CN114958629A - 一株非酿酒酵母rm12及其在蓝莓酒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株非酿酒酵母RM12及其在蓝莓酒中的应用，属于生物技术领域，本发明从连云港蓝莓表皮筛选出一株蓝莓特色酵母RM12，与普通蓝莓酒相比较，由该酵母发酵产生的蓝莓酒，具有甲酸异戊酯和异戊醇等特色香气成分。由该酵母菌混合发酵所得的蓝莓果酒品质优良，pH为3.06、酒精度为10.08％、残糖量为4.79g/L、总酸为7.05g/L、脂类物质占所有挥发性物质的70.03％，具有典型的蓝莓风味，蓝莓果酒为蓝莓产业提供一种加工方法延长蓝莓的供应周期，增加其经济效益，蓝莓果酒中含有丰富的Vc、花青素等营养物质，酸甜可口，适宜饮用。

Description

一株非酿酒酵母RM12及其在蓝莓酒中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一株非酿酒酵母RM12以及该酵母菌在蓝莓果酒发酵中的应用，并且由该酵母菌发酵的蓝莓果酒具有独特的香气。
背景技术
新鲜水果由于呼吸代谢旺盛，极易腐烂，同时，容易受到外力损伤，难以保藏，这导致大量新鲜水果从果园采摘之后，不方便运输储藏，尤其是一些浆果类水果如蓝莓、杨梅、桑葚、柿子、樱桃、猕猴桃等，极易腐烂，营养成分流失。因此，将新鲜水果经过再加工，酿造成宜储存的果酒，既能保证水果的营养成分，同时也对果农的经济收入提供一定的保障。此外，处于对身体健康和口感的考虑，越来越多的酒体消费人群愿意选择酒精含量较低的果酒。果酒的发酵是个复杂的微生物相互作用的过程，在这个过程中，起主导作用的是酵母菌。酵母菌通过代谢作用将糖转化为乙醇。在发酵初期，由部分非酿酒酵母参与发酵，随着酒精度不断增加，最后自溶消解。后期主要由酿酒酵母主导发酵。
研究表明，非酿酒酵母在果酒酿造过程中起着积极的作用，可以改善果酒的组成成分，丰富果酒的香气成分。非酿酒酵母存在于果实和土壤中等地方，及水果从采摘到酿造的多个环节。一般在发酵初期通过代谢和自溶的方式产生独特的香气物质，在发酵5-7d后便死亡。目前市售蓝莓果酒多为商业酿酒酵母工业化酿造而得，基本丧失蓝莓特色风味，因此从蓝莓上筛选出蓝莓特色非酿酒酵母，酿造具有蓝莓特色风味的蓝莓果酒显得尤为重要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一株非酿酒酵母RM12的筛选，即葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)RM12。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一株非酿酒酵母RM12 的筛选，该非酿酒酵母RM12是从常州市售蓝莓果实上分离的野生非酿酒酵母，已于2021年01月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.21758，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。
本发明公开了一种蓝莓果酒，由所述非酿酒酵母葡萄汁有孢汉逊酵母菌RM12与商业酵母X16在蓝莓果酒混合发酵获得。
本发明筛选出的非酿酒酵母的方法如下所示，包括以下步骤：
(1)取常州市售新鲜的蓝莓，略微除去污渍泥土等杂质。将蓝莓在无菌条件下破碎处理，称取100g分别装入500mL无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃生化培养箱中培养2-3d。待观察到有气泡产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。
(2)将步骤1所述稀释液均匀涂布于含有氯霉素的TTC下层培养基中，在 28℃恒温培养箱中生长24h后，倒入TTC上层培养基，避光倒置培养2h。观察培养基颜色的变化，TTC试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物。产酒精能力越好的菌株，在培养基上显出的颜色越深。这一过程可初步筛选出优良、发酵性能较好的菌株。
(3)挑取步骤2所得显深红色的菌株划线接种到YPD固体培养基上，在 28℃的恒温培养箱中生长1-2d，观察菌落表观特性，选取出具有典型酵母特征的单菌落，进行2-3次平板化线，得到单个菌落接种到YPD液体培养基中培养。根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到WL培养基上对酵母做进一步纯化(根据分离效果纯化2-3次)，观察酵母的生长状态。同时挑取YPD固体平板上纯的单克隆菌株，置于显微镜下观察细胞形态。
(4)采用试剂盒提取法提取纯菌株的基因组DNA。以引物ITS1和ITS4扩增其26SrDNA的D1/D2区域。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物送武汉天一生物工程股份有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST 同源序列搜索比对。
(5)对分离的酵母菌进行生长性能分析、理化性质分析及香气成分分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。
所述步骤(1)中，蓝莓成熟饱满，每颗果实都经过认真筛选，清洗，但不能过度清洗。
所述步骤(1)中，果实破碎过程要在超净工作台中进行，避免实验结果受到杂菌的污染。
所述步骤(1)中，果实与无菌水的质量比是1:1，保证部分果实表面暴露在空气中。
