CN110241024A

CN110241024A - 一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法

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Publication number: CN110241024A
Application number: CN201910509457.8A
Authority: CN
Inventors: 靳国杰; 荆思雨; 陶永胜; 张洪艳; 胡海莲
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2019-09-17

Abstract

本发明为一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其以培养基中丁二酸酯为筛选压力，使目标菌株逐渐富集，分离纯化富集后的菌群得到目标菌株，再测定其类丁二酸酯生产能力，得到类丁二酸酯生产菌。本发明采用的筛选方法为：在菌源扩大培养过程中，以类丁二酸酯作为培养基的唯一碳源，并逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得单菌落，检测获得的菌株的类丁二酸酯生产能力，获得类丁二酸酯生产菌株。本发明有助于提高筛选类丁二酸酯高产菌的机率，简化操作步骤，降低工作量，提高筛选效率。本发明为类丁二酸酯生产菌的筛选提供了简单高效的新技术。

Description

一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法

一、技术领域：

本发明涉及微生物育种技术领域，具体涉及一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其在类丁二酸酯的环境压力下，类丁二酸酯生产菌在菌源微生物群增殖的过程中，逐渐富集，最后被分离纯化。

二、背景技术：

类丁二酸酯包括琥珀酸、苹果酸、酒石酸的甲醇酯、乙醇酯、丙醇酯、丁醇酯、戊醇酯、己醇酯、芳香酯、甘油酯等单酯和二酯，具有水果清香味、发酵味和花香香气特征。由于类丁二酸酯可作为食品添加剂、有机合成中间体、定香剂、润滑剂与增塑剂等，近年来已被广泛应用于食品、保健品、化妆品、香料、涂料、医药、橡胶与塑料产业等，且市场需求还在逐渐加大。但类丁二酸酯天然来源并不丰富，目前其制备主要以类丁二酸与无水乙醇为底物，采用化学反应合成。

相比较于强酸或金属化合物催化的化学合成法，微生物法生产类丁二酸酯具有无污染、无毒副作用、无腐蚀性且活性产物含量高的优点。一些微生物，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、贝酵母（Saccharomyces baynanus）、柠檬形克勒克氏酵母（Kloeckera apiculata）、异性汉逊酵母（Hansenula anaomala）、球拟酵母（Torulopsis）、假丝酵母（Candida）、酒酒球菌（Oenococcus oeni）等都具有较强的类丁二酸生产能力。在这些微生物细胞中，以糖代谢产生的酰基基团（琥珀酰、苹果酰等）和发酵液中的琥珀酸、苹果酸、酒石酸等为主要供体，乙醇、芳香醇等是反应辅助物合成类丁二酸酯，生成的类丁二酸酯通过扩散作用，穿过细胞膜进入到发酵液中。

目前，利用已有菌株生产类丁二酸酯受到低产量的制约。构建基因工程菌株是提高微生物法生产类丁二酸酯产量的手段之一，但操作过程比较复杂，且由于基因工程菌株潜在的安全问题，人们还没有普遍接受基因工程菌株在食品、保健等行业的应用。

然而，目前对于类丁二酸酯生产菌的筛选研究较少，使用的筛选方法一般是从菌源中分离出单菌株，再逐个测定其类丁二酸酯的生产能力，这种方法随机性强且工作量大，无法高效地获得高产菌株。另一方面，已从乳制品或发酵产品中筛选出的类丁二酸酯生产菌的产量较低，无法满足生产需要。已有研究显示，其主要限制因素是菌株细胞内酶的种类和活性。在酯酶或酰基转移酶的作用下，类丁二酸-酰基辅酶A与醇生成类丁二酸酯。而酯酶的存在也可使类丁二酸酯被分解为类丁二酸，参与其他的生命代谢。因此微生物类丁二酸酯的生产能力与其类丁二酸酯的利用能力密切相关。基于这一原理，控制培养基中类丁二酸酯，可使类丁二酸酯生产菌株逐渐富集，从富集了大量目标菌株的菌群中分离纯化单菌株，进行类丁二酸酯生产能力的测定，能够有效地提高筛选效率。

三、发明内容

本发明的提供一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其以培养基中丁二酸酯为筛选压力，使目标菌株逐渐富集，分离纯化富集后的菌群得到目标菌株，再测定其类丁二酸酯生产能力，得到类丁二酸酯生产菌。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法为：在菌源扩大培养过程中，以类丁二酸酯作为培养基的唯一碳源，并在多轮培养中逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得单菌落，检测获得的菌株的类丁二酸酯生产能力，获得类丁二酸酯生产菌株。

