CN100396781C

CN100396781C - 利用乳酸菌制备共轭亚油酸的方法

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Publication number: CN100396781C
Application number: CNB2005100614502A
Authority: CN
Inventors: 梁新乐; 钟立人; 张虹
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2005-11-07
Filing date: 2005-11-07
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2025-11-07
Also published as: CN1772911A

Abstract

本发明涉及生物法制备共轭亚油酸的方法，涉及的乳酸菌为具有转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum HSC 235)，CCTCC No.M204051，该菌株在培养液、缓冲液中具有异构化亚油酸结构生成共轭亚油酸的能力。利用该新菌株，或者与丙酸菌(Propionibacterium shermannii)CCIC 10019的联合将亚油酸和含亚油酸的物质转化为共轭亚油酸类物质，转化液中的共轭亚油酸用氯仿提取，转化率可达81%，产率2.1mg/mL。

Description

利用乳酸菌制备共轭亚油酸的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种筛选到的新的微生物菌种，该新的菌种具有转化亚油酸生成共轭亚油酸的能力；本发明还涉及利用该新的微生物制备共轭亚油酸的方法；

(二)背景技术

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，简称CLA)是一系列在碳9、11或10、12位具有双键的亚油酸的位置和几何异构体，大量的科学研究证明，共轭亚油酸具有抗肿瘤、抗氧化、降低动物和人体胆固醇以及甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇、抗动脉粥样硬化、提高免疫力、提高骨骼密度、防治糖尿病等多种重要生理功能。

在1997年以前(养猪2004年第6期P4-6)，共轭亚油酸的合成主要是在实验室中应用亚油酸通过化学方法合成，但这种方法合成的数量和效率都很低，限制了共轭亚油酸在动物生产中的应用。现在世界上已经有很多大型的、专门化的公司能够合成CLA，但这种化工合成的CLA都含有1％～6％的未知不可皂化物，因而限制了其在食品和饲料添加剂中的应用。

亚油酸生物转化为共轭亚油酸的酶主要为亚油酸异构酶。已报道的有下面几属的细菌：嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、丙酸杆菌等。近几年来，已经报道有瘤胃菌、丙酸菌、乳酸菌能将亚油酸转化为共轭亚油酸(食品信息与技术2004年第11期P22)，然而，其CLA产量都比较低。利用生物法生产共轭亚油酸，具有选择性合成生物活性CLA的优点，而且乳酸菌在培养方面比较方便，因此若能得到具有较高转化LA为CLA能力的乳酸菌并将其应用于功能性乳制品，将会有非常大的应用前景。在已报道用生物转化法生产共轭亚油酸的研究中：

东北农业大学的周艳等人研究了共轭亚油酸高产菌株选育及其发酵条件(食品与发酵工业2004年30卷第6期P28-31)，以嗜酸乳酸杆菌PB1(Lactobacillus acidophilus)为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍单独处理和复合处理，获得一株CLA高产菌株U-N-f34，采用的培养基为MRS培养基、12％脱脂乳培养基。通过单因子和正交试验对该菌株生产共轭亚油酸的发酵条件进行了优化，优化的发酵条件是：培养温度43℃，pH值7.5，培养时间48h，在优化条件下，U-N-f34可以生产共轭亚油酸达42.05μg/mL。

江南大学乳酸菌发酵技术与食品安全教育部重点实验室的周凌华等人进行了生物合成共轭亚油酸菌种的筛选与鉴定(无锡轻工大学学报2004年23卷第5期P53-57)，从传统泡菜和生牛乳中筛选出一株乳酸菌ZS2058能生物合成共轭亚油酸，经API系统鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarurn)。该菌株在MRS培养基(pH6.5)中将质量分数11.57％的亚油酸(1.024mg/mL)转化为共轭亚油酸，经气相色谱分析证实c9，t11-18：2占75.9％，t10，c12-18：2占24.1％。其发酵方法：将各菌株以体积分数1％的接种量接入种子培养基，于37℃连续活化2次，每次24h；将活化后的菌种再以体积分数1％接种量接入种子培养基中并添加质量浓度为0.5mg/mL的亚油酸，培养24h，6000r/min离心10min收集菌体，用质量浓度8.5g/L NaCl溶液洗涤，再经离心收集菌体，添加10mL发酵培养基并加入1.024mg/mL的亚油酸，在37℃培养24h条件下，ZS2058可以转化质量分数11.57％的LA为CLA(120.56μg/mL)。发酵液用异丙醇和正己烷提取CLA。

