CN113215006A - 一株毕赤酵母菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株毕赤酵母菌及其应用。属于食品发酵技术领域。毕赤酵母菌的保藏编号为CGMCC No.21173，分类命名为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)Y50，以及该毕赤酵母在制备鲊辣椒中的应用。将其制备鲊辣椒的方法为：通过响应面法优化发酵工艺和恒温发酵得到鲊辣椒产品。本发明丰富了酵母菌菌种的资源库，同时通过植物乳杆菌和毕赤酵母菌Y50进行鲊辣椒发酵，相对于传统自然发酵的鲊辣椒或单一乳杆菌发酵的鲊辣椒，其产品香气更加浓郁，风味宜人，且可缩短鲊辣椒的生产周期，提高生产效率和发酵成功率，且可进一步提高产品安全性和整体的风味品质，在辣椒发酵领域具有推广应用价值。

Description

一株毕赤酵母菌及其应用

技术领域

本发明涉及食品发酵技术领域，具体涉及一株毕赤酵母菌及其应用。

背景技术

毕赤酵母菌，全称为库德里阿兹威毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其他酵母一样，在无性生产期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。现有报道用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原，以及将毕赤酵母菌应用于制备病害抑制剂等。但将毕赤酵母菌应用于辣椒发酵未见报道。

辣椒被称为“蔬菜之王”，富含辣椒素类物质、辣椒红素、矿物质、维生素、脂肪油、挥发油、色素、有机酸等多种营养保健成分。在我国，辣椒种植面积大、产量高，且我国辣椒食用人群已遍布全国各地，为了满足四季食用辣椒的需求，人们将辣椒加工成不同风味的辣椒制品。

鲊辣椒是川、渝、鄂、湘、黔等地区的一种传统特色发酵食品，是以破碎的鲜辣椒、玉米粉或大米粉为主要原料，加一定的辅料混匀后自然发酵而成。香味独特，酸辣可口，是人们喜爱的佐餐食品。但国内著名的辣椒初级加工企业均没有生产和推广鲜辣椒产品，其主要原因为鲊辣椒生产工艺不成熟，因而难以进行工艺化生产。

目前，鲊辣椒仍以自然发酵(传统腌制法)为主，家庭自产和小作坊少量生产。传统自然发酵法主要依靠辣椒表面存在的微生物(主要是乳杆菌)进行发酵产酸以及其它风味物质，但每批次得到的鲊辣椒品质不一，且安全性无保证。同时，传统自然发酵鲊辣椒的发酵周期长，生产效率低，且发酵不易控制，杂菌污染严重，甚至直接造成发酵失败。另外，采用乳杆菌纯种发酵，还存在所发酵的成品鲊辣椒风味单一、香气不浓郁等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株毕赤酵母菌及其应用。

为达到上述目的，本案发明人经长期研究和大量实践，得出本发明技术方案，具体如下：

1、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)Y50，保藏编号为CGMCCNo.21173。

本发明中的库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)Y50于2020年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.21173。

本发明中应用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，为实验室从自然发酵的鲊辣椒制品中筛选分离出来的常规植物乳杆菌。筛选方法参见文献：钟燕青，夏延斌.自然发酵辣椒中一株乳杆菌的分离筛选及鉴定[J].农产品加工(学刊)，2011(11)。

2、毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用。

优选的，所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，包括以下步骤：

原料预处理：将辣椒摘除蒂柄，在盐水中浸泡，清水冲洗后晾干，破碎，加入等量的生玉米粉和水，得混合物料；

发酵：在混合物料中，加入重量百分含量为3％～6％的食盐和重量百分含量为3％～6％的生姜和大蒜，接入重量百分含量为1％～4％的毕赤酵母菌Y50培养物和重量百分含量为1％～4％的乳杆菌培养物，搅拌均匀，在25～32℃条件下，进行厌氧发酵4～10天，即可。

优选的，所述盐水的浓度为5％～10％，盐水中浸泡的时间为15min。

优选的，所述生玉米粉为过40～100目筛子的生玉米粉。

优选的，所述混合物料中，辣椒与加入的大蒜的质量比为25：1～2。

优选的，所述混合物料中，辣椒与加入的生姜的质量比为25：1～2。

优选的，所述搅拌的转速为100～150rpm。

优选的，所述毕赤酵母菌Y50培养物的制备方法为：将葡萄糖、蛋白胨、酵母膏和水，按质量比计为1～4：1～4：1～2：96～200进行混合，匀浆，灭菌，冷却至室温，得到毕赤酵母菌Y50培养基；然后向培养基中，接入毕赤酵母菌Y50菌种，恒温振荡培养，得到毕赤酵母菌Y50培养物。

