CN109097292A - 导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

一种导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法，属于微生物技术领域，经过对“生花”糟辣椒中微生物的分离，得到了2株主要“生花”菌。将其反接于灭菌糟辣椒后，其中从PDA培养基中分离的菌株能导致“生花”现象，通过对分离到的菌株进行ITS序列分析，证实引起糟辣椒“生花”腐败的菌株为库德毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。而从NA培养基中分离的菌株不能导致糟辣椒“生花”，经革兰氏染色镜检后初步判定为革兰氏阳性球菌。

Description

导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体为一种导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法。

背景技术

辣椒(Capsicum)又名海椒、辣子，为茄科辣椒属植物。原产于美洲，于中国古代明朝期传入中国江浙一带，昆曲《牡丹亭》是中国最早记录辣椒的典籍之一,现为我国多地区尤其是四川、贵州、云南等省份餐饮中必不可少的辛香食料。

辣椒中含有较多的营养物质，例如辣椒碱、辣椒红素、维生素C等。其中维生素C含量远远高于土豆、西红柿蔬菜，有研究表明，辣椒中的辣椒碱具有较好的抗氧化性，对DPPH·、亚硝基以及·OH有一定的清除能力，其中对DPPH·的清除效果最好，并对胆固醇有明显的降低作用。辣椒中的辣椒红素是一种十分优质的类胡萝卜素，有着艳丽的颜色和良好的着色效果，是一种理想的食品着色剂。

由于贵州独特的小气候和土壤十分适合辣椒的生产，辣椒已在贵州地区大力发展，特别是在贵州遵义，辣椒已成为其重要的特色经济作物，而遵义市虾子镇也发展为中国最大的辣椒交易市场，被誉为“中国辣椒城”。辣椒加工制品种类繁多，有糊辣椒面、风味油辣椒、泡椒、糟辣椒等品种，其中糟辣椒色泽鲜艳，味道香浓，既辣又酸，特有的香、辣、鲜、酸、嫩的独特风味，深受人们喜爱，而且老少皆宜，在贵州美食中是必不可少的，为贵州的一大特产，市场前景广阔。

糟辣椒是挑选新鲜的红椒作为原料，加入一定量的生姜和大蒜作为辅料，将其混合剁碎，装入密封的坛中，然后在低盐的条件下，利用辣椒自身的乳酸菌进行发酵制作而成，使得糟辣椒酸辣可口，具有发汗除湿，开胃的效果，糟辣椒中的乳酸菌则可促进肠道健康。但是在糟辣椒发酵后期，常常会在其表面产生白膜，俗称为“生花”，是由于微生物在糟辣椒表面生长繁殖导致的。糟辣椒一旦开始“生花”，其表面会陆续出现成片或成碎花状的白膜，严重影响着糟辣椒的感官品质，甚至存在着安全隐患，因此，“生花”现象是糟辣椒生产和保藏中一个大的问题，对于糟辣椒“生花”的原因还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于，研究糟辣椒“生花”原因，为进一步解决实际生产中糟辣椒“生花”的问题提供一些理论依据，提供了一种糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法。

为达到上述目的，采用的技术方案为：一种导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法，包含如下步骤：

1）、微生物的分离纯化

挑取生花糟辣椒表面的白色物质于9mL无菌水中，震荡摇匀后进行10倍稀释到10^-3，分别取1ml各个浓度梯度的菌悬液均匀涂布于PDA和NA培养基中，PDA培养基在28℃下有氧培养，培养时间24-36h；NA培养基在36℃下有氧培养，培养时间36-48小时；挑取不同菌落形态特征的单菌落进行平板划线，经6次纯化后对菌落进行特征描述，同时挑取单菌落进行厌氧培养，并观察其生长情况，最后放置在4℃冰箱中进行试管斜面保种；

2）、染色镜检

用已灼烧灭菌的接种环分别挑取PDA和NA培养基中培养的最后一次纯化的单菌落于滴有一滴无菌水的载玻片上，进行菌体的固定，之后对NA培养基中挑取的菌落进行革兰氏染色，革兰氏染色步骤为结晶紫初染1min、碘液媒染1min、酒精脱色30s、沙黄复染1min；并使用油镜进行观察；对PDA培养基中挑取的菌落用碘液染色1min后用显微镜观察，记录观察结果；

3）、反接实验

将纯化后的菌株制成悬液，分别加0ml、1ml、2ml、4ml菌悬液于已灭菌的未添加任何防腐剂的糟辣椒中有氧培养，培养温度为26℃，每天观察糟辣椒是否产生“生花”现象；