中国农业大学食品科学与营养工程学院的张中义等人进行了产共轭亚油酸乳酸菌的筛选及产物分析(中国农业大学学报2004年9卷第3期P5-8，工业微生物2004年卷34第2期P5-9)，从酸菜汁中筛选出1株CLA生成能力较强的的乳酸菌。发酵液中CLA生成量为267.5μg/mL。此株为革兰氏阳性杆菌，过氧化氢酶阴性，45℃下生长，15℃基本不生长。经API系统和IBIS软件系统对菌种进行鉴定鉴定，基于生化试验和培养基成分的利用情况，鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，置信度为96.1％。微氧条件可提高CLA的产量，催化亚油酸(LA)生成CLA的酶受着LA的诱导。37℃对细胞生长和CLA生成最为有利。对数生长期为6h～12h，18h后进入稳定期。在14h～22h，CLA生成量快速增加，24h时达到最高值。该菌的培养物经萃取、甲酯化后，进行了气相色谱分离，该菌种合成的CLA产物为c9，t11/t9，c11-CLA和t10，c12-CLA的混合物。

Lee等人(Biotechnology Letters，2003，25：935-938)采用Lactobacillusreuterizai在添加0.9g/L LA的MRS培养基中培养24h产生300mg/L CLA，其产生的CLA异构体经鉴定为c9，t11-18：2(包括t9，c11-18：2)(质量分数59％)和c10，t12-18：2(质量分数41％)2种异构体。

Lin(Food Chemistry，2003，83：27-31)从嗜酸乳杆菌CCRC 14079菌株提取异构粗酶，并用于CLA的转化。50-75mg亚油酸分别与25，50，和75mg粗酶反应，条件为50℃，10min，pH5。CLA的转化率达58％。

Pariza(United states Patent，No.5856149，1999.1.)长期喂养亚油酸的实验白鼠杀死后取肠道组织，以50ml磷酸钠缓冲液(0.05M，pH 7.0)浸泡30分钟后，此悬浮物于MRS和马铃薯琼脂培养基上，37℃，厌氧、好氧两种条件下培养，分离出数种菌落，分离出的菌落再次以同样的培养基培养、分离，获得几十种菌株。但经实验证明，只有四株MRS培养基中厌氧条件下培养出的菌株有转化LA成CLA的能力。其中，一株被命名为PYR8的MRS中长出的菌株，具有最高的转化CLA的能力。转化生成的CLA的构象为9c，11t-形式。

PYR8于MRS培养基中，37℃条件下培养一定时间后，离心获取细胞，转入0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.55)中，添加LA贮藏物(15mg/ml1，3-propanediol)后4℃冷室中培养。发现CLA的产量随细胞生物量的增长而增长；细胞内的脂肪酸含量随培养时间的延长而增多，前期培养36小时后获得的细胞产出CLA的量最大。

以诱导36小时获得的细胞转化生产CLA，甲酯化后以GC检测，结果显示：从0分钟开始CLA的产量线性增长，3小时时出现最高峰。在反应进行4小时到24小时之间，CLA的异构体形式有改变，3小时时，9c，11t-CLA占总的CLA的96.23％，此后，9c，11t-CLA的浓度降低而9t，11t-CLA的浓度升高。但是9c，11c-CLA的浓度不变，说明9t，11t-CLA是由9c，11t-CLA转化而来。

Lin等(Food Chemistry，1999，67：1-5嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus，L.delbruechii subsp.bulgaricus等，MRS培养基中37℃条件下培养12小时后，转入12％的脱脂乳培养基中同样条件下培养24小时。取此培养物转入培养基中，添加亚油酸，37℃培养48小时。对培养液中脂肪酸进行提取、检测，发现有相当含量的CLA生成，在亚油酸添加量为1000μg/ml的条件下，CLA的检出量为52.0-94.5μg/ml。