优选的，所述毕赤酵母菌Y50培养物中毕赤酵母菌Y50的浓度为0.5×10⁷～1×10⁷cfu/g。

优选的，所述恒温振荡培养的温度为30～32℃，转速为150～180r/min，振荡培养的时间为18～24h。

优选的，所述乳杆菌培养物的制备方法为：牛肉粉、蛋白胨、酵母浸出汁粉、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵、吐温80、硫酸镁、硫酸锰和水，按质量比计为10～20：5～10：20～40：5～10：2～5：0.1～0.5：0.58～2.00：0.28～0.80：1000～2000进行混合，匀浆，灭菌，冷却至室温，得到乳杆菌培养基；然后向培养基中，接入乳杆菌菌种，静止培养，得到乳杆菌培养物。

优选的，所述的乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

优选的，所述乳杆菌培养物中乳杆菌的浓度为3×10⁸～5×10⁸cfu/g。

优选的，所述静止培养的温度为35～37℃，静止培养的时间为18～24h。

3、上述的毕赤酵母菌Y50制得的鲊辣椒。

本发明的将毕赤酵母菌Y50和乳杆菌混合发酵的鲊辣椒：在发酵过程中，毕赤酵母菌Y50以鲊辣椒基料，发酵产生香气物质，提升鲊辣椒香气的丰富度；同时，乳杆菌以鲊辣椒基料进行乳酸发酵，赋予鲊辣椒柔和的酸味。

本发明采用混合菌种发酵制得的鲊辣椒，该鲊辣椒经化学法检测，发酵鲊辣椒中的总酸含量为0.75～1.11g/100g，总酯含量为35～37mg/g；经气相色谱质谱法检测，发酵鲊辣椒中的β-紫罗兰酮的含量为38.48～46.94μg/kg，愈创木酚的含量为22.75～27.89μg/kg；(+)-柠檬烯的含量为1537.06～1654.62μg/kg，β-石竹烯的含量为340.47～356.39μg/kg，癸酸乙酯的含量为 98.52～100.74μg/kg，十一酸乙酯的含量为12.58～12.96μg/kg，月桂酸乙酯的含量为 76.58～82.6μg/kg。

本发明的有益效果：

1)本发明从自然发酵的鲊辣椒中筛选出了具有产香，产酯优质的毕赤酵母菌Y50，不仅丰富了毕赤酵母菌菌种资源库，扩宽了毕赤酵母菌在食品领域中的应用，也为鲊辣椒的制备提供了新的发酵方法；

2)本发明的采用毕赤酵母菌Y50与乳杆菌混种发酵的鲊辣椒的制备方法，采用毕赤酵母菌Y50进行鲊辣椒发酵，可以产生多种香气物质和产酯优质，相对于自然发酵(即传统腌制) 的鲊辣椒或单一乳杆菌发酵的鲊辣椒，其产品香气更加浓郁，风味令人愉悦；

3)本发明的采用混合菌种发酵的鲊辣椒的制备方法，采用人工接种植物乳杆菌进行鲊辣椒强化发酵，相对于传统发酵的鲊辣椒，不仅可以确保产品的安全性，还可以缩短发酵周期，提高生产效率和发酵成功率，且产品酸味更易控制，使产品整体风味更加协调，产品风味品质得到明显改善和提高，能满足市场对鲊辣椒品质的要求；

4)本发明制得的鲊辣椒，辣椒红色鲜艳，玉米粉金黄，具有光泽。辣椒和玉米粉颗粒大小合适，分布均匀，且整体呈亮黄色；咸淡适中，酸辣适口，后味饱满，余味悠长；具有鲊辣椒特有的适当的酸味和醇香味，香气浓郁，在食品发酵技术领域，具有推广应用价值。

附图说明

图1为本发明的毕赤酵母菌Y50菌株的细胞形态图；

图2为本发明实施例1中电子鼻的检测结果图；

图3为本发明的毕赤酵母菌Y50菌株26S rDNA凝胶电泳图(A)和系统发育树(B)图；

图4为本发明实施例2中乳杆菌XZ3和XZ4菌株的形态图；

图5为本发明实施例2中乳杆菌XZ3和XZ4菌株的革兰氏染色镜检结果图；

图6为本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的工艺流程图；

图7为本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的制备方法中，混菌比例和混菌添加量对鲊辣椒感官评价影响的响应曲面图；

图8为本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的制备方法中，混菌比例和食盐添加量对鲊辣椒感官评价影响的响应曲面图；

图9为本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的制备方法中，混菌比例和发酵时间对鲊辣椒感官评价影响的响应曲面图；

图10为本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的制备方法中，食盐添加量和混菌添加量对鲊辣椒感官评价影响的响应曲面图；

图11为本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的制备方法中，发酵时间和混菌添加量对鲊辣椒感官评价影响的响应曲面图；

图12为本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的制备方法中，发酵时间和食盐添加量对鲊辣椒感官评价影响的响应曲面图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明进行详细的描述，应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1

