分子系统发育分类学上属于孢汉逊酵母属中的一个种。经26S rDNA D1/D2 序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态，最终确定YLL16菌株为Hanseniaspora thailandica，命名为Hanseniaspora thailandica YLL16（MF979224）。
为了充分公开本发明的非酵母新菌株YLL16及其应用，现结合附图和发明人给出孢汉逊酵母Hanseniaspora thailandica YLL16在果汁发酵和果酒酿造中的应用，来进一步说明本发明的有益效果。
实施例2：非酿酒酵母菌株YLL16发酵的柑桔果酒品质的指标测定
将孢汉逊酵母YLL16在种子发酵培养基中活化后，以4.0×107 cfu/mL接种量5%接入80mg/L、pH值在4.0、起始总酸为1.01 g/L的南丰蜜桔果汁中，在28℃下发酵10天，发酵结束后对蜜桔果酒品质的指标测定，指标测定方法：糖度测定：浓硫酸-苯酚法；总酸的测定：滴定法；酒精体积分数的测定：酒精计法。
指标测定结果：用孢汉逊酵母YLL16所酿造的果酒，其总酸为7.9 g/L，总糖为9.0g/L，酒精体积分数为5.7%，市售葡萄酒高活性干酵母安琪酵母所酿造的果酒，其总酸为8.5g/L，总糖为3.7 g/L，酒精体积分数为10.7%。与干酵母安琪酵母相比，菌株YLL16降酸更明显。
表2南丰蜜桔果酒品质指标测定结果
实施例3：孢汉逊酵母YLL16发酵蜜桔果酒的感官评定
将实施例2中的两组蜜桔果酒发酵原液请10位评委品尝，参照GB 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官评分标准打分（表3），得出孢汉逊酵母YLL16发酵的蜜桔果酒口感要优于市售葡萄高活性干酵母安琪酵母。用孢汉逊酵母YLL16所酿造的果酒颜色为浅黄色，酒体具有纯正和谐的蜜桔果香，酒体丰满，回甘明显，具有蜜桔独特的典型性，结果见表4。
表3 蜜桔果酒感官评分标准
表4 两组菌种发酵蜜桔果酒后的感官评分
实施例4：蜜桔果酒中香味成分的GC-MS（色谱-质谱）分析
取实施例2的两组蜜桔果酒发酵原液各10 mL，在8000 r/min下离心10 min，取上清液分析发酵后蜜桔果酒的香气成分。采用气相色谱串联质谱联用仪（安捷伦7000 GC）分析发酵后蜜桔果酒的香气成分。
GC条件：毛细管柱为DB-FFAP（30 m×320 μm×0.25 μm），顶空瓶装量为5 mL（顶空瓶为20 mL规格），顶空瓶温度为80℃，保留20 min，进样口温度250℃；程序升温：初始温度40℃，保留2 min，以5℃/min的速率升至180℃，保留2 min，再以8℃/min的速率升至230℃，保留5 min；检测器温度250℃；载气He，流速1 mL/min；分流进样，分流比为10:1。
MS条件：四级杆温度150℃；离子源温度230℃；接口温度180℃；电子电离源；电子能量70 eV；质量扫描范围30～500 amu。
结果如表5所示，孢汉逊酵母YLL16发酵后的果酒中香气成分更多，能够产生丰富的酯类物质，产生较少的杂醇和挥发性酸，酯类物质较丰富，包括乙酸乙酯、3-甲基乙酸丁酯、羊蜡酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、硝酸甲酯、丙烯酸乙烯酯、乙酸苯乙酯、丙酸乙酯、异氰酸甲酯、乳酸乙酯、(2S)-吡咯烷-2-羧酸乙酯和乙酸正丙酯。结果表明，孢汉逊酵母YLL16发酵的蜜桔果酒拥有更丰富的果香和酒香。
表5蜜桔果酒中的香气成分分析结果
| 挥发性化合物 | 果汁 | 商业活性干酵母 | 孢汉逊酵母YLL16 |
| 醇类 | <i></i> | <i></i> | |
| 2-甲基-1-丁醇 | 0.82% | - | - |
| 苯乙醇 | - | 0.15% | 0.10% |
| 十一碳烯-4-醇 | - | - | - |
| 1-丁炔-3-醇 | - | - | - |
| 3-戊醇 | - | - | - |
| 叔丁醇 | - | - | 0.14% |
| 异戊醇 | - | - | - |
| 总醇 | 0.82% | 0.15% | 0.24% |
| 酯类 | |||
| 甲氧基乙酸乙酯 | 0.74% | - | - |
| 丁二醇二硝酸酯 | - | 9.62% | - |
| 乙酸乙酯 | - | 8.19% | 10.21% |
| 甲基乙酸酯 | - | 1.65% | - |
| 3-甲基乙酸丁酯 | - | 0.99% | 5.43% |
| 羊蜡酸乙酯 | - | 0.67% | 0.23% |
| 月桂酸乙酯 | - | 0.32% | 0.08% |
| 辛酸乙酯 | - | 0.30% | 0.25% |