Kishino等(Journal of American Oil Chemistry Society，2002，79：159-163)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum AKU1009a)于添加有亚油酸的MRS培养基中培养并收集菌体，37℃厌氧条件下在含有亚油酸的反应液中反应一定时间。对细胞液中脂肪酸进行提取，甲酯化后检测分析。发现产物中除有9c，11t-CLA和9t，11t-CLA生成外，还有两种中间产物生成。不过此法生产CLA有较高的产量，最高可达1.6mg/ml。

上述报道对采用细菌转化亚油酸生成共轭亚油酸进行初步的研究，主要工作在于一般性的过程描述。本发明的主要区别之处以自行筛选获得的菌株为生产菌株，并涉及转化过程底物的选择性、保护性及提供方式，转化用细菌的高密度诱导培养与转化，以及采用乳酸菌与丙酸菌联合固定化细胞转化生产共轭亚油酸。尚未见有公开报道。

(三)发明内容

本发明的任务是提供一种能有效转化亚油酸为共轭亚油酸的新的微生物菌株；其次是提供一种利用该新的微生物转化反应生成共轭亚油酸的方法。

本发明提供的新的微生物菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum HSC 235)，该菌株是浙江海宁腌制蔬菜中分离筛选得到的，已于2004年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保存号CCTCC No.M 204051。

本发明从浙江海宁腌制蔬菜中分离筛选得到的新的菌株，其细菌学特征如下：

(1)形态：

1)细杆状，直径0.5微米～0.8微米，长1微米～5微米；

2)在培养初始阶段，细胞呈长杆状；

3)运动性：不运动；

4)孢子形成：不形成孢子；

5)革兰氏染色：阳性；

6)耐酸性：阳性。

(2)在各种培养基上生长状态(30℃)：

1)MRS琼脂平板培养基：生长不良，菌落呈圆形，不规则，表面光滑，乳白色；

2)MRS琼脂斜面培养基：生长不良，无光泽，乳白色；

3)MRS液体培养基：生长良好，液体混浊，有沉淀。

(3)生理特征：

1)木糖：+

2)海藻糖：+

3)蔗糖：+

4)山梨醇：+

5)水杨苷：+

6)核糖： +

7)鼠李糖：-

8)棉子糖：+

9)密二糖：+

10)甘露糖：+

11)甘露醇：+

12)麦芽糖：+

13)乳糖：+

14)葡萄糖酸盐：+

15)半乳糖：+

16)果糖：+

17)七叶灵：+

18)纤维二糖：+

19)阿拉伯糖：+

20)苦杏仁苷：+

21)乳酸旋光性：DL

22)接触酶：-

23)产吲哚能力：-

24)分解酪素：-

根据以上细菌学特征，以及此菌株HSC235培养物基于其对底物的利用情况可确定为乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌Lactobacillusplantarum。

用于本发明的新的菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum HSC235)的培养基：

(1)该新的菌株HSC235在MRS培养基上保藏，通常所用的培养基组成含有：碳源(例如葡萄糖、乳糖、乳清)，氮源(如蛋白胨，胰白胨，植物蛋白胨，牛肉膏)，有机营养物质(如酵母抽提物，蛋白胨，胰白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米浆)，无机营养成分(如磷酸盐、镁、钾、锌、铁、钴和锰)，及作为诱导物质的亚油酸，或者含亚油酸的其它物质，或者亚油酸结构类似物等。

(2)培养条件：厌氧培养，pH4.0至7.7，温度20℃至40℃，最好在28℃～37℃，该菌种在含亚油酸、或亚油酸类物质的MRS培养基上厌氧条件下培养1～3天，所得细胞具有转化亚油酸、或亚油酸类物质为共扼亚油酸的能力。

本发明的另一重要特征是利用本发明的新的微生物转化亚油酸生产共轭亚油酸的方法，包括：

(1)配制发酵培养基，各组分中吐温80的含量为1-5ml/L，其余组分的含量为重量体积百分比，即g/L：

胰蛋白胨：8-15

牛肉膏：10

酵母浸出物：5

葡萄糖：20-30

K₂HPO₄：2

无水醋酸钠：5

MgSO₄·7H₂O：0.2

MnSO₄·H₂O：0.05

柠檬酸二铵：2

亚油酸：8-50

(2)将菌株CCTCC No.M 204051接入上述培养基中培养1～2天，培养温度28℃，获得培养液；

(3)将上述培养液，或从上述培养液中分离的细胞(菌体)，或将分离的菌体固定化，加入亚油酸，或富含亚油酸类物质，或亚油酸三酯物质的溶液中进行生物转化反应，反应pH值控制在4.5～7.7；

