KR20140080792A - 피치아 구일리엘몬디아이 에스와이46 균주 및 이를 이용한 참다래 와인의 제조 - Google Patents

피치아 구일리엘몬디아이 에스와이46 균주 및 이를 이용한 참다래 와인의 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 내당성, 내알코올성 및 알코올 생성능이 우수한 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 및 이를 이용한 항산화성이 우수하고 향이 우수한 화이트 와인 및 스파클링 와인의 제조방법이 제공된다.

Description

피치아 구일리엘몬디아이 에스와이46 균주 및 이를 이용한 참다래 와인의 제조{Pichia guilliermondii SY46 strain and preparation of Kiwi wine by using the strain}
본 발명은 알코올 생성능을 갖는 피치아 구일리엘몬디아이 SY46(Pichia guilliermondii SY46) 균주 및 이를 이용한 참다래 와인의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세히는 내당성, 내알코올성 및 알코올 생성능이 우수한 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 및 이를 이용한 항산화성이 우수하고 향이 우수한 화이트 와인 및 스파클링 와인의 제조방법에 관한 것이다.
와인은 과일주를 총칭하여 부르는 용어로, 색상에 따라서 레드 와인(red wine), 화이트 와인(white wine), 이산화탄소 가스를 함유하는 스파클링 와인(sparkling wine) 등으로 분류된다. 와인은 대부분의 일반적인 주류와는 달리 알칼리성 식품으로서 체질의 산성화 방지에 유용하며 특히 껍질과 씨를 포함시켜 발효시킨 레드 와인의 경우 혈관 노화 방지 등에 유용한 항산화물질이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있어 우리나라에서도 그 소비량은 지속적으로 증대되고 있다. 한편 와인은 국제사회에서 대화와 사교의 술로서 인식되어 비즈니스 및 사교에 필수적인 존재로 자리매김하고 있으며, 각국 또는 각 지방의 조건 및 특색에 맞는 각기 다른 특성의 와인이 제조되고 있다.
스파클링 와인은 발효가 끝난 탄산가스 없는 일반 와인에 다시 설탕을 추가하여 인위적으로 다시 발효를 유도하여 와인 속에 기포가 발생하도록 만든 것이다. 스파클링 와인은 과일 향과 브리오슈 과자 향이 특징이며, 기포 발생과 톡톡 튀는 맛이 매력적이고, 탄산가스가 들어있기 때문에 발포성 와인이라고 부르며, 그 중 프랑스 샹파뉴 지역에서 생산되는 것만을 특히, 샴페인이라고 부른다.
참다래는 수확 후 후숙을 시켜먹는 과실로서 수확 당시에는 과실이 딱딱하고 아린 맛이 있어 먹기가 곤란해 과육이 연화된 다음에 먹을 수 있는 과실이다. 참다래는 80 mg% 이상의 많은 비타민 C가 함유되어 있으며, 비타민 E 함량도 다른 과실류에 비해 비교적 높을 뿐만 아니라 칼슘, 마그네슘, 인 등의 무기질 함량도 풍부하여 영양학적으로 우수한 과실이다. 참다래는 과육의 색상이 화려하고 헥산알(hexanal)로 대표되는 독특한 향이 있으며, 단맛과 신맛의 조화가 잘 어우러져 있다. 그러나 호흡상승형 과실이므로 저장 및 유통과정 중에 펙틴질이 분해되어 참다래 조직이 급격히 연화되므로 쉽게 상품성을 잃어버리는 단점이 있어 가공품 개발이 활발히 진행되고 있다.
참다래를 이용한 와인 제조는 특허등록 200328호, 특허등록 353479호, 특허등록 873717호, 특허등록 1182843호 및 특허공개 2012-0049965호에 기재되어 있으나, 이들 종래 방법의 참다래 와인 제조는 숙성시킨 참다래 과즙에 통상적인 알코올 발효 효모 균주인 사카로마이세스 속 균주들을 사용하여 제조하고 있다.
이에 사카로마이세스 속 균주 이외에 참다래 와인 발효능을 가지면서도 그 외 기능성을 갖는 대체 균주 개발과 더불어 그것을 이용한 참다래 와인의 제조방법의 개발이 요구되어 왔다.