4）、“生花”微生物的DNA提取

挑选出反接实验中能导致糟辣椒产生“生花”现象的菌株，并使用DNA提取试剂盒进行提取单菌落的总DNA，操作步骤严格按照说明书进行；步骤如下：（1）挑菌放于离心管中，并用移液枪吸取200ul溶液A和20ul RNase A加入其中，再加入50mg玻璃珠，使用漩涡混合仪振荡10min；（2）移取20ul的蛋白酶K(10mg/ml)加入其中,混合均匀后在55℃下水浴30min,12000rpm离心2min；后将上层清液转移到新的离心管中；（3）在上层清液中加入200ul的溶液B,充分混匀后，于55℃下水浴5-10分钟；（4）移取200uL无水乙醇加入其中并充分混匀，将所有物质全部转移到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液；（5）加600ul漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心1min，过程重复2次；（6）12000rpm离心2 min，将吸附柱放置于新的离心管中，悬空滴加150ul经65℃水浴预热的洗脱液，放置5min后12000rpm离心1min；（7）将离心所得到的洗脱液再次加入至吸附柱中，并12000rpm离心2 min，得到目的DNA；

5）、PCR扩增和电泳

真菌扩增使用ITS1、ITS4作为引物，ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3'；PCR扩增体系为20μl，包括ddH₂O14ul，10 X PCR Buffer(withMg²⁺) 2ul，dNTP(2.5Mm each) 1.6ul，模板DNA 0.7ul，上游引物与下游引物各0.8ul，TaqDNA polymerase(5U/ul) 0.1ul；PCR反应参数：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃最终延伸10min，4℃保存；量取20ml 0.5倍的TBE溶液，加入0.2g琼脂糖煮沸，加入2ul核酸染料，制成1%琼脂糖凝胶用于电泳，滴加4ul的100bpDNA Ladder Marker作为参照，滴加4ul混有Loading buffer 的扩增产物，电压：120V，电流：2mA，时间：20-30min；

6）、测序并序列同源性分析

将目的DNA进行测序检测，并把测序结果在GeneBank中通过BLAST进行基因比对后进行菌种的鉴定。

本发明对“生花”糟辣椒中微生物的分离，得到了2株主要“生花”菌。将其反接于灭菌糟辣椒后，其中从PDA培养基中分离的菌株能导致“生花”现象，通过对分离到的菌株进行ITS序列分析，证实引起糟辣椒“生花”腐败的菌株为库德毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。而从NA培养基中分离的菌株不能导致糟辣椒“生花”，经革兰氏染色镜检后初步判定为革兰氏阳性球菌。

附图说明

图1为本发明实施例中PDA培养基中菌株的菌落特征。

图2为本发明实施例中NA培养基中菌株的菌落特征。

图3为本发明实施例中革兰氏染色镜检图。

图4为本发明实施例中碘液染色镜检图。

图5为本发明实施例中菌株PCR扩增产物纯化结果。

图6为基于编号为W的菌株ITS1结构域序列构建的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1实验样品

实验样品为家庭自制的“生花”糟辣椒，其表面已经完全布满白色物质。

1.1.2 培养基和试剂

表1. 培养基和试剂

Table 1 Medium and reagents

1.1.3仪器设备

表2 .仪器设备

Table 2Instrument and equipment

1.2 实验方法

1.2.1微生物的分离纯化

挑取“生花”糟辣椒表面的白色物质于9mL无菌水中，震荡摇匀后进行10倍稀释到10^-3，分别取1ml各个浓度梯度的菌悬液均匀涂布于PDA和NA培养基中，PDA培养基在28℃下有氧培养，培养时间24-36h；NA培养基在36℃下有氧培养，培养时间36-48小时。挑取不同菌落形态特征的单菌落进行平板划线，经6次纯化后对菌落进行特征描述，同时挑取单菌落进行厌氧培养，并观察其生长情况，最后放置在4℃冰箱中进行试管斜面保种。

1.2.2染色镜检

用已灼烧灭菌的接种环分别挑取PDA和NA培养基中培养的最后一次纯化的单菌落于滴有一滴无菌水的载玻片上，进行菌体的固定，之后对NA培养基中挑取的菌落进行革兰氏染色，革兰氏染色步骤为结晶紫初染1min、碘液媒染1min、酒精脱色30s、沙黄复染1min。并使用油镜进行观察；对PDA培养基中挑取的菌落用碘液染色1min后用显微镜观察，记录观察结果。

1.2.3反接实验

将纯化后的菌株制成悬液，分别加0ml、1ml、2ml、4ml菌悬液于已灭菌的未添加任何防腐剂的糟辣椒中有氧培养，培养温度为26℃，每天观察糟辣椒是否产生“生花”现象。