所述的菌源为动物、昆虫或人的皮肤、饲料、发酵肉制品、发酵蔬菜产品、发酵酒精产品、水果制品、植物果实表皮、植物分泌物、腐败食物、土壤、天然水、空气、动物或人的胃液、肠液、粪便、乳汁、乳制品、沼液、堆肥、污水、活性污泥中的一种或其组合。

所述的类丁二酸酯为琥珀酸、苹果酸、酒石酸的甲醇酯、乙醇酯、丙醇酯、丁醇酯、戊醇酯、己醇酯、芳香酯、甘油酯中的一种或其组合。

所述的类丁二酸酯为单酯、二酯中的一种或其组合。

所述的类丁二酸酯的量为0.01 g/L-200 g/L。

所述的用于扩大培养的培养基为液态、固态、或半固态。

所述的扩大培养的温度为8 °C ~50 °C。

所述的扩大培养的转速为0 r/min~1000 r/min。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

本发明利用类丁二酸酯为筛选压力，在培养过程中，类丁二酸酯生产能力强的菌株得到了富集。

本发明有助于提高筛选类丁二酸酯高产菌的机率，简化操作步骤，降低工作量，提高筛选效率。

本发明筛选过程目的性强、工作量少且得到的类丁二酸酯生产菌产量高、产物活性强，同时，也不需要对菌株进行复杂的基因工程改造，过程简单易行且成本较低。

本发明方法与强酸催化、金属化合物催化等方法相比，具有推动经济环保、且产物活性更高的微生物法生产类丁二酸酯的发展。

本发明方法与基因工程法相比，具有过程简单易行、对设备要求低，且得到的菌株无潜在风险，更容易被人们接受。

本发明方法与传统的丁二酸酯生产菌的筛选方法相比，以丁二酸酯为筛选压力，使目标菌株逐步富集，再从富集了目标菌株的菌群中分离纯化出单菌株，逐个检测其类丁二酸酯的生产能力，筛选阳性率高，工作量少，显著提高了筛选效率。

四、具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定：

本发明为一种类丁二酸（琥珀酸、苹果酸、酒石酸）酯生产菌的筛选方法，是将菌源接入到以类丁二酸酯为唯一碳源的培养基中培养，培养过程中逐步提高类丁二酸酯的浓度，最后挑取单菌落，考察其类丁二酸酯的生产能力，获得类丁二酸酯生产菌。本发明利用类丁二酸酯为筛选压力，在培养过程中，类丁二酸酯生产能力强的菌株得到了富集。

本发明通过下述技术方案予以实现：

1、将菌源接入到含丁二酸酯的培养基上，在一定温度下进行培养，此为第一轮筛选；

2、将（1）获得的菌液按照（1）的方法再次接入到丁二酸酯含量提高的培养基中，进行第二轮筛选。以此方法进行多轮筛选；

3、多轮筛选后，将菌液接种到固体培养基上，进行分离纯化，获得单菌落。

4、检测（3）获得的菌株的类丁二酸酯生产能力，获得类丁二酸酯生产菌。

本发明所述的类丁二酸酯生产能力检测实验是指将待测菌株接种到WL培养基（酵母和霉菌）或MRS培养基（细菌）中，接种量为1×10⁷cfu/mL，在30 °C（酵母和霉菌）或37 °C（细菌）条件下，180 r/min，发酵72 h。然后，发酵液离心（7000 r/min、8 min），取上清，采用固相微萃取-气质联用法测定上清中类丁二酸酯的含量。相关培养条件和测定方法参考文献（Food Chemistry, 2018, 239: 495–501）。

实施方式：

本发明为一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其是在菌源扩大培养过程中，以类丁二酸酯作为培养基的唯一碳源，并逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得类丁二酸酯生产菌株。

所述菌源为动物、昆虫或人的皮肤、饲料、发酵肉制品、发酵蔬菜产品、发酵酒精产品、水果制品、植物果实表皮、植物分泌物、腐败食物、土壤、天然水、空气动物或人的胃液、肠液、粪便、乳汁、乳制品、沼液、堆肥、污水、活性污泥中的一种或它们的必要组合。