상기와 같은 종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 내당성, 내알코올성 및 알코올 생성능이 우수한 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 발견/동정하고 이 균주가 사카로마이세스 속 균주들을 대체하여 우수한 특성의 참다래 와인을 제조할 수 있게 한다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 참다래 와인의 제조를 위한 효모 균주로 사용될 수 있는 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 이용하여 참다래 와인을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 참다래 와인 제조를 위한 효모 균주로 사용될 수 있는 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 제공한다.
본 발명자들은 과일로부터 내당성, 내알코올성 및 알코올 발효능이 우수한 균주를 확인/동정하고, 이 균주를 피치아 구일리엘몬디아이 SY46로 명명한 후 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2012년 10월 24일에 수탁번호 KACC93159P를 부여받았다 (실시예 1).
피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주의 26S rDNA 염기서열 (도 1)을 결정하였고 이를 기초로 하여 BLAST 네트워크 서비스와 DNA 서열 데이터베이스를 제공하는 미국국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 다른 균종의 26S rDNA 염기서열과 정렬하여 피치아 속에 속함을 알 수 있었다 (도 2).
피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주는 당농도 30%에서 OD600nm 10 이상의 생육성, 알코올 농도 10%에서 OD600nm 3 이상의 생육성을 나타냈고, 참다래 과즙에서 11.2%(v/v)의 알코올 발효능을 가졌다 (도 3a, 도 3b 및 도 4).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 알코올 발효 균주로 사용하는 것을 특징으로 하는 참다래 와인의 제조방법이 제공된다. 제조되는 참다래 와인의 종류로는 화이트 와인 및 스파클링 와인이 있다.
본 발명에 따른 참다래 와인의 제조방법은
i) 참다래 과즙을 얻는 단계;
ii) 참다래 과즙을 22 ~ 26 브릭스(brix)로 보당하는 단계; 및
iii) 보당된 참다래 과즙에 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 접종하여 15 ~ 20℃에서 90 ~ 120일간 발효시켜 화이트 와인을 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 참다래 와인의 제조방법은, 필요에 따라서, 단계 iii)으로부터의 화이트 와인을 여과하여 와인병에 충전하는 단계 (단계 iii'))를 추가로 포함할 수 있다.
스파클링 와인을 제조하기 위해서는 단계 iii)으로부터의 화이트 와인에 다음과 같은 단계들을 추가한다:
iv) 화이트 와인에 설탕을 2 ~ 4%를 추가 첨가하여 보당하는 단계;
v) 보당된 화이트 와인을 내압병에 병입하고 크라운닝(crowning)하는 단계;
vi) 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 접종하여 15 ~ 20℃에서 60 ~ 90일간 발효시켜 탄산가스 압력이 6 ~ 8 kg/cm2 이르게 하는 단계;
vii) 내압병을 도치하여 병구 주위에 찌꺼기를 모은 후 병구 주위를 급랭시켜 찌거기를 응집시켜 하방으로 드레인(drain)해서 제거하는 단계; 및
viii) 코르크 마개로 병구를 막고 고정하는 단계.
단계 i) & ii ) 참다래 과즙 제조 및 보당
참다래를 흐르는 물에 3회 세척한 후 물기를 제거하고 6 ~ 10℃에서 15 ~ 20일 후숙시킨 것을 사용하는 것이 바람직하다. 참다래는 후숙에 의해 당도가 높아진다.
후숙된 참다래를 원심분리형 믹서기로 파쇄하여 참다래 과즙을 얻는 후 당을 가하여 22 ~ 26 브릭스로 보당하였다.
22 브릭스 미만이면 알코올 생성량이 적으며, 26 브릭스 초과시에는 삼투압성의 증가로 알코올 생성량이 감소한다.
단계 iii ) 화이트 와인 발효
피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주는 2.5% ~ 5.0%(v/v)로 접종한다.
발효 조건은 15 ~ 20℃의 온도에서 90 ~ 120일간 발효시킨다. 15℃ 미만에서는 발효 속도가 지연되며, 20℃ 초과에서는 발효 속도는 증가하나, 산패 등이 일어날 수 있다. 90일 미만의 기간이면 알코올 생성력과 풍미가 충분하지 않으며, 120일 초과의 기간이면 산패 등이 일어날 수 있다.