(4)将上述转化液，用氯仿提取。

用作底物的亚油酸类物质对生物催化剂有很大毒性，因此，亚油酸类物质的加入方式要可控制，既可一次性加入，也可分批次加入，转化液加入的亚油酸类物质不超过50g/L。

转化反应过程中控制一定的pH有利于底物亚油酸的转化，因此最好不断加入氢氧化钠或预先将缓冲液加入该体系中，以控制反应最适pH为4.5～6.5。

亚油酸类物质采用表面活性剂如吐温、甘油进行预处理：亚油酸类物质首先与吐温，或甘油按1∶4的质量比进行混合，并乳化均质。

亚油酸类物质为亚油酸，或富含亚油酸类物质，或亚油酸三酯物质。

富含亚油酸类物质，或亚油酸三酯物质为红花油、葵花籽油。

生物转化反应：

用培养后的培养液，以亚油酸类物质[亚油酸，或富含亚油酸类物质，或亚油酸三酯物质]的溶液为底物，进行生物转化反应，反应液中加入的亚油酸类物质为8g/L～50g/L，反应温度以20℃～40℃，较适范围为28℃～37℃；最适温度在37℃，反应pH范围4.0～7.7，最适pH为4.5～6.5，反应时间24h～72h。反应底物和获得的转化液都采用气相色谱法和紫外分光光度法定性定量分析。

或者，从培养物中分离的细胞(发酵液经4℃冻冻离心，收集菌体)，用磷酸盐制成悬浮液，或用生理盐水制成的悬浮液作为酶源进行生物转化反应，反应条件为：磷酸盐缓冲液pH7.7，反应温度37℃，时间24h。

或者，从培养物中分离的细胞，以海藻酸钠固定法，将上述微生物固定于其中，得稳定颗粒进行生物转化反应。

或者，将菌株CCTCC No.M 204051和丙酸菌株(Propionibacteriumshermannii，CCIC 10019)共同接入上述培养基中，培养1～2天，培养温度28℃，获得培养液；利用培养液、或从上述培养液中分离的细胞(菌体)固定化，加入亚油酸，或者含亚油酸的其它物质，或者亚油酸结构类似物进行生物转化反应，按照1∶50的菌胶比，即湿菌体质量与3％海藻酸钠溶液体积之比，与3％海藻酸钠溶液混合均匀，缓慢将海藻酸钠悬菌液1％CaCl₂溶液，形成2～3mm的固定化细胞颗粒，固定化颗粒在氯化钙溶液中放置10小时，以使固定化颗粒与氯化钙溶液充分反应，使固定化颗粒稳定成型，倒出CaCl₂溶液，加入生理盐水4℃保存待用。

丙酸菌株为商业购买，丙酸菌株，即谢氏丙酸杆菌，Propionibacteriumshermannii，CCIC 10019，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，CICC。

反应产物中共扼亚油酸的提取工艺：加入氯仿和甲醇的混合液(氯仿∶甲醇＝2∶1)，充分混匀，静置，离心取底部氯仿层，真空浓缩，30℃条件下氮气吹干即得。

共扼亚油酸的测定过程，操作过程和实验条件按下列文献：(1)吴冀华，裘爱泳.中国油脂2002，27：65-67；(2)Shigeneobu Kishino，Jun Ogawa.Journal of American Oil Chemistry Society.2002，79：159-163；(3)John AG.Roach M，Mossoba M.Analytica Chimica Acia.2002，465：207-226.)，所得结果与它们完全一致。具体过程如下：