所述步骤(2)中，稀释过程应稀释至10-4-10-6，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。发酵和培养温度均为 28℃，通风条件下进行。
所述步骤(2)中，TTC下层培养基中添加适量氯霉素，以抑制杂菌生长。
述步骤(2)中，倒入TTC上层培养基后，避光倒置培养，以观察显色状况。
所述步骤(3)中，稀释过程应稀释至10-4-10-6，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。发酵和培养温度均为 28℃，通风条件下进行。
所述步骤(3)中，运用平板划线法对菌株进行纯化，次数至少达2-3次，保证尽量获得纯菌。
所述步骤(3)中，菌株镜检前需将挑取的菌株经草酸铵结晶紫简单染色，再置于显微镜下观察细胞形态。
所述步骤(4)中，PCR反应体系总体积为20μL。每个PCR管中加入顺序及体积分别为：Prime star Max 10μL，引物ITS1和ITS4各0.5μL，基因组DNA 0.3μL，无菌水8.7μL。
所述步骤(4)中，PCR循环为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，共31次循环，最后10℃充分延伸5min。
所述步骤(5)中，生长性能分析通过全自动生长曲线分析仪测定，菌株以 2.0×105CFU/mL接种于YPD液体培养基中，在28℃的条件下生长24h，以YPD 液体培养基作为空白对照,在600nm处测定菌悬液OD值,平行重复3次，测定出菌株的生长曲线。
所述步骤(5)中，香气分析如下所示：
(Ⅰ)样品预处理：取酒样50mL，用50mL、30mL、30mL二氯甲烷分别萃取3次，合并有机相，水浴40℃、转速90r/min条件下旋蒸浓缩至1-2mL。再用无水硫酸钠脱水处理，供GCMS分析。
(Ⅱ)气相色谱条件：HP-5MS(30m×0.25μm×0.25mm)色谱柱，载气为高纯氦气，流速为1mL/min，进样口温度为250℃，不分流进样。升温程序：30℃ (10min)，以10℃/min升温至230℃(20min)，再以8℃/min升温至300℃(5min)，检测器温度250℃。
(Ⅲ)质谱条件：电离子源(EI)，离子源温度200℃，接口温度200℃。
本发明的有益效果：脂类物质丰富，果香味浓郁，并且能够产生一定量的乙醇含量，吸引人的味觉。
本发明的有益效果为：本发明通过对酵母菌的形态、生理生化特征等方面进行研究，筛选出一种产酒精能力较强，同时能够产生甲酸异戊酯和异戊醇为主要香气成分的酵母菌株。由该酵母菌与商业酵母X16混合发酵所得的蓝莓果酒品质优良，产酒精能力较好，酸甜适中，香气馥郁，pH为3.06、酒精度为10.08％、残糖量为4.79g/L、总酸为7.05g/L、脂类物质占所有挥发性物质的70.03％，具有典型的蓝莓风味。蓝莓果酒为蓝莓产业提供一种加工方法延长蓝莓的供应周期，增加其经济效益。蓝莓果酒中含有丰富的Vc、花青素等营养物质，酸甜可口，适宜饮用。
附图说明
图1-A为TTC稀释涂布。
图1-B为RM12在YPD培养基菌落形态。
图1-C为RM12在WL培养基菌落形态。
图1-D为RM12的细胞形态(1000x)。
图2为非酿酒酵母RM12的26S rDNA D1/D2结构域序列的系统发育树。
图3为非酿酒酵母RM12的生长曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施案例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明实施案例涉及一种酿酒用的酵母，保藏号为CGMCC NO.21758。该酵母被命名为RM12，是从江苏省常州市售的蓝莓表面分离得到的。已于 2021年01月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.21758。
本发明实施案例还涉及该酵母菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)取常州市售新鲜的蓝莓，略微除去污渍泥土等杂质。将蓝莓在无菌条件下破碎处理，称取100g分别装入500mL无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃生化培养箱中培养2-3d。待观察到有气泡产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。
本发明的一个实施例中，选取颗粒饱满的蓝莓果实。
在本发明的一个实施例中，破碎果实与无菌水的质量比为1:1，保证有部分果实暴露在空气中。稀释的作用是使发酵液中的酵母菌含量适中，有利于下一步的初步筛选。
(2)将所述稀释液均匀涂布于含有氯霉素的TTC下层培养基中，在28℃恒温培养箱中生长24h后，倒入TTC上层培养基，避光倒置培养2h。观察培养基颜色的变化，TTC试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物。产酒精能力越好的菌株，在培养基上显出的颜色越深。这一过程可初步筛选出优良、发酵性能较好的菌株。
TTC上层培养基：TTC 0.5g/L，葡萄糖5g/L，琼脂15g/L；TTC下层培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉1.5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.4g/L，柠檬酸0.3g/L，氯霉素0.1g/L，琼脂30g/L。在115℃的环境中灭菌20min。
在本发明的一个实例中，TTC下层培养基中添加适量氯霉素，以抑制杂菌生长。倒入TTC上层培养基后，避光倒置培养，以观察显色状况。
