CN108893413A - 一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其通过创造筛选压力实现共轭亚油酸生产菌的高效筛选，筛选过程目的性强、工作量少且筛选结果阳性率高。得到的共轭亚油酸生产菌产量高且产物活性强。同时，也不需要对菌株进行复杂的基因工程改造，过程简单易行且成本较低。本发明采用的技术方案为：在菌源扩大培养过程中，向培养基加入含亚油酸的物质和油脂乳化剂，并逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得共轭亚油酸生产菌株。
Description
一、技术领域：
本发明涉及微生物育种技术领域，具体涉及一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法。
二、背景技术：
共轭亚油酸是一系列亚油酸位置与几何的共轭异构体。近年来，共轭亚油酸凭借在抗癌、减肥、增强免疫力、防止动脉硬化等方面的生理功能，已被广泛应用于药品、食品、保健品与化妆品产业。但共轭亚油酸天然来源并不丰富，目前其制备主要以亚油酸为底物、经化学合成或生物转化进行。
相比较于碱催化或金属化合物催化的化学合成法，微生物法生产共轭亚油酸无毒副作用且活性产物含量高。一些丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、乳酸菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳球菌属（Lactococcus）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、肠球菌属（Enterococcus）和链球菌属（Streptococcus）等的瘤胃微生物和食品级微生物，都能够通过亚油酸异构酶的异构作用或水化-脱水异构作用将自由脂肪酸形式存在的亚油酸转化为共轭亚油酸。另一方面，目前多使用富含亚油酸的食用油，如红花油、大豆油、葵花籽油、苜蓿油等进行共轭亚油酸的生产，而产油微生物能够利用农业废物积累超过70%自身细胞干重的共轭亚油酸。由于对农业废物的高效利用和低廉的生产成本，“农业废物-微生物油脂-共轭亚油酸”的生产模式具有巨大潜力。
综上所述，微生物法生产共轭亚油酸具有无毒害、活性高、环境友好和成本低廉的优点，然而其发展受到较低的产量和转化率的制约。构建基因工程菌株提高微生物法生产共轭亚油酸产量的手段之一，但操作过程比较复杂，并且由于基因工程菌株的潜在安全问题，人们还没有普遍接受基因工程菌株在食品、保健等行业的应用。筛选高产菌株是提高微生物法生产共轭亚油酸效率的另一重要途径，具有操作简便、仪器要求低、潜在风险少的优点。然而，尽管目前已从乳制品或发酵产品中得到许多产量超过20 μg/ml的共轭亚油酸生产菌，使用的筛选方法一般是从菌源中分离出单菌株，再逐个测定其共轭亚油酸生产能力，这种方法随机性强且工作量大，无法高效地获得高产菌株。目前已有研究尝试利用共轭亚油酸生产菌的部分特征作为筛选标准，或简化甚至省略产物萃取步骤（Romero-Pérez GA,Inoue R, Ushida K, Yajima T. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry,2013, 77, 649），以优化筛选过程、加快筛选速度，但没有目标菌株的富集过程，筛选效率仍然没有显著提高。
已有研究显示，许多共轭亚油酸生产菌产量较低的原因是对亚油酸耐受能力偏低。亚油酸能够使分子性状发生扭曲，进而破坏细胞膜的脂双层，所以当大量亚油酸被微生物吸收并与细胞膜结合时，可导致细胞死亡。因此，微生物的共轭亚油酸生产能力与其对亚油酸毒性的耐受能力密切相关。基于这一原理，以培养基中浓度逐步提高的亚油酸为筛选压力，可使共轭亚油酸生产菌株逐渐富集，从富集了大量目标菌株的菌群中分离纯化单菌株进行共轭亚油酸生产能力的测定，有效地提高筛选效率。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其通过创造筛选压力实现共轭亚油酸生产菌的高效筛选，筛选过程目的性强、工作量少且筛选结果阳性率高。得到的共轭亚油酸生产菌产量高且产物活性强。同时，也不需要对菌株进行复杂的基因工程改造，过程简单易行且成本较低。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：在菌源扩大培养过程中，向培养基加入含亚油酸的物质和油脂乳化剂，并逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得共轭亚油酸生产菌株。
筛选方法包括以下步骤：
（1）、将菌源接入到含亚油酸的固体培养基上，在一定温度下进行培养。培养获得的菌苔用液体培养基洗下，并在一定温度下进行培养，此为第一轮筛选；
（2）、将（1）获得的菌液按照（1）的方法接入到亚油酸浓度提高的固体培养基下，进行第二轮筛选。以此方法进行多轮筛选；
（3）、对每轮筛选获得菌液，进行共轭亚油酸生产能力测定；
（4）、将共轭亚油酸生产能力最高的菌液接种到固体培养基上，进行分离纯化，获得共轭亚油酸生产菌。
所述菌源为动物或人的胃液、肠液、粪便、乳汁、皮肤、乳制品、发酵肉制品、发酵蔬菜产品、饲料、沼液、堆肥、污水、活性污泥、土壤、天然水、空气中的一种或多种组合。
所述用于扩大培养的培养基为动物或人的乳汁、乳制品、Lafon-Lafourcade培养基、Dubois培养基、MRS培养基、酸性番茄汁培养基、葡萄糖-酵母膏培养基、乳糖发酵培养基、番茄汁培养基、乳清透析液培养基、乳酸钠培养基、营养肉汤培养基、M17培养基、改良M17基础培养基、LBS培养基、SL培养基、HP培养基中的一种或两种以上的组合。
所述扩大培养的温度为10 ℃～45 ℃。
所述添加的含亚油酸的物质为亚油酸、亚油酸短链醇酯、亚油酸甘油酯、脂肪酸组成中含亚油酸的植物油、动物油及其水解物中的一种或两种以上的组合。
所述添加含亚油酸的物质的量为0.01 g/L～100 g/L并在该范围内逐步提高。