단계 iii ) 여과 및 충전
필요에 따라서, 여과는 마이크로 필터를 이용하며, 와인병에 충전은 통상의 방법에 의한다.
단계 iv ) 추가 보당
제조된 화이트 와인에 당을 2 ~ 4% 를 추가 첨가하여 보당한다.
2% 미만이면 탄산가스(CO2)의 생성력이 적으며, 4% 초과이면 삼투압 증가로 효모 생육에 영향을 미칠 수 있다.
단계 v) 내압병 병입
보당된 화이트 와인을 내압병에 병입하고 크라운닝(crowning)한다.
내압병은 통상의 스파클링 와인 제조에 사용되는 것을 사용한다. 병입 및 크라운닝 과정은 통상의 방법으로 한다.
단계 vi ) 스파클링 와인 발효
피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주의 접종량은 2.5% ~ 5.0%(v/v)로 접종한다.
스파클링 와인 발효는 15 ~ 20℃의 온도에서 60 ~ 90일간 발효시켜 탄산가스 압력이 6 ~ 8 kg/cm2 이르게 한다.
15℃ 미만에서는 탄산가스 생성력이 지연되며, 20℃ 초과에서는 탄산가스보다 알코올 생성력이 우수하게 된다. 60일 미만의 기간이면 탄산가스가 6 kg/cm2 이하로 생성되며, 90일 초과시 탄산가스가 8 kg/cm2 로 유지되어 더 이상의 발효는 필요가 없다.
탄산가스 압력이 6 kg/cm2 미만이면 청량감이 부족하며, 8 kg/cm2 초과이면 삼투압병이 내압을 견딜 수 없다.
단계 vii ) 찌거기 제거
내압병을 도치하여 병구 주위에 찌꺼기를 모은 후 병구 주위를 4℃ 이하로 급랭시켜 찌거기를 응집시켜 하방으로 드레인(drain)해서 제거한다.
필요에 따라서, 제거된 양 만큼의 신선한 다래와인으로 보충할 수 있다.
단계 viii ) 병구 패쇄
코르크 마개로 병구를 막고, 스파클링 와인 내의 탄산가스 압력에 견딜 수 있도록 철사 줄 등으로 고정하여 스파클링 와인을 완성한다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 참다래 와인은 통상의 알코올 발효인 사카로마이세스 세레비아제 균주로 제조한 참다래 와인에 필적하는 맛과 향을 지니고 있을뿐 아니라 (표 2), 항산화 활성이 더 우수하였다 (도 5a ~ 도 5d).
또한 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 스파클링 와인은 참다래의 과일 향을 지니며, 특유의 상큼하고 청량감 있는 부드러운 맛과 상큼한 뒷맛을 지녔다 ( 표 2).
본 발명의 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주는 와인 주조성 특성을 지녀서 종래의 와인 제조용 효모 균주인 사카로마이세스 세레비아제 균주를 대체하여 우수한 특성의 참다래 와인을 제조할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 참다래 와인은 항산화 활성이 특히 우수하다.
본 발명에 따른 스파클링 와인은 참다래의 과일 향과 상큼하고 청량감 있는 부드러운 맛과 상큼한 뒷맛의 뛰어난 기호성을 부여한다.
도 1은 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주의 26S 라이보좀 DNA 염기서열이다.
도 2는 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주의 계통발생학적 유연관계도다.
도 3은 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주와 대조구 균주의 내당성과 내알코올성을 나타낸다. 도 3a는 내당성을 나타내고, 도 3b는 내알코올성을 나타낸다.
도 4는 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주와 대조구 균주의 알코올 생성능을 나타낸다.
도 5는 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주와 대조구 균주의 항산화 활성을 나타낸다. 도 5a는 수용성 페놀릭스 함량을 나타내고, 도 5b는 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내고, 도 5c는 ABTS 라디칼 소거활성을 나타내고, 도 5d는 환원력을 나타낸다.