所得产物中加入1M NaOH/CH₃OH溶液，100℃水浴中处理15min，室温下冷却15min后，然后加入4％的HCl/CH₃OH溶液，60℃水浴中甲基化20min。脂肪酸甲酯以正己烷萃取。毛细管色谱(HP6890)条件如下：检测器：FID，柱温：60℃，检测器及进样温度：270℃，载气：氮气，压力：27Kpa，燃气：氢气，流量：30cm/sec，进样体积：1uL，柱子：硅胶毛细管柱60cm×0.22mm(BP×70，SGE，Melboure，Australia)。采取程序升温，60℃时保持5min，然后以13℃/min的升温速率将温度升至170℃，保持此温度55min。柱前压：100kPa；进样口温度：220℃；检测器温度：230℃；空气压力：50kPa；氢气压力：60kPa；氮气压力：400kPa。紫外分光光度法测定采用东芝UV-2800紫外分光光度计(张亚刚，樊莉等.新疆石油学院学报.2002，14：59-64)，以正己烷作为参比在233nm处测定其吸收值。

由此可见，利用本发明的微生物能转化亚油酸制备共扼亚油酸。

本发明具有如下特点：以亚油酸类物质为底物，经细胞高密度诱导培养、乳酸菌和丙酸菌联合固定化细胞可连续使用4批次，转化活性保持在70％，转化率达到81％，产率2.1mg/mL。

(四)附图说明

图1为实施例1产品共轭亚油酸的紫外-可见光光谱扫描图谱(东芝UV-2800紫外/可见分光光度计)；

图2为实施例1产品共轭亚油酸的气相色谱图。

(五)具体实施方案下面实施例旨在举例说明而不是限制本发明的范围。[除特别说明外，实例中所用菌种为本发明提供的新的微生物菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum HSC235)]

实施例1：

(1)培养基配方(以L计量)：胰蛋白胨8g，牛肉膏10g，酵母浸出物5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，K₂HPO₄ 2g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，亚油酸8g，pH6.2，用蒸馏水配制，121℃湿热灭菌20分钟；

(2)制备CCTCC No.M 204051菌株细胞：将CCTCC No.M 204051接入上述含亚油酸的液体培养基中，在28℃条件下振荡培养48小时，将培养液用离心分离法转移并再用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH7.7)洗之，重复操作以制备好的CCTCC No.M 204051菌株细胞；

(3)生物转化反应：亚油酸与表面活性剂吐温按1∶4的质量比进行混合，并乳化均质，制得25％的亚油酸母液；

将上述制得的细胞悬浮于0.05M的磷酸盐缓冲液(pH7.7)，然后分两批加入亚油酸母液，体系中加入的亚油酸量不超过10g/L；同时控制生物转化体系温度37℃。振荡，使之混匀，便于转化，振荡24小时；

(4)提取：加入氯仿提取，在不超过35℃减压浓缩至干。参见图1和图2，经甲酯化用气相色谱法和紫外分光光度法定性定量分析，鉴定为共轭亚油酸。

实施例2：

(1)发酵培养基配方如下(以L计量)：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸出物5g，葡萄糖25g，吐温80 3ml，牛血清2g，K₂HPO₄ 2g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，亚油酸12g，pH 6.2，用蒸馏水配制，121℃湿热灭菌20分钟；

(2)制备CCTCC No.M 204051菌株种子液：经MRS斜面培养基活化的菌种CCTCC No.M204051，接入MRS种子培养基中培养，培养温度37℃，摇床转速120rpm，培养时间1天，获得种子培养液，种子培养液中菌体光密度OD值为2.0；

(3)生物转化反应：亚油酸与表面活性剂甘油按1∶4的质量比进行混合，并乳化均质，制得25％的亚油酸母液；

按上述发酵培养基配方配制10L发酵液于发酵罐中，装液量相当于发酵罐总体积的87％，经灭菌后接入CCTCC No.M 204051种子液，接种量为发酵液的10％，即1L种子液。发酵过程用氢氧化钠调节pH6.0。培养8小时后开始流加葡萄糖(流加速度0.55g/h)，进行高密度培养及亚油酸诱导速度作用(培养基中加有亚油酸即为诱导)，在24小时内加完葡萄糖，温度控制在28℃，培养时间24小时，亚油酸的加入量控制在12g/L；后调整温度至37℃，并流加亚油酸母液使亚油酸总浓度控制在30g/L，继续培养20小时；