1、酵母菌的筛选

从重庆北碚获得自然发酵鲊辣椒作为样品，取1g自然发酵鲊辣椒样品于30mL无菌水中，充分震荡混匀进行10倍梯度稀释，吸取0.1mL(10^-3、10^-4、10^-5样品稀释液)涂布于YPD平板培养基上，30℃恒温培养24h。选取疑似酵母菌的单菌落镜检，将符合酵母形态描述的菌株接种于WL营养琼脂培养基，30℃恒温培养3d，根据WL培养基变色情况挑取不同的酵母菌落，并在荧光正置显微镜下观察细胞形态。观察后在培养基上挑起少许不同形态单菌落溶于10m L无菌水中，吸取0.1mL涂布接种于YPD平板培养基上，在30℃下培养48h进行纯化分离2-3次，并将得到的菌种进行甘油保藏。

经过多次平板分离和荧光正置显微镜检查，结合WL筛选培养基颜色变化从鲊辣椒中共筛得9株酵母，编号分别为Y3、Y11、Y19、Y20、Y21、Y26、Y28、Y32、Y50。Y3菌落乳白色，大而厚不透明，表面具有精致的纹状条纹，中部隆起。Y11、Y19、Y21、Y26、Y32 菌落乳白色，大而厚不透明，表面光滑有反光至暗淡，菌落圆形隆起，外围平坦成帽缘状。 Y20、Y50菌落乳白色，表面光滑，菌落圆形隆起至菌落中央隆起，外围平坦。其中，Y50 菌株的细胞形态(×100)如图1所示，从图1中观察分析可知，Y50菌株的细胞呈腊肠形，细胞出芽后与母细胞形成有分枝的短链。

2、酵母菌产香特性的研究

取2ml分离纯化得到的酵母菌菌液(10⁷CFU/mL)分别接种到100mL YPD液体培养基中，以不接菌作空白对照，置于30℃培养箱中，150r/min振荡培养24h。采用嗅闻法对发酵液进行感官评定，排除产香能力较弱及产不良气味的菌株，并采用回流皂化法测定总酯含量。

产酯和香气评价结果如表1所示，总酯含量最高的为菌株Y50，总酯达37.7mg/g，香气最强烈，呈现多种香气特征。其次是Y11、Y19、Y26、Y21，均高于对照组的产酯量。排除有异味、不产香的Y3、Y20、Y32以及产香能力差的Y28，总酯仅23.0mg/g。因此选用Y11、 Y19、Y21、Y26、Y50菌株作为产酯优质菌株继续试验。

表1筛选菌株产酯情况和香气评价

注：“-”表示含量极低或未检出。

3、酵母菌的发酵特性

①酵母菌对NaCl的耐受性

将产香，产酯优质的酵母Y11、Y19、Y21、Y26、Y50涂布在含不同质量分数(3％，6％，9％，12％，15％)NaCl的YPD培养基上，30℃下培养1周，对照不含NaCl的培养基，观察其他培养皿菌落是否生长及生长情况，结果如表2所示。其中，高浓度NaCl具有较高渗透压，会使酵母细胞内水分活度、细胞结构及组成发生变化，导致菌体内的酶受到破坏，从而抑制酵母的发酵性能。

表2不同酵母菌的耐受试验结果

从表2中分析可知，5株产香酵母菌均能在6％的NaCl培养基上生长，Y11、Y19、Y50能承受质量分数9％的NaCl培养基。而市售鲊辣椒的NaCl含量均在5％以下。从而证明了，这5株产香，产酯优质的酵母均能适应鲊辣椒发酵的NaCl环境。

②酵母菌适宜生长的初始pH值

配制不同初始pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)的YPD液体培养基，接种1％产香，产酯优质的酵母菌Y11、Y19、Y21、Y26、Y50。30℃条件下静置培养48h后在560nm 波长处测其吸光值，最大吸光值对应的初始pH值即为其最适生长初始pH值。

通过实验检测可知，市售鲊辣椒pH值介于3.94～4.53之间。Y11和Y26的最适pH值是 6，Y19、Y21和Y50的最适pH值是5。虽然5株产香，产酯优质的酵母的最适pH值均比市售鲊辣椒产品高，但5株产香，产酯优质的酵母均均能在pH 3～10之间正常生长，从而证明了5株产香，产酯优质的酵母菌对高酸性环境有较强的忍耐力，故能适应鲊辣椒发酵的酸性环境。

③酵母菌适宜生长的温度

将活化的待测菌株Y11、Y19、Y21、Y26、Y50接种于YPD液体培养基中，分别置于 15，20，25，30，35，40，45℃条件下静置培养48h，于560nm波长处测其吸光值，吸光值最高对应的培养温度即为其最适生长温度。

通过实验检测可知，5株产香，产酯优质的酵母均能在15～45℃之间生长。除了酵母Y21、 Y26最适生长温度为25℃，其它酵母最适生长温度均为30℃。

4、酵母菌的产香特性分析

①电子鼻分析

具体操作为：将小米辣摘除蒂柄，在5％的盐水中浸泡15min，清水冲洗3次后晾干称重，用料理机破碎(大小不超过2mm×2mm)。加入4％的食盐、等重的生玉米粉、少量的水，以捏可成团松即散开为宜。然后分别加入2％的Y11、Y19、Y50酵母菌悬液(10⁷CFU/mL)发酵鲊辣椒作为3个接种组，并以自然发酵鲊辣椒为对照组。装罐盖严，30℃发酵6天。