도 6은 다래 과즙, 본 발명에 따른 참다래 와인 및 스파클링 와인의 수용성 페놀릭스와 항산화 활성을 비교한 것이다. 도 6a는 수용성 페놀릭스 함량을 나타내고, 도 6b는 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내고, 도 6c는 ABTS 라디칼 소거활성을 나타내고, 도 6d는 환원력을 나타낸다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
실시예 1: 균주 분리 및 특성 확인
본 발명자들은 배, 포도, 망고 및 바나나로부터 효모 균주를 다음과 같이 순수 분리했다: 표피를 포함한 약 10 g의 각각의 과일을 클로람페니콜(chlorampehnicol, 1.5 mg/mL)이 함유된 100 mL YPD (Yeast extract 5 g, peptone 5 g, dextrose 20 g, distilled water 1000 mL) 액체배지에서 넣고 25℃ 에서 48시간 동안 집식배양한 후 배양액 각각 1 mL 취하여 9 mL의 멸균증류수로 106~109으로 희석하고 이를 클로람페니콜(1.5 mg/mL)이 함유된 YPD 한천배지에 도말하여 30℃ 에서 48 ~ 72시간 동안 배양하여 전형적인 효모 클로니를 새 YPD 한천배지 순수 분리하여 30℃ 에서 48시간 배양하였다.
1차 순수분리된 142 균주에 대해 당 농도 30%와 알코올 농도 10%에서 일차적으로 선발하여 최종적으로 당 내성, 알코올 내성, 알코올 생성능 및 항산화 활성을 시험한 후 이들 모든 특성을 고려하여 분리된 균주들 중에서 SY46로 칭한 균주를 선별하게 되었다.
대조구로서 통상의 와인 제조에 사용되어 오던 사카로마이세스 세레비아제 KCCM16824를 사용하여 동일하게 시험하였다.
당 내성 측정은 PDB (potato dextrose broth, Becton & Dicknson사, USA) 액체배지에 0, 10, 20 및 30% 설탕을 첨가하고 각각의 균주를 5.0%(v/v)로 첨가한 후 37℃ 에서 48시간 액체배양한 후 흡광도(600nm)를 측정하여 균주 생육 정도를 결정하였고 그 결과를 도 3a에 나타냈다.
알코올 내성 측정은 PDB 액체배지에 0, 5, 10 및 15% 알코올을 첨가하고 각각의 균주를 5.0%(v/v)로 첨가한 후 37℃ 에서 48시간 액체배양한 후 흡광도(600nm)를 측정하여 균주 생육 정도를 결정하였고 그 결과를 도 3b에 나타냈다.
알코올 생성능은 24 브릭스로 보당한 참다래 과즙에 각각의 균주를 5.0%(v/v)로 접종한 후 20℃ 에서 30일간 발효시켜 알코올 생성능을 결정하고 그 결과를 도 4에 나타냈다.
실시예 2: 균주 동정 및 기탁
선별된 SY46 균주를 PDB 5 ml의 액체배지에 2.5%(v/v)로 접종하고 48시간 배양한 후 1.5 ml 원심분리 튜브에 약 1.25 ml 정도 취한 후 원심분리하여 균체를 모집하고 DNAzol kit(Invtrogen사, USA)를 이용하여 균주의 게놈 DNA를 분리했다.
분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 94℃ 에서 1분간 변성, 52℃ 에서 30초간 풀림, 72℃ 에서 30초 신장으로 30회 수행하여 26S rDNA (0.6 kb 단편)을 증폭했다. 증폭된 26S rDNA PCR 산물을 1% 아가로스에서 전기영동하고 0.6 kb 단편을 회수 및 정제한 후 pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA)를 사용하여 클로닝하고 대장균(Escherichia coli) DH5에 형질전환 후, 형질전환체를 무작위로 선정하여 순수 분리하고 순수 분리된 형질전환체를 50 g의 앰피실린 함유된 LB (Luria-Bertani broth, Becton & Dicknson사, USA) 액체배지에 접종하여 37℃ 에서 16시간 배양한 후 균체를 모집하고 플라스미드 정제 Kit (Intron, Suwon, Korea)에 기술된 대로 플라스미드를 분리 정제했다. 분리된 플라스미드를 서열 결정 주형가닥으로 사용하였다. 핵산 염기서열은 PRISM Ready Reaction Dye terminator/primer cycle sequencing kit를 사용한 디데옥시 사슬 종결법을 이용하여 분석하여 그 염기서열 639 bp를 결정하였다 (도 1). 이 26S rDNA 염기서열은 BLAST network service와 DNA sequence database를 제공하는 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 다른 균들의 것과 상동성을 분석하여 최종 동정했다 (도 2).