添加的类丁二酸酯为琥珀酸、苹果酸、酒石酸的甲醇酯、乙醇酯、丙醇酯、丁醇酯、戊醇酯、己醇酯、芳香酯、甘油酯中的一种或它们的必要组合。添加的类丁二酸酯为单酯、二酯中的一种或它们的必要组合。添加类丁二酸酯的量为0.01 g/L-200 g/L（质量/体积）。用于扩大培养的培养基为液态、固态、或半固态。扩大培养的温度为8 °C ~50 °C。扩大培养的转速为0 r/min~1000 r/min。

实施例1：

以自然发酵的山葡萄醪液为菌源，以琥珀酸二乙酯替换以下WL营养琼脂固体培养基和WL液体培养基中碳源——葡萄糖。

取200 μL菌源液涂布到含1 g/L琥珀酸二乙酯的WL营养琼脂固体培养基平板上，28 °C下静置培养72 h，用1 mL WL液体培养基将培养获得的菌苔洗下，并接种到50 mL WL液体培养基中，28 °C，180 r/min下培养24 h，此为第一轮筛选；

取第一轮筛选获得的菌液200 μL接种至含10 g/L琥珀酸二乙酯的WL营养琼脂固体培养基平板上，28 °C下静置培养72 h，用1 mL WL液体培养基将培养获得的菌苔洗下，并接种到50 mL WL液体培养基中，28 °C，180 r/min下培养24 h，此为第二轮筛选；

取第二轮筛选获得的菌液200 μL接种至含50 g/L琥珀酸二乙酯的WL营养琼脂固体培养基上中，28 °C下静置培养72 h，用1 mL WL液体培养基将培养获得的菌苔洗下，并接种到50 mL WL液体培养基中，28 °C，180 r/min下培养24 h，此为第三轮筛选；

取第三轮筛选获得的菌液200 μL接种至WL营养琼脂固体培养基中，28 °C培养至长出明显菌落，用接种针随机挑选100个单菌落，测定各菌株的类丁二酸酯生产能力。

结果显示，91株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为2.4±0.1 g/L，苹果酸二乙酯含量为1.3±0.06 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例2

其他操作条件同实施例1，但菌源为发霉的番茄汁，培养基为马铃薯葡萄糖培养基。

结果显示，56株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为4.4±0.08 g/L，苹果酸二乙酯含量为2.0±0.04 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例3

其他操作条件同实施例1，但菌源为东北自然发酵的酸菜汁，培养基为MRS培养基，培养温度为37 °C。

结果显示，78株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为1.2±0.03 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.8±0.04 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例4

其他操作条件同实施例1，但培养中以琥珀酸二丙酯作为唯一碳源。

结果显示，89株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二丙酯含量为0.8±0.01 g/L，琥珀酸二乙酯含量为1.8±0.1 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.7±0.02 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例5

其他操作条件同实施例1，但培养中以琥珀酸二苯乙醇酯作为唯一碳源。

结果显示，32株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二苯乙醇酯含量为0.5±0.01 g/L，琥珀酸二乙酯含量为1.5±0.12 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例6

其他操作条件同实施例1，但培养中以琥珀酸单乙酯作为唯一碳源。

结果显示，95株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸单乙酯含量为0.1±0.01 g/L，琥珀酸二乙酯含量为2.1±0.12 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.9±0.05 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例7

其他操作条件同实施例1，但培养中以苹果酸二乙酯作为唯一碳源。

结果显示，88株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中苹果酸二乙酯含量为1.4±0.01 g/L，琥珀酸二乙酯含量为2.1±0.18 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例8

其他操作条件同实施例1，但培养中以酒石酸二乙酯作为唯一碳源，类丁二酸酯生产能力检测实验中培养基里添加10 g/L酒石酸。

结果显示，61株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中酒石酸二乙酯含量为0.6±0.03 g/L，苹果酸二乙酯含量为1.1±0.11 g/L，琥珀酸二乙酯含量为1.8±0.13 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例9

其他操作条件同实施例1，但进行五轮筛选，各轮培养基中琥珀酸二乙酯含量分别为0.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、60.0 g/L。

结果显示，95株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为3.6±0.22 g/L，苹果酸二乙酯含量为2.1±0.11 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例10

其他操作条件同实施例1，但进行八轮筛选，各轮培养基中琥珀酸二乙酯含量分别为0.2 g/L、2.0 g/L、3.5 g/L、7.0 g/L、14.0 g/L、28.0 g/L、56.0 g/L、70.0 g/L。