通过电子鼻分析不同鲊辣椒的挥发性物质，具体为，分别称取2.50g发酵后的鲊辣椒样品于20mL具有聚四氟乙烯隔垫密封的顶空瓶中，将电子鼻针头插入同一高度顶空进样。参数设置：清洗时间60s，进样流速1L/min，检测时间120s。电子鼻分析结果见图2所示。其中，电子鼻的工作原理为：利用气体传感器阵列对特殊气体分子的敏感性，来识别样品中的气味成分，并对所检测到的气味进行判别和分析。

从图2中分析可知，对照组(自然发酵)与接种组(Y11、Y19、Y50)气味图谱相似，其中自然发酵鲊辣椒和Y50的整体响应值较高，轮廓基本一致，且传感器sn_6对自然发酵鲊辣椒和Y50的响应值显著高于Y11和Y19。传感器sn_1、sn_2、sn_3、sn_8、sn_9、sn_10 对4种鲊辣椒的响应值较为接近，其中sn_1的响应值最高。从而证明了，Y50菌株的产香种类与自然发酵鲊辣椒最为接近。

②SPME-GC-MS分析

具体操作为：分别称5.0g发酵后的鲊辣椒加入5mL氯化钠溶液(0.1g/mL)和10μL作为内标的正癸烷(300mg/L)。在55℃恒温水浴平衡30min，萃取头(50/30μm DVB/CAR/PDMS)顶空吸附40min。GC条件：DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：柱温箱起始温度为40℃，保持3min，10℃/min升温到100℃，1℃/min升温到115℃， 3℃/min升温到160℃，最后以10℃/min升温到250℃，保持5min；柱流量1mL/min；进样口温度250℃；不分流进样。MS条件：电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；接口温度 250℃；离子源温度250℃；溶剂延迟3min；质量扫描范围m/z 40～400。采用NIST17-1谱库检索，相似度大于80％，结合保留指数进行定性，内标法定量。结果如表3所示。

表3不同酵母发酵的鲊辣椒中挥发性物质分析结果

从表4中分析可知，4组鲊辣椒样品中共检出105种香气成分，其中酯类53种，醇类20 种，烯类10种，醛类7种，酸类5种，酮类5种，酚类2种和其他物质3种。由于饱和烷烃类感觉阈值非常高,对鲊辣椒的风味贡献小，未在表中列出。

酯类主要由产香酵母产生的酶催化前体物质合成，赋予鲊辣椒特殊的酯香。对照组、Y11、Y19、Y50接种发酵鲊辣椒中酯类物质分别检出30、35、33、35种，共检出的53种酯类中只有14种相同的物质。产香酵母接种组总酯含量为Y50>Y11>Y19，与化学方法测得总酯含量顺序一致，且比对照组分别提高了36.7％、16.9％、164.2％。其中，带有水果香、白兰地酒香的辛酸乙酯、花果香气的月桂酸乙酯和正戊酸-(Z)-3-己烯酯的含量显著提高。

③特征香气成分分析

鲊辣椒香气是由多种挥发性成分构成，只有该成分的浓度大于其阈值才能被人感知。香气活度值(odor activity value，OAV)为化合物浓度与该物质嗅觉阈值的比值，故当挥发性物质的OAV>1时，认为该组分为鲊辣椒的特征香气成分，且OAV越大对鲊辣椒总体风味贡献就越大。检测结果如表4所示。

表4不同酵母发酵的鲊辣椒中主要成分的OAV值

从表4中分析可知，乙酸己酯、十一酸乙酯和癸酸乙酯的OAV>1，为4组鲊辣椒共有的特征香气。2-甲基丁酸乙酯属于短链酯类，具有强烈的水果香气，为对照组和Y11的特征香气成分。水杨酸甲酯有薄荷香气为对照组、Y11和Y50特征香气成分。月桂酸乙酯为接种组的特征主要香气成分，而Y50独有的特征香气成分乙酸戊酯和戊酸乙酯，前者具有香蕉味而后者具有苹果味。除此以外，接种组中还检测到苹果香、菠萝香的乙酸异戊酯、水果香的苯甲酸乙酯及微弱油香、脂香的月桂酸异戊酯等多种酯类物质且未在对照组中未检出，从而为鲊辣椒形成特色的香气提供了基础。因此，添加产香酵母可以通过提高酯类物质的含量及改变酯类种类提升鲊辣椒香气的丰富度。