(4)提取：然后加入氯仿提取。氯仿层在不超过35℃减压浓缩至干。经甲酯化用气相色谱法和紫外分光光度法定性定量分析，共轭亚油酸转化率53％，产率1.4mg/ml。

实施例3：

(1)发酵培养基配方如下(以L计量)：胰蛋白胨15g，牛肉膏10g，酵母浸出物5g，葡萄糖30g，吐温80 5ml，牛血清2g，K₂HPO₄ 2g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，亚油酸20g，pH 6.2，用蒸馏水配制，121℃湿热灭菌20分钟；

(2)制备CCTCC No.M 204051菌株和丙酸菌(Propionibacteriumshermannii)CCIC 1001菌株联合固定化细胞：将CCTCC No.M 204051和丙酸菌(Propionibacterium shermannii)CCIC 1001菌株一起接入上述含亚油酸的液体培养基中混合培养，在28℃条件下培养30小时后，所得培养液在4℃冻冻离心，收集菌体，用无菌磷酸缓冲液洗涤收集的菌体三次，最后采用海藻酸钠固定化制备乳酸菌细胞和丙酸菌细胞的联合固定化细胞，固定化过程：

按照1∶50的菌胶比，即湿菌体质量与3％海藻酸钠溶液体积之比，与3％海藻酸钠溶液混合均匀，缓慢将海藻酸钠悬菌液1％CaCl₂溶液，形成2～3mm的固定化细胞颗粒，固定化颗粒在氯化钙溶液中放置10小时，以使固定化颗粒与氯化钙溶液充分反应，使固定化颗粒稳定成型，倒出CaCl₂溶液，加入生理盐水4℃保存待用，在MRS培养基中进行转化：固定化细胞的用量15％(g/体积L之比)，pH6.5，30℃，反应时间72h；

流加葡萄糖进行高密度培养(流加速度0.75g/h)，亚油酸进行诱导(亚油酸浓度为20g/L)，温度控制在30℃，时间20小时内加完，经高密度诱导培养所得后的固定化细胞珠经无菌生理盐水深洗涤后，悬浮于MRS培养基中，亚油酸总加入量控制在50g/L，30℃，反应时间72h；

(4)提取：然后加入氯仿提取，氯仿层在不超过35℃减压浓缩至干，经甲酯化后用紫外分光光度法定性定量分析，转化率81％，产率2.1mg/ml。固定化细胞可连续使用4批次，转化活性保持在50％以上。

实施例4：

(1)发酵培养基配方如下(以L计量)：胰蛋白胨15g，牛肉膏10g，酵母浸出物5g，葡萄糖30g，吐温80 5ml，牛血清2g，K₂HPO₄ 2g，无水醋酸钠5g，MgSO₄ ·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，亚油酸15g，pH 6.2，用蒸馏水配制，121℃湿热灭菌20分钟；

(2)制备CCTCC No.M 204051菌株固定化细胞：将CCTCC No.M204051菌株接入上述含亚油酸的液体培养基中，在28℃培养30小时后，所得培养液在4℃冻冻离心，收集菌体，用无菌磷酸缓冲液洗涤收集的菌体三次，最后采用海藻酸钠固定化得到乳酸菌固定化细胞，固定化过程同实施例3；

流加葡萄糖进行高密度培养(流加速度0.45g/h)，亚油酸母液进行诱导(亚油酸浓度为20g/L)，温度控制在28℃，时间20小时，后调整温度至37℃，并分三次流加亚油酸，亚油酸总加入量控制在50g/L，37℃，反应时间24小时；

(4)提取：然后加入氯仿提取，氯仿层在不超过35℃减压浓缩至干，经甲酯化后用紫外分光光度法定性定量分析，转化率57％，产率1.63mg/ml，经高密度诱导培养所得后的固定化细胞可连续使用5批次，转化活性保持在52％。

实施例5：

(1)培养基配方(以L计量)：胰蛋白胨8g，牛肉膏10g，酵母浸出物5g，葡萄糖20g，吐温80 2ml，K₂HPO₄ 2g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，亚油酸12g，pH6.2，用蒸馏水配制，121℃湿热灭菌20分钟；

(2)制备CCTCC No.M 204051菌株细胞：将CCTCC No.M 204051接入上述含亚油酸类物质的液体培养基中，在28℃条件下振荡培养48小时，将培养液用离心分离法转移并再用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH7.7)洗之，重复操作以制备好的CCTCC No.M 204051菌株细胞；