结果显示，98株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为3.8±0.23 g/L，苹果酸二乙酯含量为2.3±0.1 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例11

其他操作条件同实施例1，但培养基均为液态。

结果显示，45株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为1.4±0.12 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.7±0.05 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例12

其他操作条件同实施例1，但培养基均为半固态。

结果显示，51株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为1.7±0.15 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.9±0.05 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例13

其他操作条件同实施例1，但培养温度为18 °C。

结果显示，73株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为1.9±0.09 g/L，苹果酸二乙酯含量为1.1±0.07 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例14

其他操作条件同实施例1，但培养温度为40 °C。

结果显示，38株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为1.1±0.07 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.6±0.06 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例15

其他操作条件同实施例1，但培养基为液态，培养转速为80 r/min。

结果显示，34株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为1.1±0.07 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.3±0.02 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

实施例16

其他操作条件同实施例1，但培养基为液态，培养转速为250 r/min。

结果显示，63株菌是类丁二酸酯生产菌，其中生产能力最强的菌株发酵液中琥珀酸二乙酯含量为1.7±0.12 g/L，苹果酸二乙酯含量为0.8±0.05 g/L，其它类丁二酸酯含量低于0.1 g/L。

对比实施例1

其他操作条件同实施例1，但筛选过程中，在培养基中保留原来碳源，不添加琥珀酸二乙酯。结果显示，未发现类丁二酸酯生产菌。比较实施例1与对比实施例1的结果，表明在琥珀酸二乙酯的环境压力下，可实现类丁二酸酯生产菌的富集，显著提高获得类丁二酸酯生产菌的机率，有效减少筛选工作量。

本发明方法具有操作简便、仪器要求低、潜在风险少的优点，而且，我国国土面积广阔，生态地理条件复杂多样，微生物资源丰富，为类丁二酸酯生产菌的筛选提供了基础。

本发明类丁二酸酯作为唯一碳源替代了培养基的原有碳源，替代前的培养基为YPD培养基、WL营养琼脂培养基、动物或人的乳汁、乳制品、马铃薯葡萄糖培养基、麦芽浸汁培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、孟加拉红培养基、高盐察氏培养基（Czapck）、酵母粉葡萄糖氯霉素琼脂培养基、米曲培养基、改良马丁培养基、沙堡弱培养基（SDA）、改良SDA培养基、Lafon-Lafourcade培养基、Dubois培养基、MRS（Man, Rogosa and Sharp）培养基、酸性番茄汁培养基（ATB）、葡萄糖-酵母膏培养基、乳糖发酵培养基（LB）、番茄汁培养基（TJB）、乳清透析液培养基（WPM）、乳酸钠培养基（SLM）、营养肉汤培养基（NB）、M17培养基、改良M17基础培养基、LBS培养基、SL培养基、HP培养基中的一种或其组合。

本发明经济、环保、简单、安全、高效，为筛选类丁二酸酯生产菌提供了新思路和新技术，对类丁二酸二乙酯合成产业的发展具有重要意义。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书内容所做的等同结构变化，均应包含在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法为：在菌源扩大培养过程中，以类丁二酸酯作为培养基的唯一碳源，并在多轮培养中逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得单菌落，检测获得的菌株的类丁二酸酯生产能力，获得类丁二酸酯生产菌株。

2.根据权利要求1所述的一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的菌源为动物、昆虫或人的皮肤、饲料、发酵肉制品、发酵蔬菜产品、发酵酒精产品、水果制品、植物果实表皮、植物分泌物、腐败食物、土壤、天然水、空气、动物或人的胃液、肠液、粪便、乳汁、乳制品、沼液、堆肥、污水、活性污泥中的一种或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的类丁二酸酯为琥珀酸、苹果酸、酒石酸的甲醇酯、乙醇酯、丙醇酯、丁醇酯、戊醇酯、己醇酯、芳香酯、甘油酯中的一种或其组合。

4.根据权利要求3所述的一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的类丁二酸酯为单酯、二酯中的一种或其组合。

5.根据权利要求4所述的一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的类丁二酸酯的量为0.01 g/L-200 g/L。

6.根据权利要求5所述的一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的用于扩大培养的培养基为液态、固态、或半固态。

7.根据权利要求6所述的一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的扩大培养的温度为8 °C ~50 °C。

8.根据权利要求7所述的一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其特征在于：所述的扩大培养的转速为0 r/min~1000 r/min。