| 己酸乙酯 | - | 0.18% | - |
| (甲基硫代)甲基亚砜甲酯 | - | - | - |
| 硝酸甲酯 | - | - | 3.24% |
| 丙烯酸乙烯酯 | - | - | 1.50% |
| 硫酸二丁酯 | - | - | - |
| 乙酸苯乙酯 | - | - | 0.96% |
| 丙酸乙酯 | - | - | 0.13% |
| 异氰酸甲酯 | - | - | 1.13% |
| 乙酸异丁酯 | - | - | - |
| 乳酸乙酯 | - | - | 20.47% |
| (2S)-吡咯烷-2-羧酸乙酯 | - | - | 1.52% |
| 乙酸正丙酯 | - | - | 15.50% |
| 总酯 | 0.74% | 21.92% | 60.65% |
| 酸类 | |||
| 炔丙酸 | - | - | - |
| 乙酸 | - | 0.12% | 0.11% |
| 乙酰乙酸 | - | - | - |
| DL-正缬氨酸 | - | - | - |
| 总酸 | 0.00% | 0.12% | 0.11% |
| 酮类 | |||
| 乙烯酮 | - | - | - |
| 3-羟基-2-丁酮 | - | - | - |
| 二氢-4-甲基 2(3H)-呋喃酮 | - | - | 1.00% |
| 总酮 | 0.00% | 0.00% | 1.00% |
| 烃类 | |||
| 柠檬烯 | 1.64% | 0.98% | 1.32% |
| 乙烯氧乙烯 | - | - | 5.93% |
| 1,1,2,3,3-戊甲基环丁烷 | - | 10.26% | - |
| 正戊烷 | - | 1.96% | - |
| 1,2-二甲氧基乙烷 | - | - | - |
| 异丁烷 | - | - | - |
| 七甲基壬烷 | - | - | - |
| 总烃 | 1.64% | 13.2% | 7.25% |
以上试验所涉及到的试验方法如下：
1、总酸：指示计法（(GB/T15038-2006)，以柠檬酸计。
2、酒精度：酒精计法(GB/T15038-2006)。
3、总糖的测定:浓硫酸-苯酚法。
4、pH值：pH计测定。
5、澄清度的测定：660 nm下分光光度计测定果酒的澄清度。
6、果酒香气分析：采用气相色谱串联质谱联用仪（安捷伦7000 GC）分析发酵后蜜桔果酒的香气成分。
7、感官评价：参照GB 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官评分标准打分（表3）。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种酵母菌株，其特征在于：所述菌株为非酿酒酵母菌株YLL16（Hanseniasporathailandica），于2018年3月18日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018140。
2.根据权利要求1所述的酵母菌株，其特征在于：所述菌株是从南丰蜜桔自然发酵醪中分离得到。
3.根据权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16于生物发酵中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述生物发酵包括果汁发酵。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述果汁发酵包括柑桔汁发酵。
6.根据权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16于制备果酒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述果酒为柑桔果酒。
8.根据权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16于发酵时生香除涩的应用。
9.一种制备果酒的方法，其特征在于，包括采用如权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16发酵果汁的过程。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述非酿酒酵母菌株YLL16以1.11×106~9.88×107 cfu/mL接种量接入pH为3.0~6.0的果汁中，在20~25℃下发酵5~20天。
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| CN110305804B (zh) | 2023-05-16 |
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