이와 같이 동정된 균주를 피치아 구일리엘몬디아이 SY46로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 특허균주를 기탁하여 2012년 4월 11일자로 기탁번호 KACC93119P를 부여받았다.
실시예 3: 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 를 이용한 참다래 화이트 와인 및 스파클링 와인의 제조
<화이트 와인>
참다래를 흐르는 물에 3회 세척한 후 물기를 제거하고 6 ~ 10℃에서 15 ~ 20일 후숙시킨 후, 원심분리형 믹서기로 파쇄하여 참다래 과즙을 얻는 후 설탕을 가하여 24 브릭스로 보당하였다.
실시예 2에서 선별된 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 YPD 액체배지 100 mL에 2.5%(2.5 mL) 접종하여 30℃ 에서 48시간 배양했다. 이 배양액을 24 브릭스로 보당된 참다래 과즙 2,000 mL에 5.0%(100 mL)을 접종한 후, 15 ~ 20℃ 에서 120일간 발효시켜 참다래 화이트 와인을 제조하였다.
<스파클링 와인>
위와 같이 제조된 화이트 와인 750 mL에 설탕을 30 g(4%)를 첨가하여 보당한 후 내압병에 병입하고 크라운닝(crowning)하고 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 5.0%(37.5 mL) 접종하여 15 ~ 20℃ 에서 90일간 발효를 진행시켜 탄산가스 압력이 6 kg/cm2 이상 이르게 하였다.
병을 도치하여 병구 주위에 찌꺼기를 모은 후 병구 주위를 급랭시켜 찌거기를 응집시켜 하방으로 드레인(drain)해서 제거하고 제거된 양만큼 신선한 참다래와인으로 보충하였다.
코르크 마개로 병구를 막고, 스파클링 와인 내의 탄산가스 압력에 견딜 수 있도록 철사줄로 고정하여 스파클링 다래와인을 제조하였다.
이와 같이 제조된 본 발명에 따른 참다래 화이트와인 및 스파클링 와인의 이화학적 특성 및 알코올 함량은 표 1과 같다.
조사 항목
pH
 산도
(%, 젖산)		 환원당
(g/L)		 알코올
(%, v/v)
참다래 과즙
(발효전)		 3.73
 2.20
 199.58
 0
화이트 와인
 3.80
 2.80
 9.99
 11.4
스파클링 와인
 3.77
 2.91
 26.21
 11.2
주) 모든 실험은 삼반복 수행하였음.
<다래와인의 이화학적 특성 및 알코올 함량>
(주)오름주가 직원 및 경남과학기술대학교 직원, 학생 20명을 대상으로 5점 척도법으로 기호성을 평가하였으며 그 결과를 표 2에 나타냈다. 본 발명 균주인 피치아 구일리엘몬디아이 SY46로 제조한 화이트 와인과 스파클링 와인이 맛과 향, 기호도가 높았다.
조사 항목
맛 색 향 기호도
화이트 와인
(KCCM16824)		 3.6
 3.8
 3.6
 3.6
화이트 와인
(SY46)		 4.2
 3.9
 4.0
 4.2
스파클링 와인
(KCCM16824)		 3.8
 3.9
 4.0
 3.8
스파클링 와인
(SY46)		 4.0
 3.9
 4.2
 4.3
주) 모든 실험은 삼반복 수행하였음.
<다래와인의 기호성 평가>
실시예 4: 항산화 활성
참다래 과즙 (발효전)과 실시예 3에서 제조된 참다래 화이트 와인 및 스파클링 와인에 대해서 수용성 페놀릭스 함량과 항산화 활성을 확인하였다.
수용성 페놀릭스 함량은 Folin-Ciocalteu 법으로 측정하였고 항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼(2,2`-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid 양이온) 소거활성, 환원력(FRAP, Ferric Reducing Antioxidant Power) 활성을 분석하여 검정하였다(도 6a ~ 도 6d ).