1.2.4“生花”微生物的DNA提取

挑选出反接实验中能导致糟辣椒产生“生花”现象的菌株，并使用DNA提取试剂盒进行提取单菌落的总DNA，操作步骤严格按照说明书进行。步骤如下：（1）挑菌放于离心管中，并用移液枪吸取200ul溶液A和20ul RNase A加入其中，再加入50mg玻璃珠，使用漩涡混合仪振荡10min。（2）移取20ul的蛋白酶K(10mg/ml)加入其中,混合均匀后在55℃下水浴30min,12000rpm离心2min。后将上层清液转移到新的离心管中。（3）在上层清液中加入200ul的溶液B,充分混匀后，于55℃下水浴5-10分钟。（4）移取200uL无水乙醇加入其中并充分混匀，将所有物质全部转移到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液。（5）加600ul漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心1min，过程重复2次。（6）12000rpm离心2 min，将吸附柱放置于新的离心管中，悬空滴加150ul经65℃水浴预热的洗脱液，放置5min后12000rpm离心1min。（7）将离心所得到的洗脱液再次加入至吸附柱中，并12000rpm离心2 min，得到目的DNA。

1.2.5PCR扩增和电泳

真菌扩增使用ITS1、ITS4作为引物，ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3'。PCR扩增体系为20μl，包括ddH₂O14ul，10 X PCR Buffer(withMg²⁺) 2ul，dNTP(2.5Mm each) 1.6ul，模板DNA 0.7ul，上游引物与下游引物各0.8ul，TaqDNA polymerase(5U/ul) 0.1ul。PCR反应参数：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃最终延伸10min，4℃保存。量取20ml 0.5倍的TBE溶液，加入0.2g琼脂糖煮沸，加入2ul核酸染料，制成1%琼脂糖凝胶用于电泳，滴加4ul的100bpDNA Ladder Marker作为参照，滴加4ul混有Loading buffer 的扩增产物，电压：120V，电流：2mA，时间：20-30min。

1.2.6测序并序列同源性分析

将目的DNA送北京博友顺生物技术有限公司测序，并把测序结果在GeneBank中通过BLAST进行基因比对后进行菌种的鉴定。

2.实验结果

2.1分离结果

2.1.1菌落特征

从“生花”糟辣椒制品中分离出的2株菌，其中在PDA培养基上形成的菌落大而厚，湿润，表面较光滑，不透明，粘稠，菌落颜色呈乳白色，易挑取，菌落隆起且边缘圆整，有浓郁的酒香味，在有氧和无氧条件下均能生长。如图1.PDA培养基中菌株的菌落特征。

在NA培养基中形成的菌落小，湿润，表面光滑，不透明，菌落颜色呈淡黄色，易挑取，菌落微微隆起，无光泽，为圆球形，仅在有氧条件下生长。如图 2.NA培养基中菌株的菌落特征。

2.1 .2 镜检形态特征

从“生花”糟辣椒中分离出的两种株菌，对NA培养基上分离出的菌经革兰氏染色后，在100倍油镜下观察到（如图3所示）：为革兰氏阳性、呈圆球状。如图3.革兰氏染色镜检图。

对PDA培养基上分离出的菌不经染色，在40倍物镜下观察，对其碘液染色后在40倍镜下观察。如图4.碘液染色镜检图。

2.2.反接实验结果

2.2.1灭菌糟辣椒接菌（来自PDA培养基）后“生花”情况

挑取PDA培养基中生长的菌所制成的悬液，在接入已灭菌的糟辣椒后，在培养第10天时，糟辣椒均出现不同程度的“生花”现象，并且严重程度随着加入菌悬液的量的增加而加重。

2.2.2 灭菌糟辣椒接菌（来自NA培养基）后“生花”情况

挑取NA培养基中生长的菌所制成的悬液，在接入已灭菌的糟辣椒后，未引起“生花”现象，在分别加入1ml菜籽油后继续培养5天，依旧未出现“生花”现象。

2.3“生花”菌株鉴定结果

2.3.1菌株PCR扩增纯化结果

用1%的TBE琼脂糖凝胶对1株待测菌株W的 ITS1/ITS4的 PCR扩增产物作电泳检测,Ⅰ型核酸染料进行染色，观察结果见图5。

对编号W的菌株提取单菌落的总DNA，后用于ITS序列的PCR扩增。图5扩增结果经1%脂糖电泳检测后，在500bp左右具有较大明亮的扩增产物条带，此即为菌株ITS1/ITS4 区域的PCR 扩增产物，将其送去测序，并把测序结果在Gene Bank（NCBI）中通过BLAST进行基因比对。