所述添加油脂乳化剂的体积量为0.001%～10%。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明与碱催化、金属化合物催化等方法相比，可推动经济环保、且产物活性更高的微生物法生产共轭亚油酸的发展。
2、本发明与基因工程法获得共轭亚油酸生产菌相比，过程简单易行、对设备要求低，且得到的菌株无潜在风险，更容易被人们接受。
3、本发明与传统的共轭亚油酸生产菌的筛选方法相比，以浓度逐步提高的亚油酸为筛选压力，使目标菌株逐步富集，再从富集了目标菌株的菌群中分离纯化出单菌株，逐个验证其共轭亚油酸生产能力，有助于提高筛选共轭亚油酸高产菌的机率，简化操作步骤，筛选阳性率高，工作量少，显著提高了筛选效率。
4、通过本发明筛选方法获得共轭亚油酸生产菌株的共轭亚油酸转化率为0.1%～100%。
5、本发明经济、环保、简单、安全、高效，为筛选共轭亚油酸生产菌提供了新思路和新技术，对共轭亚油酸合成产业的发展具有重要意义。
四、具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定：
本发明是在亚油酸的环境压力下，共轭亚油酸生产菌在菌源微生物群增殖的过程中，逐渐富集，最后被分离纯化。
本发明以培养基中浓度不断提高的亚油酸为筛选压力，使目标菌株逐渐富集，分离纯化富集后的菌群得到单菌株，再逐个测定其共轭亚油酸生产能力，得到共轭亚油酸生产菌。
具体技术方案包括：
（1）、将菌源接入到含亚油酸的固体培养基上，在一定温度下进行培养。培养获得的菌苔用液体培养基洗下，并在一定温度下进行培养，此为第一轮筛选；
（2）、将（1）获得的菌液按照（1）的方法接入到亚油酸浓度提高的固体培养基下，进行第二轮筛选。以此方法进行多轮筛选；
（3）、对每轮筛选获得菌液，进行共轭亚油酸生产能力测定；
（4）、将共轭亚油酸生产能力最高的菌液接种到固体培养基上，进行分离纯化，获得共轭亚油酸生产菌。
本发明所述的共轭亚油酸生产能力为单位菌体共轭亚油酸产量，即共轭亚油酸产量与菌株干重的比值，单位为mg/g。共轭亚油酸转化率为共轭亚油酸产量与亚油酸添加量的比值，用百分率表示。共轭亚油酸产量的测定可参照参考文献（Barrett E, Ross RP,Fitzgerald GF, Stanton C. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73,2333）的方法；菌株干重测定方法为：离心定量菌液，再将得到的菌体经两次生理盐水洗涤后烘干至恒重，离心条件为7000 r/min转速下离心8 min，烘干温度为50 ℃。
实施例1
以自然发酵的东北酸菜汁为菌源，接入到含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中，30 °C下静置培养72 h，用MRS液体培养基将培养获得的菌苔洗下，30 °C下培养72 h后，此为第一轮筛选。将第一轮筛选获得的菌液接种至含2 g/L亚油酸的固体培养基上培养，进行第二轮筛选。共进行七轮筛选，培养基中亚油酸浓度分别为1 g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、16 g/L、32g/L、64 g/L，油脂乳化剂（吐温-80）与亚油酸浓度相同。为测定每一轮菌群的共轭亚油酸生产能力，取该轮筛选获得的部分菌液，添加2 g/L的亚油酸，30 °C下培养36 h后进行产物测定。结果显示，七轮菌液对应的共轭亚油酸生产能力分别为1 mg/g、4 mg/g、20 mg/g、90mg/g、150 mg/g、300 mg/g和240 mg/g。选择共轭亚油酸生产能力最高的第六轮菌液进行分离纯化。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，98株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有38株。
实施例2
其他操作条件同实施例1，但菌源为酸奶。经过七轮筛选后，第五轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，99株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有40株。
实施例3
其他操作条件同实施例1，但菌源为牛粪便。经过七轮筛选，第六轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，78株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有15株。
实施例4
其他操作条件同实施例1，但菌源为发酵香肠。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，82株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有27株。
实施例5
其他操作条件同实施例1，但使用番茄汁培养基（TJB）替代MRS培养基。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的TJB固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，95株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有30株。
实施例6
其他操作条件同实施例1，但使用葡萄糖-酵母膏培养基替代MRS培养基。经过七轮筛选，第五轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的葡萄糖-酵母膏培养基固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，88株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有22株。
实施例7
其他操作条件同实施例1，但使用MRS培养基进行固体筛选，使用葡萄糖-酵母膏培养基进行液体扩培。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，90株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有28株。
