CN103710401B - 一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法 - Google Patents
一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，该方法包括平板活化培养、种子培养、发酵培养、由菌体提取脂肪与由发酵上清液提取脂肪等步骤。本发明使用吐温-80乳化剂与二价锌离子，控制发酵培养基的初始pH值，采用变温培养模式，能够非常显著地提高了t10，c12-CLA产量，因此，本发明使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。
【背景技术】
共轭亚油酸(Conjugatedlinoleicacid，CLA)即共轭十八碳二烯酸，是一组具有共轭不饱和双键的亚油酸(LA)的位置和结构异构体。CLA的双键在碳链上有多种位置排列方式，每个双键可以以顺式或反式构型存在，其异构体十分丰富。其中cis-9，trans-11-CLA(c9，t11-CLA)、trans-10，cis-12-CLA(t10，c12-CLA)两种异构体是含量最多并且确认具有生理活性功能的共轭亚油酸单体。近30年来，由于CLA具有包括抗癌、抗动脉粥样硬化、免疫系统的调制以及抑制脂肪的积累等对人类健康有益的效果，而被广泛的研究。
因为CLA具有多种独特的生理功能，被誉为“21世纪的新型营养素”，越来越多的引起了世界各国政府及科研工作者的重视，CLA正成为药物、食品、饲料等研究领域的一个热点。由于天然CLA主要存在于反刍动物乳制品中，含量非常低；而通过碱催化异构化等化学方法合成的CLA是多种异构体的混合物，较难分离纯化具有活性功能的异构体；所以，研究生物转化法获得成分单一的功能CLA具有重要的现实意义。
到目前为止，c9，t11-CLA生物合成的最高量是Delacroixiacoronata菌株通过delta-9脱饱和酶作用将t-亚油酸转化成CLA，浓度最高达到10.5mg/ml，其中c9，t11-CLA的纯度高达98％；而t10，c12-CLA生物合成的最高产量是江南大学食品生物技术中心陈卫研究小组构建的重组耶氏解脂酵母菌株(CCFM-JU277-9)，通过添加20g/L的大豆油，在5L发酵罐中发酵38.5h得到CLA的最高产量为4g/L，其中全部为t10，c12-CLA。由于CCFM-JU277-9能够在胞内合成亚油酸异构酶(PAI)，并能够分泌脂肪酶Lip2使培养基中以甘三酯形式存在的LA变为游离的形式进入细胞，作为底物被PAI催化成专一的t10，c12-CLA单体形式，因此提高相关酶活性将有助于t10，c12-CLA产量的提高。CCFM-JU277-9合成t10，c12-CLA的产量仍具有提升空间。
所以本发明希望通过控制发酵过程，确定影响t10，c12-CLA产量的发酵条件，从而实现提高t10，c12-CLA产量的目标。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。
所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：
A、平板活化培养
使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到斜面培养物；
B、种子培养
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；
C、发酵培养
按照以发酵培养基体积计0.5％～2.0％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到pH4.5～8.5的液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20℃-25℃与150～250rpm的条件下震荡培养35-40小时，当重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入生长稳定期，再添加终浓度为30g/L的乳化红花籽油与10mM二价金属离子溶液，该乳化红花籽油含有以所述红花籽油重量计0.1～1.0％乳化剂，接着在温度28-32℃与150～250rpm的条件下震荡培养48～100小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；
所述的菌体使用以重量计0.70～1.00％NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；
D、由菌体提取脂肪
按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12％盐酸-甲醇溶液之比为20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12％盐酸-甲醇溶液在温度45～-65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯；
E、由发酵上清液提取脂肪
按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12％盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的平板固体培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的种子培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至4.5-5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸选自硫酸或盐酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾；所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是2.0～4.0mol/L。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的红花籽油乳化液制备方法如下：
把红花籽油添加到以重量计0.6％乳化剂水溶液中，直到红花籽油的浓度达到150～250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理4～6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的二价金属离子是Zn2+。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乳化剂是吐温-80。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的洗涤菌体在温度-10℃～-30℃与真空度1.0～10.0Pa的条件下进行冻干。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA含量分别是3.0g/L～7.2g/L；在步骤E中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA含量分别是3.7g/L～7.8g/L。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。
