CN112522120A - 一株非酿酒酵母hsmt-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株非酿酒酵母hsmt‑1及其应用，属于微生物技术领域，采用了水蜜桃本身自带的酵母菌株，随着水蜜桃的生长自然产生，对水蜜桃具有适应性和协调性，能够充分利用水蜜桃自带的物质，使用此种酵母不仅能够消耗水蜜桃果汁中的糖类物质产生酒精，而且能够分解水蜜桃中的大分子物质产生更多具有香气的小分子物质，与市场上的水蜜桃果酒相比在香气上更加吸引人，当今果酒的消费市场更偏向于低酒精度香味独特的果酒，由该酵母菌发酵所得的水蜜桃果酒具有丰富的酯类物质，香气浓郁，口感酸甜，具有典型的水蜜桃风味。

Description

一株非酿酒酵母hsmt-1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一株非酿酒酵母hsmt-1及其应用。

背景技术

在果酒酿造过程中，酵母菌起到了非常重要的作用。具体的酵母菌的质量直接影响到果酒品质，它们对果酒的质量和风味起着决定性的作用，因此选择一种适合水蜜桃酒酿造的品种是非常重要的，酿酒酵母的性能直接关系到发酵工艺的类型和发酵条件，所以找到一株适合水蜜桃酿造的酵母也是至关重要的，但是一般果酒酿造借用的都是葡萄酒酵母菌种，在产香方面比较单一，主要适合葡萄酒的酿造，而筛出的野生酿酒酵母发酵性能比改良过的商业酵母差，且不稳定，所以筛选一株产香能力好的酵母并且有着一定的产酒精的能力，是解决水蜜桃酒香气单薄问题的关键，通过检测水蜜桃酒中有效成分的含量，也为水蜜桃酒品质的好坏提供一定的科学依据。

糖类是参加发酵过程中的主要成分，酵母菌的作用贯穿了果酒酿造的整个过程，在发酵过程中产生了大量的香味物质和酒精，这直接影响到果酒的品质。因此为了提高水蜜桃果酒的口感，需要对酵母菌株的发酵性能和产香性能进行筛选与研究，提升水蜜桃果酒的品质。但是，目前的酿酒用酵母菌主要针对葡萄酒，对于水蜜桃没有相适应的酵母菌用于果酒的发酵过程。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一株非酿酒酵母hsmt-1，及其在水蜜桃果酒发酵中的应用并且该酵母菌发酵产生的独特的香气。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一株酿酒用的酵母；其中该非酿酒酵母hsmt-1为毕赤酵母属，已于2020年11月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.21168。

上述非酿酒酵母hsmt-1用于水蜜桃果酒的发酵。

上述非酿酒酵母hsmt-1在水蜜桃发酵过程中产生了独特香味。

本发明筛选出的非酿酒酵母的方法如下所示，包括以下步骤：

(1)取健康新鲜的水蜜桃，略微除去污渍泥土等杂质。将水蜜桃带皮灭菌刀具剁碎，去掉茎根和果核，称取100g分别装入500mL无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃的生化培养箱中2-3d。待有气泡产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。

(2)将所述稀释液均与涂布在YPD培养基上，在28℃的恒温培养箱中生长1-2d，选取出具有典型酵母特征的单菌落，接种到液体培养基中培养。根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到WL培养基上对酵母做进一步纯化(根据分离效果纯化2-3次)，观察酵母的生长状态。

(3)将分离的酵母菌进行发酵速度分析、产气性能分析、产酒精能力分析、香气分析和碳源利用分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。

步骤(1)中，所述的水蜜桃成熟多汁，每颗果实都经过认真筛选，清洗。

在果实破碎过程中都要超净工作台中进行，避免实验结果受到杂菌的污染。

所述步骤(1)中，果实与无菌水的质量比是1:1，保证部分果实表面暴露在空气中。

所述步骤(2)中，稀释过程中酵母在固体培养基中生长不宜密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。发酵和培养温度均为28℃，通风的条件下进行。

所述步骤(3)中，发酵速度分析通过全自动生长曲线分析仪测定，将水蜜桃果汁过滤，灭菌，得到澄清透明的清汁。将清汁稀释到一定的浓度，之后将酵母接种到清汁中，在28℃的条件下生长24h，测定出酵母的生长曲线。

所述步骤(3)中，香气分析如下所示：

(Ⅰ)样品预处理：取10mL水蜜桃果酒发酵液装入顶空瓶中，完全密封，以顶空的方式萃取果酒中的挥发性成分。加热条件为60℃，加热时长30min。

(Ⅱ)气相色谱条件：HP-5MS(30m×0.25μm×0.25mm)色谱柱，载气为高纯氦气，流速为1mL/min，进样口温度为250℃，不分流进样。程序升温开始的柱箱温度为40℃保持2min，先以5℃/min升温至200℃保持5min，再以8℃/min的速率升至300℃保持5min，检测器温度250℃。