(3)挑取步骤(2)所得显深红色的菌株划线接种到YPD固体培养基上，在28℃的恒温培养箱中生长1-2d，观察菌落表观特性，选取出具有典型酵母特征的单菌落，进行2-3次平板化线，得到单个菌落接种到YPD液体培养基中培养。根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到WL培养基上对酵母做进一步纯化(根据分离效果纯化2-3次)，观察酵母的生长状态。同时挑取YPD固体平板上纯的单克隆菌株，置于显微镜下观察细胞形态。结果如图1所示。
YPD培养基成分：蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，琼脂1.5g。WL 培养基：酵母粉5g/L，干酪素5g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO4 0.55g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl2 0.125g/L，MgSO40.125g/L。制备方法：将上述各成分加入1L蒸馏水溶解后，再分装到100mL的锥形瓶中，115℃灭菌20min。
在本发明的一个实例中，运用平板划线法对菌株进行纯化，次数至少达2-3 次，保证尽量获得单个纯菌菌落。稀释过程应稀释至10-4-10-6，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。
在本发明的一个实例中，同时挑取YPD固体平板上纯的单克隆菌株，经草酸铵结晶紫简单染色后置于显微镜下观察细胞形态。
步骤(1)、(2)和(3)是对酵母进行初筛，作用是在培养基中筛选出外观形态不同并具有产酒精性能的的单一菌落，并对分离的酵母菌进行生长性能、理化性质及香气成分分析，以筛选得到具有最佳性能的酵母菌，其单菌形态为：圆形白色菌落，边缘完整，表面光滑湿润。
(4)采用试剂盒提取法提取纯菌株的基因组DNA。以引物ITS1和ITS4扩增其26SrDNA的D1/D2区域。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物送武汉天一生物工程股份有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST 同源序列搜索比对。
在本发明的一个实例中，利用相邻法的系统发育方法构建酵母菌RM12的系统发育树。结果如图1所示。
(5)对分离的酵母菌进行生长性能、理化性质及香气成分分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。
在本发明的一个实例中，生长性能分析通过全自动生长曲线分析仪测定，菌株以2.0×106CFU/mL的接种量接种于YPD液体培养基中，在28℃的条件下生长24h，以YPD液体培养基作为空白对照,在600nm处测定菌悬液OD值,平行重复3次，测定出菌株的生长曲线。生长曲线如图3所示。
本发明对分离的酵母菌株还进行了理化性质分析。具体为酒精度、残糖量、总酸、pH等做出分析。主要对菌株的产酒精能力、产香能力等做出科学的评价。在此过程中发现RM12的产酒精能力和产香能力较强，在果酒中有着较高的醇类物质和酯类物质，因此它们具有很好的的利用价值。蓝莓酒的香气物质如下表1 所示。
表1蓝莓酒的主要香气成分和相对百分比(％)
Figure BDA0003545978010000061
Figure BDA0003545978010000071
n.d.表示未发现
本发明还涉及酵母菌在蓝莓果酒中的应用。
本发明以蓝莓果酒为研究对象，将蓝莓果实破碎后加入等质量的无菌水，放在室温环境下自然发酵。将不同编号的酵母分别进行分离纯化，直到长出纯的酵母菌落。对酵母的形态以及生理生化特征进行科学有效的分析与鉴定，RM12产香能力最强，发酵性能较好，有一定的产酒精能力。在发酵过程中，总糖、乙醇、总酸等都呈现出不同的变化。发酵过程中，也逐渐产生多种酸类物质提高了总酸含量，比如乙酸、己酸等产物，也产生了多种脂类物质，比如甲酸异戊酯、乳酸乙酯、琥珀酸单乙酯等。该菌株适合用于蓝莓果酒的生产。
实施案例1采用RM12与X16混合发酵蓝莓果酒，对比例1采用商业酵母 X16单独发酵蓝莓果酒。在其他发酵条件相同的情况下，果酒的理化指标见表2。
表2蓝莓果酒主要参数对比
Figure BDA0003545978010000081
从表1和表2可知，将本发明筛选得到的酵母菌应用于蓝莓果酒的发酵过程，酒精度、总酸、pH相差不大，但是筛选的酵母与商业酵母混合发酵残糖量略低于商业酵母单菌发酵，有本发明筛选得到的酵母参与的蓝莓酒，富含更多的香气挥发物质，综合果酒的感官评价，RM12在蓝莓果酒生产中具有一定的利用价值。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明保护的内容主要包括从蓝莓上筛选的酵母RM12以及此酵母用于蓝莓果酒的酿造方法。但本发明的保护范围并不限于此，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围内为准。
真菌通用引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003545978010000091
序列表
<110> 常州大学
山西晟禾生物科技有限公司
江苏碧奥环保科技有限公司
<120> 一株非酿酒酵母RM12及其在蓝莓酒中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 737
<212> DNA
<213> Hanseniaspora uvarum
<400> 1
cccttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attagattga attatcattg ttgctcgagt 60