实施例8
其他操作条件同实施例1，但使用酸性番茄汁培养基（ATB）进行固体筛选，使用葡萄糖-酵母膏培养基进行液体扩培。经过六轮筛选，第六轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的ATB固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，78株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有21株。
实施例9
其他操作条件同实施例1，但使用MRS半固体培养基进行筛选，使用MRS液体培养基进行扩培。经过七轮筛选，第六轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，92株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有29株。
实施例10
其他操作条件同实施例1，但筛选过程全部使用液体MRS培养基。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，76株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有19株。
实施例11
其他操作条件同实施例1，但筛选过程全部使用液体葡萄糖-酵母膏培养基。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的葡萄糖-酵母膏固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，74株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有18株。
实施例12
其他操作条件同实施例1，但培养中温度为40 ℃。经过七轮筛选，第六轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，95株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有35株。
实施例13
其他操作条件同实施例1，但培养中温度为15 ℃。经过七轮筛选，第六轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，83株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有25株。
实施例14
其他操作条件同实施例1，但使用亚油酸短链醇酯替代亚油酸。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，70株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有15株。
实施例15
其他操作条件同实施例1，但使用亚油酸甘油酯替代亚油酸。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，50株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有11株。
实施例16
其他操作条件同实施例1，但使用葡萄籽水解物替代亚油酸。经过七轮筛选，第六轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，98株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有33株。
实施例17
其他操作条件同实施例1，但使用葡萄籽油替代亚油酸。经过七轮筛选，第三轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，48株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有10株。
实施例18
其他操作条件同实施例1，但使用红花油替代亚油酸。经过七轮筛选，第六轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，45株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有9株。
实施例19
其他操作条件同实施例1，但使用大豆油替代亚油酸。经过七轮筛选，第五轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，35株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有8株。
实施例20
其他操作条件同实施例1，但亚油酸浓度依次为0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.8 g/L、1.6 g/L、3.2 g/L、6.4 g/L。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含0.1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，25株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有13株。
实施例21
其他操作条件同实施例1，但亚油酸浓度依次为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，96株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有30株。
实施例22
其他操作条件同实施例1，但亚油酸浓度依次为0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、100 g/L。经过四轮筛选，第三轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，93株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有29株。