수용성 페놀릭스 함량은 다음과 같이 측정하였다: 와인 여과액을 0.45 ㎛ 필터하여 3차 증류수로 20배 희석한 후 0.5 mL을 시험관에 분주하고 25% Na2CO3 용액 0.5 mL을 첨가하여 3분간 정치시켰다. 다시 2N-Folin-Ciocalteu 페놀 시약 0.25 mL 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 동안 정치시켜 발색시켰다. 발색된 청색을 분광광도계(Spectronic 2D)를 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀릭스 함량은 갈릭산(gallic acid)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 갈릭산을 이용한 표준곡선은 갈산의 최종 농도가 0, 25, 50, 100 mg/1이 되도록 하여 위와 같은 방법으로 750nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과를 도 6a에 나타냈다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 참다래 과즙에 비하여 본 발명으로 제조된 참다래 화이트 와인 및 스파클링 와인의 수용성 페놀릭스 함량이 높았다.
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, sigma D9132, FW 393.4 C18H12N5O6)는 매우 안정한 라디칼로서 525nm에서 특정 흡광도를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH 라디칼 소거활성을 측정하여 항산화성을 확인하였다. 구체적으로는 와인 여과액을 0.45 ㎛ 필터하여 3차 증류수로 10배 희석하여 시료를 제조하였다. 시료 0.2 mL에 에탄올로서 1.5×10-4M 농도가 되게 한 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 0.8 mL씩을 보텍스(vortex)로 균일하게 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한 후 525nm에서 흡광도(O.D.)를 측정하였다. 음성 대조구 실험은 시료 대신에 증류수를 0.2 mL를 취하여 실험하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시했으며, 그 결과를 도 6b에 나타냈다:
DPPH 라디칼 소거활성(%)
= [1-(음성 대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 6b에 나타난 바와 같이, 참다래 과즙에 비하여 본 발명으로 제조된 참다래 화이트 와인 및 스파클링 와인의 DPPH 라디칼 소거활성이 높았다.
ABTs 라디칼 소거활성은 2-아지노-비소의 색을 띤 라디칼의 감소 정도에 따라 항산화능을 검사하는 방법이다. 즉 이 방법은 시료와 표준물질 (trolox, 6- hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)의 값과 비교하여 항산화능을 측정하는 방법으로서, 시료의 항산화력에 의해 ABTS 양이온(ABTs+)이 소거되어 청록색으로 탈색되는데, 이때 ABTS 양이온(ABTs+)의 제거 정도를 흡광도를 측정함으로서 알 수 있고, 탈색반응이 1분 내에 종료되므로 짧은 시간에 측정이 가능하다.
구체적으로 7 mM ABTS 시약(sigma 1888) 5ml과 140 mM K2S2O8 (FW 270.3, sigma 9392) 5 ml을 섞어 어두운 곳에 14 ~ 16시간 방치시킨 후, 이를 무수 메탄올과 약 1:88 비율로 섞어 732nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7 ± 0.02가 되도록 조절한 ABTS 용액을 사용하였다. 와인 여과액을 0.45 ㎛ 필터하여 3차 증류수에 20배 희석하여 시료를 제조하였다. 각각의 시료 0.1 mL과 ABTS 용액 0.9 mL를 혼합하여 30초간 진탕한 후 3분간 반응시키고 732nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조구 실험은 비타민 C를 사용하였다. 음성대조구 실험은 시료 대신에 80% 메탄올로 실험하였다. ABTS 라디칼 소거활성은 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시하였으며, 그 결과를 도 6c에 나타냈다:
ABTs 라디칼 소거활성(%)
= [1-(음성 대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 6c에 나타난 바와 같이, 참다래 과즙에 비하여 본 발명으로 제조된 참다래 화이트 와인 및 스파클링 와인의 ABTS 라디칼 소거활성이 높았다.