tcttgtttag atcttttaca ataatgtgta tctttattga agatgtgcgc ttaattgcgc 120
tgctttttta aagtgtcgca gtgaaagtag tcttgcttga atctcagtca acgctacaca 180
cattggagtt tttttacttt aatttaattc tttctgcttt gaatcgaaag gttcaaggca 240
aaaaacaaac acaaacaatt ttattttatt ataatttttt aaactaaacc aaaattccta 300
acggaaattt taaaataatt taaaactttc aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat 360
gaagaacgta gcgaattgcg ataagtaatg tgaattgcag atactcgtga atcattgaat 420
ttttgaacgc acattgcgcc cttgagcatt ctcaggggca tgcctgtttg agcgtcattt 480
ccttctcaaa agataattta ttattttttg gttgtgggcg atactcaggg ttagcttgaa 540
attggagact gtttcagtct tttttaattc aacacttagc ttctttggag acgctgttct 600
cgctgtgatg tatttatgga tttattcgtt ttactttaca agggaaatgg taacgtacct 660
taggcaaagg gttgctttta atattcatca agtttgacct caaatcaggt aggattaccc 720
gctgaactta agcatat 737

Claims (6)

1.一株非酿酒酵母RM12，其特征在于，该非酿酒酵母RM12为葡萄汁有孢汉逊酵母，该非酿酒酵母RM12是从常州市售蓝莓果实上分离的野生非酿酒酵母，已于2021年01月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.21758。
2.如权利要求1所述的非酿酒酵母RM12的应用，其特征在于，蓝莓果酒由所述非酿酒酵母葡萄汁有孢汉逊酵母菌RM12与商业酵母X16在蓝莓果酒混合发酵获得。
3.如权利要求2所述的非酿酒酵母RM12的筛选，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取常州市售新鲜的蓝莓，除去污渍泥土等杂质；将蓝莓在无菌条件下破碎处理，称取100g分别装入500mL无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃生化培养箱中培养2-3d；待观察到有气泡产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液；
(2)将步骤(1)所述稀释液均匀涂布于含有氯霉素的TTC下层培养基中，在28℃恒温培养箱中生长24h后，倒入TTC上层培养基，避光倒置培养2h；观察培养基颜色的变化，TTC试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物；
(3)挑取步骤(2)所得显深红色的菌株划线接种到YPD固体培养基上，在28℃的恒温培养箱中生长1-2d，观察菌落表观特性，选取出具有典型酵母特征的单菌落，进行2-3次平板化线，得到单个菌落接种到YPD液体培养基中培养；根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到WL培养基上对酵母做进一步纯化，观察酵母的生长状态；同时挑取YPD固体平板上纯的单克隆菌株，置于显微镜下观察细胞形态；
(4)采用试剂盒提取法提取纯菌株的基因组DNA；以引物ITS1和ITS4扩增其26S rDNA的D1/D2区域；取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；PCR产物送去检测公司进行测序，测序结果在NCBI上进行BLAST同源序列搜索比对；
(5)对分离的酵母菌进行生长性能分析、理化性质分析及香气成分分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。
4.如权利要求2所述的非酿酒酵母RM12的筛选，其特征在于，所述步骤(1)中，果实与无菌水的质量比是1:1，保证部分果实表面暴露在空气中。
5.如权利要求2所述的非酿酒酵母RM12的筛选，其特征在于，所述步骤(2)中，稀释过程稀释至10-4-10-6，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察，发酵和培养温度均为28℃，通风条件下进行；TTC下层培养基中添加适量氯霉素，以抑制杂菌生长；倒入TTC上层培养基后，避光倒置培养，以观察显色状况。
6.如权利要求2所述的非酿酒酵母RM12的筛选，其特征在于，所述步骤(3)中，稀释过程应稀释至10-4-10-6，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察；发酵和培养温度均为28℃，通风条件下进行；运用平板划线法对菌株进行纯化，次数至少达2-3次，保证尽量获得纯菌；所述步骤(3)中，菌株镜检前需将挑取的菌株经草酸铵结晶紫简单染色，再置于显微镜下观察细胞形态。
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