实施例23
其他操作条件同实施例1，但亚油酸浓度依次为0.2 g/L、1 g/L、5 g/L、25 g/L、100 g/L。经过五轮筛选，第四轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，94株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有31株。
实施例24
其他操作条件同实施例1，但亚油酸浓度依次为0.1 g/L、0.5 g/L、1.5 g/L、7.5 g/L、15 g/L、30 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、100 g/L。经过十轮筛选，第五轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，96株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有32株。
实施例25
其他操作条件同实施例1，但油脂乳化剂（吐温-80）的浓度全部设为0.001%。经过七轮筛选，第七轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，76株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有18株。
实施例26
其他操作条件同实施例1，但油脂乳化剂（吐温-80）的浓度全部设定为10%。经过七轮筛选，第五轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，95株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有30株。
实施例27
其他操作条件同实施例1，但油脂乳化剂（吐温-80）的浓度为亚油酸浓度的二分之一。经过七轮筛选，第五轮菌群共轭亚油酸生产能力最高。将该轮菌液接种至含1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，随机挑选100个单菌落。经测定，86株菌是共轭亚油酸生产菌。其中，共轭亚油酸转化率高于50%的有21株。
对比实施例1
其他操作条件同实施例1，但筛选过程中，在培养基里不参加亚油酸。将每轮筛选的菌液接种至含有1 g/L亚油酸的MRS固体培养基中培养，分别随机挑选100个菌株。经测定，共轭亚油酸生产菌分别有1株、2株、1株、2株、2株、2株和2株。比较实施例1与对比实施例1的结果，表明在亚油酸的环境压力下，可实现共轭亚油酸生产菌的富集，显著提高获得共轭亚油酸生产菌的机率，有效减少筛选工作量。
Claims (8)
1.一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：在菌源扩大培养过程中，向培养基加入含亚油酸的物质和油脂乳化剂，并逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得共轭亚油酸生产菌株。
2.根据权利要求1所述的一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、将菌源接入到含亚油酸的固体培养基上，在一定温度下进行培养，培养获得的菌苔用液体培养基洗下，并在一定温度下进行培养，此为第一轮筛选；
（2）、将（1）获得的菌液按照（1）的方法接入到亚油酸浓度提高的固体培养基下，进行第二轮筛选，以此方法进行多轮筛选；
（3）、对每轮筛选获得菌液，进行共轭亚油酸生产能力测定；
（4）、将共轭亚油酸生产能力最高的菌液接种到固体培养基上，进行分离纯化，获得共轭亚油酸生产菌。
3.根据权利要求1或2所述的一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：所述菌源为动物或人的胃液、肠液、粪便、乳汁、皮肤、乳制品、发酵肉制品、发酵蔬菜产品、饲料、沼液、堆肥、污水、活性污泥、土壤、天然水、空气中的一种或多种组合。
4.根据权利要求3所述的一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：所述用于扩大培养的培养基为动物或人的乳汁、乳制品、Lafon-Lafourcade培养基、Dubois培养基、MRS培养基、酸性番茄汁培养基、葡萄糖-酵母膏培养基、乳糖发酵培养基、番茄汁培养基、乳清透析液培养基、乳酸钠培养基、营养肉汤培养基、M17培养基、改良M17基础培养基、LBS培养基、SL培养基、HP培养基中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求4所述的一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：所述扩大培养的温度为10 ℃～45 ℃。
6.根据权利要求5所述的一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：所述添加的含亚油酸的物质为亚油酸、亚油酸短链醇酯、亚油酸甘油酯、脂肪酸组成中含亚油酸的植物油、动物油及其水解物中的一种或两种以上的组合。
7.根据权利要求6所述的一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：所述添加含亚油酸的物质的量为0.01 g/L～100 g/L并在该范围内逐步提高。
8.根据权利要求7所述的一种共轭亚油酸生产菌的筛选方法，其特征在于：所述添加油脂乳化剂的体积量为0.001%～10%。
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2018
- 2018-07-20 CN CN201810802197.9A patent/CN108893413A/zh active Pending
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