醇、烯、醛、酮等也是鲊辣椒中重要的挥发性风味物质。醇类物质主要由酵母菌经糖酵解途径产生，赋予鲊辣椒香气作用较大。醇类物质在添加产香酵母Y11、Y19及Y50的鲊辣椒中分别检出13、13及11种，与对照组(11种)差异不明显，但含量分别较对照组提升了102.5％、 30.5％及188.1％，为鲊辣椒中酯类物质的形成提供了更好的物质基础。4组鲊辣椒样品均检出的醇类物质有7种，即4-甲基-1-戊醇、正己醇、正庚醇、顺式-3-辛烯-1-醇、异戊醇、苯乙醇以及带有橙花、玫瑰、铃兰、苹果花香的反式-橙花叔醇。且具有果香、花香的异戊醇和蘑菇香、脂肪香的正庚醇OAV>1，为4组鲊辣椒共有的特征香气。1-壬醇为Y11的特有的香气成分，有清甜的玫瑰花香的苯乙醇为Y11和Y50鲊辣椒的特征香气。1-辛烯-3-醇具有蘑菇的香气，虽未在Y19鲊辣椒中检出，却为其他组的主要香气成分。

烯类化合物香气阈值较低且含量较高，4组鲊辣椒样品共有的(+)-柠檬烯具有柑橘和柠檬香气且OAV>100，β-石竹烯具有辛香、木香、柑橘香且OAV>1以及含量较高的月桂烯。对照组只检出4种烯类物质但含量却占了总挥发性物质含量的35.0％，接种组中Y11、Y19及 Y50中烯类较对照组分别增加了2、2和3种，且分别只占各自总挥发性物质含量的22.82％、 31.70％及20.59％。可见添加产香酵母改变了烯类物质种类以及烯类物质在总挥发性物质中的比例。

醛类物质主要来源于微生物的发酵转化，能调和香气。对照组检出了6种醛类物质，而接种组Y11、Y19及Y50中分别只检出了4、4和1种。具有风信子、水果甜香气味的苯乙醛的OAV>1，为对照组特征香气。接种Y19使具有玫瑰、柑橘、油脂气味的壬醛的含量相比对照组提升了232％。

酮类性质稳定，香味持久。beta-二氢紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮在鲊辣椒中均被检出，其中β-紫罗兰酮的阈值仅0.007μg/kg，对鲊辣椒样品整体香气贡献极大。具有甜橙香、花香的α-紫罗兰酮OAV>1，也是鲊辣椒的特征香气。呋喃类检出量虽然较少，但多具有强烈气味，是辣椒辣味的来源。2,3-二氢苯并呋喃只在对照组检出，而2-丁基四氢呋喃只在接种组检出。相比对照组，酸类、酚类物质在接种组中的种类和含量变化不大，表明Y11、Y19及Y50对其影响较小。

④挥发性成分主成分分析

4组发酵后的鲊辣椒样品中的挥发性物质含量由特征值的累计百分率100％可提取3个主成分。通过SPSS 26分析对照组与不同产香酵母在各个主成分中的得分，建立综合评价函数 F＝0.3864F1+0.3179F2+0.2957F3。综合得分排序为Y50﹥Y11﹥Y19﹥对照组。表明接种产香酵母Y50的鲊辣椒香气成分最佳。

表5不同酵母发酵的鲊辣椒样品主成分分析结果

综上分析可知，Y50产酯能力强、发酵性能好、香气特征明显且主成分分析综合得分最高。

4、酵母菌的鉴定

DNA提取：取适量Y50菌体，加入800μL CTAB提取液研磨成浆状，转移至2ml离心管。65℃水浴30-40min，加入800μL体积比24:1的氯仿：异戊醇溶液，摇匀静置15min，12000 r/min离心10min。将上清液转移至灭菌离心管，加入1mL95％冰冻乙醇，用手轻摇2min，-20℃冷冻至少0.5h，12000r/min离心10min。弃去上清液，沉淀加入1mL70％乙醇，静置5min。12000r/min离心10min，弃去上清液。在洁净工作台中干燥，重溶于50μL TE缓冲液中。使用酵母菌的通用引物【NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’(SEQ ID No.1)；NL4： 5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’(SEQ ID No.2)】进行PCR扩增，扩增产物以1％琼脂糖凝胶检测。测序委托天一辉远公司完成，并在NCBI上进行BLAST search，比较产香，产酯优质的酵母与Genbank中相应菌株的相似性，再结合菌落形态分析，初步确定酵母菌的种属。采用26SrDNA进行鉴定，酵母菌Y50的DNA序列如SEQ ID No.3所示。扩增条带分离明显并用MEGA软件构建系统发育树。如图3所示，Y50和Pichia kudriavzevii的亲缘关系最近，且在NCBI上获得了基因库登录号(MH443764.1)。最终确定Y50为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

将所得的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)Y50于2020年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.21173。其26S rDNA序列如SEQ ID No.3所示。