(3)生物转化反应：将上述制得的细胞悬浮于0.05M的磷酸盐缓冲液(pH7.7)，然后加入红花油或菜籽油，同时控制温度37℃，并使体系中红花油，或者菜籽油的加入量为12g/L，反应48小时；

(4)提取：然后加入氯仿提取。在不超过35℃减压浓缩至干，经甲酯化用气相色谱法和紫外分光光度法分析，共轭亚油酸转化率6.3％，产率0.756mg/ml。

Claims

1.一种利用乳酸菌制备共轭亚油酸的方法，其特征是所述的乳酸菌为乳杆菌属Lactobacillus的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum HSC 235，即CCTCC No.M204051，所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarumHSC235在含亚油酸类物质、碳源、氮源、无机盐的培养基中，进行生物转化，提纯得到共轭亚油酸，包括：

(1)配制发酵培养基，以L计量，各组分的含量如下：

胰蛋白胨：8-15g

牛肉膏：10g

酵母浸出物：5g

葡萄糖：20-30g

吐温801-5ml

K₂HPO₄：2g

无水醋酸钠：5g

MgSO₄·7H₂O：0.2g

MnSO₄·H₂O：0.05g

柠檬酸二铵：2g

亚油酸：8-50g

(2)将菌株CCTCC No.M204051，或菌株CCTCC No.M204051和丙酸菌Propionibacterium shermannii CCIC10019一起接入上述培养基中培养24h～48h，培养温度28℃，获得培养液；

(3)利用上述培养液，或利用从上述培养液中分离的细胞，或将从上述培养液中分离的细胞固定化，加入亚油酸类物质的溶液中进行生物转化反应，反应pH值控制在4.5～7.7；

(4)将上述转化液，用氯仿提取。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中，直接利用菌株CCTCC No.M204051和丙酸菌Propionibacterium shermannii CCIC10019的混合培养液，以亚油酸类物质的溶液为底物，进行生物转化反应，反应液中加入的亚油酸类物质为8g/L～50g/L，生物转化反应的条件为：反应温度28℃～37℃，反应pH值4.5～7.7，反应时间24h～72h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中，利用从菌株CCTCC No.M204051和丙酸菌Propionibacterium shermannii CCIC10019的混合培养液中分离的细胞，即培养液经冷冻离心收集的菌体，用磷酸盐制成悬浮液，作为酶源加入亚油酸类物质进行生物转化反应，亚油酸类物质加入量为8g/L～50g/L，反应条件为：磷酸盐缓冲液pH7.7，反应温度37℃，时间24h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中，从上述培养物中分离细胞，即培养液经冷冻离心收集的菌体，以海藻酸钠固定法，将菌体固定于其中，得稳定颗粒，作为酶源进行生物转化反应，固定化过程：按照1∶50的菌胶比，即湿菌体质量与3％海藻酸钠溶液体积之比，与3％海藻酸钠溶液混合均匀，缓慢将海藻酸钠悬菌液1％CaCl₂溶液，形成2～3mm的固定化细胞颗粒，固定化颗粒在氯化钙溶液中放置10小时，以使固定化颗粒与氯化钙溶液充分反应，使固定化颗粒稳定成型，倒出CaCl₂溶液，加入生理盐水4℃保存待用，在MRS培养基中进行转化：固定化细胞的用量一般控制重量g/体积L之比15％，pH6.5；反应条件为：流加葡萄糖进行高密度培养，亚油酸类物质进行诱导，温度控制28～37℃，在时间20小时内加完，经高密度诱导培养所得后的固定化细胞珠经无菌生理盐水深洗涤后，悬浮于MRS培养基中，加入亚油酸类物质，生物转化反应时间72h，总加入量控制在50g/L；

5.根据权利要求2～4之一所述的方法，其特征是亚油酸类物质采用吐温，或甘油进行预处理：亚油酸类物质首先与吐温，或甘油按1∶50质量比进行混合，并乳化均质。

6.根据权利要求2～4之一所述的方法，其特征是亚油酸类物质为亚油酸，或红花油，或葵花籽油，或菜籽油。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征是亚油酸类物质为亚油酸，或红花油，或葵花籽油，或菜籽油。