(Ⅲ)质谱条件：电离子源(EI)，离子源温度230℃，接口温度180℃，电子能量70eV，四级杆温度150℃，倍增管电压1.2kV，扫描质量范围m/z30-500。

所述步骤(3)中，碳源分析包括：将分离的酵母菌接入不同的碳源培养基中，在28℃培育24h后测定生长曲线，确定能够利用的碳源。上述碳源培养基包括蔗糖、葡萄糖和乳糖。

本发明的有益效果为：

酯香味丰富并且能够产生一定量的乙醇含量，吸引人的味觉。

本发明通过对酵母菌的形态、生理特征等方面进行研究，筛选出一株产酒精能力强，同时能够产生酯类香气为主酵母菌株。由该酵母菌发酵所得的水蜜桃果酒品质优良，产酒精能力较高，酒精含量可以达到6-10％，酸甜适中pH值在3.5-4之间，香气馥郁，酯香味物质占所有挥发性物质80％以上，具有典型的水蜜桃风味。水蜜桃果酒为水蜜桃产业提供一种加工方法延长水蜜桃的供应周期，增加其经济效益。水蜜桃果酒中含有丰富的碳水化合物，抗坏血酸，蛋白质等营养成分，并且铁含量较高，主要具有预防贫血，补气养血，养阴生津的作用，适合饮用。

附图说明

图1为该非酿酒酵母hsmt-1单菌落形态图。

图2为葡糖糖、蔗糖和乳糖的生长曲线对比。

图3为不同酵母菌株产生的香气丰度。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施案例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明实施案例涉及一株酿酒用的酵母，保藏号为CGMCC NO.21168。该酵母被命名为hsmt-1，是从江苏省无锡市阳山镇的水蜜桃表面分离得到的。该菌种已于2020年11月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

本发明实施案例还涉及该酵母菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)取健康新鲜的水蜜桃，略微除去污渍泥土等杂质。将水蜜桃带皮灭菌刀具剁碎，去掉茎根和果核，称取100g分别装入500mL无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃的生化培养箱中2-3d。待有气泡产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。

本发明的一个实施例中，每一个水蜜桃都是认真挑选清洗的，水蜜桃必须是成熟多汁富含水分和糖分。破碎和分装过程中都要在超净工作台中进行，避免在自然发酵过程中受到杂菌的污染。本发明选用的使江苏无锡阳山镇的水蜜桃。

在本发明的一个实施例中，破碎果实与无菌水的质量比为1:1，保证有部分果实暴露在空气中。稀释的作用是使发酵液中的酵母菌含量适中，有利于下一步的初步筛选。

将所述稀释液均与涂布在YPD培养基上，在28℃的恒温培养箱中生长1-2d，选取出具有典型酵母特征的单菌落，接种到液体培养基中培养。根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到WL培养基上对酵母做进一步纯化(根据分离效果纯化2-3次)，观察酵母的生长状态。

YPD培养基成分：蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，琼脂1.5g。WL培养基：酵母粉5g/L，干酪素5g/L，葡萄糖50g/L，KH₂PO₄ 0.55g/L，KCl 0.425g/L，CaCl₂ 0.125g/L，MgSO₄0.125g/L。制备方法：将上述各成分加入1L蒸馏水溶解后，再分装到100mL的锥形瓶中，115℃灭菌20min。

在本发明的一个实例中，步骤(1)和(2)，发酵和培养温度均为28℃，时间为1-2d。

步骤(1)，(2)和(3)是对酵母进行初筛，作用是在培养基中筛选出外观形态不同并产生香气的单一菌落，并对单一菌落中的菌种依次进行发酵速度，产气性能，产酒精能力和产香能力等测试分析，以筛选得到具有最佳性能的酵母菌。上述单菌具有不同形态，其中，菌株hsmt-1菌落为白色圆形，表面褶皱面粉状，边缘完整，表面粗糙不透明；奶油色菌落为椭圆形或卵圆形，边缘完整，表面光滑湿润；其他酵母菌落稍微带点绿色或者红色，形状大致为圆形，表面光滑不透明(如图1所示)。

将分离的酵母菌进行发酵速度分析、产气性能分析、产酒精能力分析、香气分析和碳源利用分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。

在本发明的一个实施案例中，步骤(3)中产期性能分析采用杜氏管发酵法，将分离性能较好的酵母菌株接入到置有杜氏小管的水蜜桃汁培养液中，接种量为1％，在28℃下发酵3d，测定酵母菌的产气量。