환원력 분석은 FRAP를 기초로 한 Liu 등의 방법을 응용하여 측정하였다. FRAP 환원력 분석에서는 반응액으로는 300 mM 아세테이트 완충액(pH 3.6), 40 mM 염산에 녹인 10 mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ, T1253, C18H12N6, MW312.33) 및 20 mM FeCl3(F7134, MW 162.20)를 준비하였으며, 아세테이트 완충액, TPTZ 용액 및 FeCl3 용액을 10:1:1 (v/v/v)로 혼합하여 37℃ 에서 15분간 예비반응을 시켜두었다. 와인 여과액을 0.45 ㎛ 필터하여 3차 증류수에 10배 희석하여 시료를 제조하였다. 시료 0.1 mL과 예비 반응된 FRAP 시약 0.9 mL을 96-웰 플레이트에 분주한 후 15분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더(Biorad 3055, Sweden)를 사용하여 590nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 6d에 나타냈다.
도 6d에 나타난 바와 같이, 참다래 과즙에 비하여 본 발명으로 제조된 참다래 화이트 와인 및 스파클링 와인의 환원력이 높았다.
상기의 결과로부터 본 발명에 따라 제조된 참다래 화이트 와인 및 스파클링 와인은 우수한 항산화 활성을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 5: 종래 균주를 사용하여 제조된 참다래 와인의 항산화 활성과 비교
24 브릭스로 보당한 참다래 과즙 100 ml에 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주와 대조구로서 통상의 와인 제조에 사용되어 오던 사카로마이세스 세레비아제 KCCM16824 균주를 5.0%(v/v)로 첨가한 후 20℃ 에서 30일간 발효시킨 발효액을 원심분리하여 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여, 실시예 4에 기재된 방식으로, 수용성 페놀릭스(phenolics) 함량, DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성 및 환원력을 측정하여 그 결과를 도 5a ~ 도 5d에 나타냈다.
도 5a ~ 도 5d에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 피치아 구일리엘몬디아이 SY46 균주를 사용하여 제조된 참다래 와인이 사카로마이세스 세레비아제 균주를 사용하여 제조된 참다래 와인에 비하여, 수용성 페놀릭스 함량이 높고, DPPH 라디칼 소거활성, ABTs 라디칼 소거활성 및 환원력이 향상되었다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93159P 20121024

Claims (7)

  1. 참다래 와인 제조를 위한 효모 균주용 피치아 구일리엘몬디아이 (Pichia guilliermondii) SY46 KACC93159P 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 당 농도 30%에서 OD600nm 10 이상의 생육성, 알코올 농도 10%에서 OD600nm 3 이상의 생육성, 및 11.0%(v/v) 이상의 알코올 발효능을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 참다래 화이트 와인의 제조방법으로,
    i) 참다래 과즙을 얻는 단계;
    ii) 참다래 과즙을 22 ~ 26 브릭스(brix)로 보당하는 단계; 및
    iii) 보당된 참다래 과즙에 제1항에 따른 균주를 접종하여 15 ~ 20℃에서 90 ~ 120일간 발효시켜 화이트 와인을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 참다래 스파클링 와인의 제조방법으로,
    i) 참다래 과즙을 얻는 단계;
    ii) 참다래 과즙을 22 ~ 26 브릭스(brix)로 보당하는 단계;
    iii) 보당된 참다래 과즙에 제1항에 따른 균주를 접종하여 15 ~ 20℃에서 90 ~ 120일간 발효시켜 화이트 와인을 생성하는 단계;
    iv) 화이트 와인에 설탕을 2 ~ 4%를 추가 첨가하여 보당하는 단계;
    v) 보당된 화이트 와인을 내압병에 병입하고 크라운닝(crowning)하는 단계;
    vi) 제1항에 따른 균주를 접종하여 15 ~ 20℃에서 60 ~ 90일간 발효시켜 탄산가스 압력이 6 ~ 8 kg/cm2 이르게 하는 단계; 및
    vii) 내압병을 도치하여 병구 주위에 찌꺼기를 모은 후 병구 주위를 급랭시켜 찌거기를 응집시켜 하방으로 드레인(drain)해서 제거하는 단계; 및
    viii) 코르크 마개로 병구를 막고 고정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 따른 방법으로 제조된 항산화활성이 향상된 참다래 화이트 와인.
  6. 제 4항에 따른 방법으로 제조된 항산화활성이 향상된 참다래 스파클링 와인.
  7. 제 3항에 있어서, iii') 화이트 와인을 여과하여 와인병에 충전하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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