实施例2

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的筛选

以重庆北碚获得自然发酵的鲊辣椒为样品，取鲊辣椒样品25g捣碎后加入盛有无菌水和玻璃珠的锥形瓶中充分振摇，用生理盐水进行梯度稀释，分别取10^-3，10^-4，10^-5的样品稀释液100μL，均匀涂布于MRS琼脂平板培养基，置于37℃恒温倒置培养48～72h。观察挑取平板上菌落形态不同的单菌落，共分离出15株乳酸杆菌。在MRS固体培养基中可观察到菌落呈白色或乳白色的圆形，且表面光滑，边缘整齐，其中，编号为XZ3和XZ4的乳杆菌菌株形态见图4。初步认定形如针尖或圆形，表面光滑、白色、米白色的菌落为乳杆菌。革兰氏染色镜检发现15株菌均为革兰氏阳性菌，菌落形态分为短杆状和长杆状，排列方式为单个、成对或短链，其中，编号为XZ3和XZ4的乳杆菌菌株的革兰氏染色镜检结果如图5所示。通过革兰氏染色为阳性杆菌或球菌可进一步判定为乳杆菌，然后对其进行纯化培养。将纯化后的菌株于20％甘油中-80℃保存备用。

XZ3植物乳杆菌的活化

吸取2mL MRS肉汤液体培养基于菌液管中，121℃灭菌15min，冷却至室温。在无菌工作台中移取甘油保藏的XZ3植物乳杆菌0.5mL于2mL MRS肉汤液体培养基中，37℃厌氧培养24h。以划线的方式，转接到MRS肉汤平板培养基，水平放置半小时以上，待菌吸附在培养基上。用保鲜膜或者封口膜密封培养皿，倒置于37℃恒温箱中培养24h。以划线的方式再次转接，直至得到单菌落。

XZ3植物乳杆菌种子菌的培养

XZ3植物乳杆菌种子菌的培养：在超净工作台中用灭菌的接种环挑取平板培养基的单菌落，移入5mL MRS肉汤液体培养基中，37℃恒温箱中培养24h，作为一级种子。移取2mL一级种子，加入50mL的MRS肉汤液体培养基中，37℃恒温箱中培养24h，用细菌浊度仪调节浓度至1.00MCF(约为3×10⁸cfu)，作为二级种子。

Y50酵母菌的活化

吸取30mL YPD肉汤液体培养基于100mL离心管中，121℃灭菌15min，冷却至室温，在无菌工作台中移取甘油保藏的Y50酵母菌0.5mL于30ml YPD肉汤液体培养基中，在30℃，180rpm/min恒温振荡培养24h。以划线的方式，转接到YPD平板培养基，水平放置半小时以上，待菌吸附在培养基上。在30℃恒温培养24h。以划线的方式转接2～3次，直至得到单菌落。

Y50酵母种子菌的培养

用接种环挑取平板培养基的单菌落，移入10ml YPD肉汤液体培养基中，30℃，180rpm/min恒温振荡培养24h，作为一级种子。移取2ml一级种子，加入30ml的MRS肉汤液体培养基中，同样条件下培养24h，用血球计数板计数并将浓度调节浓度10⁷cfu，作为二级种子。

实施例3

如图6所示，将实施例1中获得的毕赤酵母菌Y50与实施例2中编号为XZ3植物乳杆菌菌株混合发酵鲊辣椒的制备方法，包括以下步骤：

1)原料预处理：将鲜辣椒摘除蒂柄，在盐水中浸泡15min，清水冲洗3次后晾干，称取 2.5kg晾干后的鲜辣椒，生姜0.1kg，大蒜0.1kg，用高速组织捣碎机分别破碎(大小为2mm×2mm 为宜)，向破碎后的鲜辣椒中加入0.1kg食盐进行预腌1小时，然后再加入过筛的生玉米粉2.5kg、破碎的生姜0.1kg、破碎的大蒜0.1kg和食盐0.1kg，进行充分混合；加入适量的纯净水，得混合物料，以捏可成团，松即散开为宜；其中，辣椒原料为处于采摘后未出现变质、未受污染及未经加工的天然状态的辣椒；

2)毕赤酵母菌Y50培养物的制备：将葡萄糖4g、蛋白胨4g、酵母膏2g和水200g，混合匀浆，121℃条件下，灭菌20min，冷却至室温，接入1环斜面毕赤酵母菌Y50菌种(用常规接种环进行接种)，置于振荡培养箱恒温30℃、160r/min、振荡培养24h，得到毕赤酵母菌 Y50培养物。用细菌浊度仪调节毕赤酵母菌Y50培养物，使毕赤酵母菌Y50的浓度为 1×10⁷cfu/g，即实施例2中的Y50酵母菌二级种子液；

3)XZ3植物乳杆菌培养物的制备：牛肉粉2g、蛋白胨2g、酵母浸出汁粉1g、葡萄糖4g、醋酸钠1g、柠檬酸二铵0.4g、吐温80 0.02g、硫酸镁0.116g、硫酸锰0.056g、蒸溜水200g混合，121℃灭菌20min，冷却至室温。接入1环斜面XZ3植物乳杆菌菌种(用常规接种环进行接种)，置于37℃静止培养24h得到XZ3植物乳杆菌培养物。用细菌浊度仪调节植物乳杆菌培养物，使植物乳杆菌的浓度为3×10⁸cfu/g，即实施例2中的XZ3植物乳杆菌二级种子液；