其中，水蜜桃汁培养液是由水蜜桃汁，蔗糖和无菌水共同调配而成。水蜜桃汁首先要过滤得到不含渣滓的清汁，加入无菌水到一定的体积，测定糖度然后调节糖度。在80℃的条件下灭菌10min。若制固体培养基，再加入2％的琼脂粉。

根据专业经验得知，如果杜氏管在72h内还没有被酵母菌及其产气充满，发酵度通常无法满足水蜜桃果酒酿造的基本要求，因此相应的菌株可以舍弃，并将发酵较好的菌株进行再次对比筛选。在这过程中发现有4株酵母菌的产气能力比较强，说明其发酵效率和发酵度高。

在本发明的一个实例中，步骤(4)中产酒精能力的分析包括：将分离的酵母菌接入TTC培养基中，在28℃恒温培养箱中生长24h后，观察培养基颜色的变化，TTC试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物。菌落产生的酒精越多，培养基的颜色也就越深，代表着菌株产生酒精的能力也就越强。这一过程可筛选出优良、发酵性能较好的菌株，同时发现该菌株的产香能力较强，适合应用于水蜜桃果酒的发酵。

TTC上层培养基：TTC 0.5g/L，葡萄糖5g/L，琼脂15g/L；TTC下层培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉1.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.4g/L，柠檬酸0.3g/L，琼脂30g/L。在115℃的环境中灭菌20min。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中香气成分分析。

在本发明的一个实施案例中，步骤(3)中，碳源利用分析包括：将分离的酵母菌株接入到不同碳源培养基中，在28℃培育24h后测定酵母的生长曲线，确定能够利用的碳源。碳源培养基包括蔗糖、葡萄糖和乳糖培养基。其中，碳源培养基基液：MgSO₄ 0.2g、(NH₄)H₂PO₄1 g、KH₂PO₄1 g、碳源5g，上述物物质溶于1000mL无菌水中。其中，镁离子是各种代谢中的辅助因子，(NH₄)H₂PO₄为氮源，KH₂PO₄为缓冲剂，上述糖类为碳源。将酵母菌株接种于该培养基液中，酵母菌可利用(NH₄)H₂PO₄作为唯一氮源，某种糖类作为唯一碳源，在培养液中生长并产气。

在实验过程中，发现所筛选的菌株hsmt-1在蔗糖、葡萄糖和乳糖等碳源培养基中变得浑浊，说明该菌株可以很好利用这些碳源。同时发现hsmt-1在蔗糖和葡萄糖作为碳源的条件下生长状态较好，生长速率较快；在乳糖环境下生长相对缓慢，这与研究人员酿酒通常使用蔗糖调糖是符合的。生长曲线如图2所示：

本发明对分离的酵母菌株还进行了感官评价的分析。具体为选择两个菌株，对其酒精度、糖度、感官评价等做出分析，发现这两株菌种长势良好，发酵性能好。在感官评价的过程中主要对菌株的产酒精能力、产香能力等做出科学的评价。在此过程中发现hsmt-1的产酒精能力和产香能力较强，在果酒中有着较高的醇类物质和酯类物质，因此它们具有很好的的利用价值。不同酵母产生的香气物质的丰度如图3所示：

本发明还涉及酵母菌在水蜜桃果酒中的应用。

发酵过程中酒精含量变化：在发酵过程中，水蜜桃果酒中的总糖、乙醇、总酸含量都呈现出了不同的变化。进一步的，水蜜桃果汁的总糖含量10-15％，无法满足成品果酒的要求。按照规定，成品酒中酒精度含量为11-12％，而筛选出来的酵母很难达到这个要求，需要外加酵母再次发酵。首先在水蜜桃果汁中加入一些营养助剂，使得非酿酒酵母能够在水蜜桃汁的环境中生长，加入酵母菌后的发酵的第7天，向其加入10％的糖再加入传统的酿酒酵母。发酵初期，筛选的酵母慢慢增殖不断的产生香味物质，然后酵母渐渐凋亡，此时果酒中的糖类物质仍有很多，这时加入酿酒酵母产酒精能力逐渐增强。在发酵整个过程中随着总糖含量的下降，最后总糖含量为3.2g/L，这说明发酵过程已经完成。在实际生产中需要及时计算酵母中总酸的含量，在发酵中期，总酸含量逐渐上升，同时产生了丙酮酸、乙酸等产物。发酵完成后，水蜜桃果酒酒精含量已经达到11.5％，其中pH为3.12，总酸也达到了6.54g/L，这些指标达到了市场上水蜜桃果酒生产的技术要求。