2.3.2测序结果

经北京博友顺生物技术有限公司对目标DNA进行测序，并把测序结果在Gene Bank数据库中通过BLAST进行基因比对，然后建立系统发育树，由图 6可知，W株菌为酵母属；W与GenBank（NCBI） 中的CP021088.1Pichia kudriavzevii相似度为99%以上，鉴定结果为库德毕赤酵母。

本发明从“生花”糟辣椒中分离了两株不同的菌，通过反接实验证实其中从PDA培养基中分离出菌株能导致已灭菌的未“生花”糟辣椒产生“生花”腐败现象，观察得知该菌使糟辣椒表面产生白点，且导致糟辣椒颜色由鲜红变为暗红色，并变得潮湿，经分子学鉴定为库德毕赤酵母。

4.结论

对“生花”糟辣椒中微生物的分离，得到了2株疑似“生花”菌。将其反接于灭菌糟辣椒后，其中从PDA培养基中分离的菌株能导致“生花”现象，通过对分离到的菌株进行ITS序列分析，证实引起糟辣椒“生花”腐败的菌株为库德毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。而从NA培养基中分离的菌株不能导致糟辣椒“生花”，经革兰氏染色镜检后初步判定为革兰氏阳性球菌。

Claims (1)

1.一种导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法，其特征在于：包含如下步骤：

1）、微生物的分离纯化：

挑取生花糟辣椒表面的白色物质于9mL无菌水中，震荡摇匀后进行10倍稀释到10^-3，分别取1ml各个浓度梯度的菌悬液均匀涂布于PDA和NA培养基中，PDA培养基在28℃下有氧培养，培养时间24-36h；NA培养基在36℃下有氧培养，培养时间36-48小时；挑取不同菌落形态特征的单菌落进行平板划线，经6次纯化后对菌落进行特征描述，同时挑取单菌落进行厌氧培养，并观察其生长情况，最后放置在4℃冰箱中进行试管斜面保种；

2）、染色镜检：

用已灼烧灭菌的接种环分别挑取PDA和NA培养基中培养的最后一次纯化的单菌落于滴有一滴无菌水的载玻片上，进行菌体的固定，之后对NA培养基中挑取的菌落进行革兰氏染色，革兰氏染色步骤为结晶紫初染1min、碘液媒染1min、酒精脱色30s、沙黄复染1min；并使用油镜进行观察；对PDA培养基中挑取的菌落用碘液染色1min后用显微镜观察，记录观察结果；

3）、反接实验：

将纯化后的菌株制成悬液，分别加0ml、1ml、2ml、4ml菌悬液于已灭菌的未添加任何防腐剂的糟辣椒中有氧培养，培养温度为26℃，每天观察糟辣椒是否产生“生花”现象；

4）、“生花”微生物的DNA提取：

挑选出反接实验中能导致糟辣椒产生“生花”现象的菌株，并使用DNA提取试剂盒进行提取单菌落的总DNA，操作步骤严格按照说明书进行；步骤如下：（1）挑菌放于离心管中，并用移液枪吸取200ul溶液A和20ul RNase A加入其中，再加入50mg玻璃珠，使用漩涡混合仪振荡10min；（2）移取20ul的蛋白酶K(10mg/ml)加入其中,混合均匀后在55℃下水浴30min,12000rpm离心2min；后将上层清液转移到新的离心管中；（3）在上层清液中加入200ul的溶液B,充分混匀后，于55℃下水浴5-10分钟；（4）移取200uL无水乙醇加入其中并充分混匀，将所有物质全部转移到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液；（5）加600ul漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心1min，过程重复2次；（6）12000rpm离心2 min，将吸附柱放置于新的离心管中，悬空滴加150ul经65℃水浴预热的洗脱液，放置5min后12000rpm离心1min；（7）将离心所得到的洗脱液再次加入至吸附柱中，并12000rpm离心2 min，得到目的DNA；

5）、PCR扩增和电泳：

真菌扩增使用ITS1、ITS4作为引物，ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3'；PCR扩增体系为20μl，包括ddH₂O14ul，10 X PCR Buffer(withMg²⁺) 2ul，dNTP(2.5Mm each) 1.6ul，模板DNA 0.7ul，上游引物与下游引物各0.8ul，TaqDNA polymerase(5U/ul) 0.1ul；PCR反应参数：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃最终延伸10min，4℃保存；量取20ml 0.5倍的TBE溶液，加入0.2g琼脂糖煮沸，加入2ul核酸染料，制成1%琼脂糖凝胶用于电泳，滴加4ul的100bpDNA Ladder Marker作为参照，滴加4ul混有Loading buffer 的扩增产物，电压：120V，电流：2mA，时间：20-30min；

6）、测序并序列同源性分析：

将目的DNA进行测序检测，并把测序结果在GeneBank中通过BLAST进行基因比对后进行菌种的鉴定。