4)鲊辣椒发酵：向步骤1)中的混合物料中，接入步骤2)中制得的毕赤酵母菌Y50培养物100g和步骤3中制得的XZ3植物乳杆菌培养物100g，搅拌均匀，然后将混合后的物料转入陶瓷坛子，封盖，置于室温下静止发酵6天，即得发酵好的鲊辣椒。

将本实施例3发酵制得的鲊辣椒进行感官评价分析。结果为：辣椒红色鲜艳，玉米粉金黄，具有光泽。辣椒和玉米粉颗粒大小合适，分布均匀，且整体呈亮黄色。咸淡适中，酸辣适口，后味饱满，余味悠长。具有鲊辣椒特有的适当的酸味和醇香味，香气浓郁。

将本实施例3发酵制得的鲊辣椒经相关化学检测。结果为：发酵鲊辣椒中的总酸含量为 1.11g/100g，总酯含量为35mg/g。

将本实施例3发酵制得的鲊辣椒经气相色谱质谱法检测。结果为：β-紫罗兰酮的含量为 42.71μg/kg，愈创木酚的含量为25.32μg/kg；(+)-柠檬烯的含量为1595.64μg/kg，β-石竹烯的含量为348.53μg/kg，癸酸乙酯的含量为99.63μg/kg，十一酸乙酯的含量为12.77μg/kg，月桂酸乙酯的含量为79.59μg/kg。

实施例4

本实施例研究了毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和混菌添加量对发酵的鲊辣椒感官评价的影响，其余实验条件与实施例3相同。结果如图7所示。

从图7中分析可知，三维图开口向下，随着毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例、混菌添加量的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，又随着两因素值的增大逐渐减小。从响应面的最高点和等高线看出在所选的范围内存在极值，即该模型有稳定点，且稳定点是最大值。毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和混菌添加量对鲊辣椒感官评分的影响显著，具体表现为曲线的坡度较陡，响应值的变化较大。

实施例5

本实施例研究了毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和食用盐添加量对发酵的鲊辣椒感官评价的影响，其余实验条件与实施例3相同。结果如图8所示。

从图8中分析可知，三维图开口向下，毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和食用盐添加量的响应曲线的坡度比毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和混菌添加量的相互作用(图7)平缓，且随着毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和食用盐添加量的增加，响应值的变化范围较小，对发酵的鲊辣椒感官评价的影响并不显著。

实施例6

本实施例研究了毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和发酵时间对发酵的鲊辣椒感官评价的影响，其余实验条件与实施例3相同。结果如图9所示。

从图9中分析可知，毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和发酵时间对发酵的鲊辣椒感官评价的响应面图的趋势与毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和食用盐添加量相互作用(图8)相近。可见，毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和发酵时间的相互作用对鲊辣椒感官评分的影响不显著且影响最小。

实施例7

本实施例研究了混菌添加量和食用盐添加量对发酵的鲊辣椒感官评价的影响，其余实验条件与实施例3相同。结果如图10所示。

从图10中分析可知，三维图开口向下，且倾斜角度较大，及响应面的坡度较陡。可见，混菌添加量和食用盐添加量的相互作用对发酵的鲊辣椒感官评价的影响较毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和混菌添加量的相互作用(图7)平缓，较毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和食用盐添加量(图8)、毕赤酵母菌 Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和发酵时间的相互作用(图9)显著。

实施例8

本实施例研究了发酵时间和混菌添加量对发酵的鲊辣椒感官评价的影响，其余实验条件与实施例3相同。结果如图11所示。

从图11中分析可知，三维图的开口向下，且明显存在极值。发酵时间和混菌添加量的响应值变化范围较大，说明发酵时间和混菌添加量对发酵的鲊辣椒感官评价有一定影响。但与毕赤酵母菌Y50培养物和XZ3植物乳杆菌培养物的添加比例和混菌添加量(图7)、混菌添加量和食用盐添加量的响应面图(图10)相比，曲线坡度明显较缓，故发酵时间和混菌添加量的相互作用对鲊辣椒感官评价也相应较弱。

实施例9

本实施例研究了发酵时间和食用盐添加量对发酵的鲊辣椒感官评价的影响，其余实验条件与实施例3相同。结果如图12所示。

从图12中分析可知，三维图的开口向下，发酵时间和食用盐添加量的相互作用的响应面坡度较缓，响应值的变化范围较小。且响应值即鲊辣椒的感官评分较为集中，且评分集中在评分较高的范围。可见，发酵时间和食用盐添加量的相互作用对鲊辣椒的感官评分影响较小。