因此，本发明以水蜜桃果酒为研究对象，将水蜜桃果去核除茎破碎后加入等质量的无菌水，放在室温环境下自然发酵，同时每天早晚各摇一次。将不同编号的酵母分别进行分离纯化，直到长出纯的酵母菌落。对酵母的形态以及生理特征进行科学有效的分析与鉴定，hsmt-1产生的香气能力最强，发酵性能较好，有一定的产酒精能力。在发酵过程中，总糖、乙醇、总酸等都呈现出不同的变化。发酵过程中，也逐渐产生多种酸类物质提高了总酸含量，比如乙酸、丙酮酸等产物，该菌株适合用于水蜜桃果酒的生产。

实施案例1采用hsmt-1菌种单独发酵水蜜桃果酒，对比例1采用商业酵母生产水蜜桃果酒生产水蜜桃果酒。在其他发酵条件相同的情况下，果酒中的成分含量见下表。

表1果酒主要参数对比

从表1可知，将本发明筛选得到的酵母菌应用于水蜜桃果酒的发酵过程，除了酒精度远不及酿酒酵母，残糖量和总酸含量相差不多，但是筛选的酵母富含更多的香气挥发物质，综合果酒的感官评价，hsmt-1有可以利用的价值。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明保护的内容主要包括从水蜜桃上筛选的酵母以及此酵母用于水蜜桃果酒的酿造方法。但本发明的保护范围并不限于此，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围内为准。

菌株鉴定

采用振荡破碎法获得菌株hsmt-1的基因组DNA，通过PCR方法对菌株ITS序列进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增ITS的上游引物ITS1序列为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物ITS4序列为：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR反应条件是：98℃预变性5min，98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，反应30个循环，10℃保持5min。使用NCBI的BLAST功能在GeneBank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：Pichia cephalocereana ITS其序列见序列表。

序列表

<110> 常州大学

江苏碧奥环保科技有限公司

<120> 一株非酿酒酵母hsmt-1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 830

<212> DNA

<213> Pichia cephalocereana

<400> 1

cttatacaca tgcgtgagcg caccaaacac ctaaaattgt aatactacca gtcactaagt 60

tttaacaaaa caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat gaagagcgca 120

gcgaaatgcg atacctagtg tgaattgcag ccatcgtgaa tcatcgagtt cttgaacgca 180

cattgcgccc catggtattc catggggcat gcctgtctga gcgtcgtttc cttcttgcgc 240

aagcagagtt gagaacaggc tatgcctttt tcgaaatgga acgtcgtgga cgaagtgaac 300

taaattttta gcacgctttg gccgccgaac ttttaactaa gctcgacctc agatcaggta 360

ggaatacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagacggagg aatacttatt gatagaaggc 420

acctagtcga gagtgaattg gggtcttcga tccagcaaac agatcctgcc cgctgattta 480

agacgagcct aggtcctttg ggatcgaaat gggacggggc ctcaaagagg tactccatcg 540

cactcgagct taataccgct gaagtgtaga cgtgcaggag tcagcaacgt tcttgttctg 600

aaactggccc tcggcgccaa ggtccaggcg gctgggacgt tgctagcagc gatacccctt 660

gtccttcttg cgccagtgaa aaatgggaaa tgctttttgc catattgcga cggtcgatgc 720

accaagggac cctagatttc ttaacgcttc tatgccgcct atcgtcttaa aaaaaactcg 780

acctcaaatc aaggtaggga atacccgctg aaccttacag catatcaata 830

Claims (4)

1.一株非酿酒酵母hsmt-1，其特征在于，该非酿酒酵母hsmt-1为毕赤酵母属，已于2020年11月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNO.21168。

2.如权利要求1所述的非酿酒酵母hsmt-1的应用，其特征在于，所述非酿酒酵母hsmt-1用于水蜜桃果酒的发酵。

3.如权利要求1所述的该非酿酒酵母hsmt-1的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

（1）取健康新鲜的水蜜桃，略微除去污渍泥土等杂质；将水蜜桃带皮灭菌刀具剁碎，去掉茎根和果核，称取100 g分别装入500 mL无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃的生化培养箱中2-3 d；待有气泡产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液；

（2）将所述稀释液均与涂布在YPD培养基上，在28℃的恒温培养箱中生长1-2 d，选取出具有典型酵母特征的单菌落，接种到液体培养基中培养；根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到WL培养基上对酵母做进一步纯化，观察酵母的生长状态；

（3）将分离的酵母菌进行发酵速度分析、产气性能分析、产酒精能力分析、香气分析和碳源利用分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。

4.如权利要求3所述的该非酿酒酵母hsmt-1的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中，果实与无菌水的质量比是1:1。

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