综上所述，本发明从自然发酵的鲊辣椒中筛选出了具有产香，产酯优质的毕赤酵母菌Y50，不仅丰富了毕赤酵母菌菌种资源库，扩宽了毕赤酵母菌在食品领域中的应用，也为鲊辣椒的制备提供了新的发酵方法。本发明的混合菌种发酵鲊辣椒的制备方法，通过原料预处理、响应面法优化发酵工艺、恒温发酵得到鲊辣椒产品。本发明采用植物乳杆菌和毕赤酵母菌Y50 进行鲊辣椒发酵，相对于传统自然发酵的鲊辣椒或单一乳杆菌发酵的鲊辣椒，其产品香气更加浓郁，风味宜人。由于人工接种进行强化发酵，相对于自然腌制的鲊辣椒，其发酵成功率和产品安全性更高，酸味更易控制，整体风味更加协调。本发明可缩短鲊辣椒的生产周期，提高生产效率和发酵成功率。并进一步提高产品安全性和产品整体的风味品质。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 西南大学

<120> 一株毕赤酵母菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

GCATA TCAAT AAGCG GAAAA G 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

GGTCC GTGTT TCAAG ACGG 19

<210> 3

<211> 593

<212> DNA

<213> 毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii) Y50

<400> 3

ACTTC TGATC GATCT GCGCA TCCGT GACCT ACACG GCCGC AGTCC TCGGT CCCCG CACGCAGCAT CTGGC CCTGG CTATA ACACT CCGAA GAGCC ACGTT CCAGA ACCCC TTCTC CTGCA GCAAGAACCG ATGCT GGCCC AGGGA AAGCC CAGAG CGCCG CCCAC GAGAG GCAGC GGTGC GCAAT CCCCATGTCG GGCGC AATAC CCTTC CCTTT CAACA ATTTC ACGTG CTGTT TCACT CTCTT TTCAA AGTGCTTTTC ATCTT TCCTT CACAG TACTT GTTCG CTATC GGTCT CTCGC CAGTA TTTAG CCTTA GATGGAATTT ACCAC CCGCT TGGAG CTGCA TTCCC AAACA ACTCG ACTCG TCAGA AGGGC CTCAC TGCTTCCGCC GGCAT CCCAC GGGGC TCTCA CCCTC CTGGG CGCCC TGTTC CAAGG GACTT GGACA CCGCCTTCCA CACAG ACTCC AACCT GCAAT CTACA ACTCG TGCCG CAAAG CACGA TTTCA AATCT GAGCTCTTGC CGCTT CACTC GCCGC TACTG AGGCA ATCCC TGTTG GTTTC TTTTC CTCCG CTATT TGGGAATATG CAACC TTT 593

Claims (10)

1.库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)Y50，保藏编号为CGMCC No.21173。

2.权利要求1所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用。

3.根据权利要求2所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

原料预处理：将辣椒摘除蒂柄，在盐水中浸泡，清水冲洗后晾干，破碎，加入等量的生玉米粉和水，得混合物料；

发酵：在混合物料中，加入重量百分含量为3％～6％的食盐和重量百分含量为3％～6％的生姜和大蒜，接入重量百分含量为1％～4％的毕赤酵母菌Y50培养物和重量百分含量为1％～4％的乳杆菌培养物，搅拌均匀，在25～32℃条件下，进行厌氧发酵4～10天，即可。

4.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，其特征在于，所述毕赤酵母菌Y50培养物的制备方法为：将葡萄糖、蛋白胨、酵母膏和水，按质量比计为1～4：1～4：1～2：96～200进行混合，匀浆，灭菌，冷却至室温，得到毕赤酵母菌Y50培养基；然后向培养基中，接入毕赤酵母菌Y50菌种，恒温振荡培养，得到毕赤酵母菌Y50培养物。

5.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，其特征在于，所述毕赤酵母菌Y50培养物中毕赤酵母菌Y50的浓度为0.5×10⁷～1×10⁷cfu/g。

6.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，其特征在于，所述恒温振荡培养的温度为30～32℃，转速为150～180r/min，振荡培养的时间为18～24h。

7.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，其特征在于，所述乳杆菌培养物的制备方法为：牛肉粉、蛋白胨、酵母浸出汁粉、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵、吐温80、硫酸镁、硫酸锰和水，按质量比计为10～20：5～10：20～40：5～10：2～5：0.1～0.5：0.58～2.00：0.28～0.80：1000～2000进行混合，匀浆，灭菌，冷却至室温，得到乳杆菌培养基；然后向培养基中，接入乳杆菌菌种，静止培养，得到乳杆菌培养物。

8.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，其特征在于，所述乳杆菌培养物中乳杆菌的浓度为3×10⁸～5×10⁸cfu/g。

9.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌Y50在制备鲊辣椒中的应用，其特征在于，所述静止培养的温度为35～37℃，静止培养的时间为18～24h。

10.如权利要求3至权利要求9任一所述的毕赤酵母菌Y50制得的鲊辣椒。

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