所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：
A、平板活化培养
使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到平板培养物。
重组耶氏解脂酵母菌株(Yarrowialipolytica)CCFM-JU277-9已于2013年3月06日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.7284，具体参见CN103233036A。
所述的平板固体培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸水溶液或无机碱水溶液，将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
在这个步骤中，使用的恒温培养箱是目前市场上销售的产品，例如由上海森信实验仪器有限公司以商品名隔水式恒温培养箱销售的产品。
在这个步骤以及后续步骤中，所述的无机酸选自硫酸或盐酸。在本发明中使用的是无机酸水溶液。所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。使用的是无机碱水溶液。所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是2.0-4.0mol/L。
B、种子培养
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；
所述的种子培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
在这个步骤中，所述的种子培养是在培养摇床中进行的，本发明使用的培养摇床是目前市场上销售的产品，例如由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名恒温培养振荡器销售的产品。
C、发酵培养
按照以发酵培养基体积计0.5％～2.0％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到pH4.5～8.5的液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20℃-25℃与150～250rpm的条件下震荡培养35-40小时，当重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入生长稳定期，再添加终浓度为30g/L的乳化红花籽油与10mM二价金属离子溶液，该乳化红花籽油含有以所述红花籽油重量计0.1～1.0％乳化剂，接着在温度28-32℃与150～250rpm的条件下震荡培养48～100小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；
所述的发酵培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至4.5-5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
在这个步骤中，所述的发酵培养是在震荡培养箱中进行的，本发明使用的震荡培养箱是目前市场上销售的产品，例如由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名恒温培养振荡器销售的产品。
本发明人就发酵培养基的初始pH问题进行了研究，结果表明液体发酵培养基的初始pH在4.5～8.5范围内都有利于生物量的合成，优选地是pH为4.5，其t10，c12-CLA的产量最高。
当培养基中含有疏水性物质存在时，耶氏解脂酵母自身能够分泌一种乳化剂，但是分泌的量有限，需要额外添加。
本发明人就乳化剂问题进行了研究，结果表明阳离子型乳化剂(例如十六烷基三甲基溴化铵，CTMAB)效果不佳。阴离子型乳化剂(例如十二烷基磺酸钠，SDS)、非离子型乳化剂(例如吐温-80和曲拉通-100)效果好。优选地是吐温-80。
因此，制备红花籽油乳化液使用非离子型乳化剂吐温-80，其制备方法如下：
把红花籽油添加到以重量计0.6％乳化剂水溶液中，直到红花籽油的浓度达到150～250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理4～6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
所述的乳化剂选自阴离子乳化剂十二烷基磺酸钠(SDS)、阳离子乳化剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)、非离子型乳化剂吐温-80或曲拉通-100。这些乳化剂都是在本技术领域里通常使用的、在目前市场上销售的产品。
在这个步骤中，使用的超声设备是目前市场上销售的产品，例如由美国SONICS公司以商品名超声波细胞粉碎机销售的产品。
在这个步骤中，使用的0.22μm无菌滤膜是目前市场上销售的产品，例如由上海兴亚净化材料厂公司以商品名微孔滤膜销售的产品。
金属离子不仅能够影响细胞的正常代谢活动，对酶的活性也具有很大的影响。为此，本发明人对金属离子的影响也进行了研究。在本发明中，所述的二价金属离子选自Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+或Ca2+金属离子。研究结果表明在稳定期后添加金属离子时，添加Zn2+时t10，c12-CLA产量比不添加金属离子时高得多。
优选地，所述的二价金属离子是Zn2+金属离子。
温度对微生物细胞生长、产物合成及代谢的影响是多方面的，不仅可以改变培养基的性质，而且会影响细胞代谢过程中各种关键酶的活性。为此，本发明人对温度的影响也进行了研究，研究结果表明重组耶氏解脂酵母菌株先在22℃培养温度下生长，进入稳定期后添加红花籽油，调整培养温度为30℃的条件下，t10，c12-CLA产量比恒温培养时高。
所述的菌体使用以重量计0.70～1.00％NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；
NaCl水溶液洗涤的目的在于洗掉菌体细胞表面附着的脂肪酸所述的冻干是让所述的洗涤菌体在温度-10℃～-30℃与真空度1.0～10.0Pa的条件下进行冷冻干燥。
在这个步骤中，进行冻干所使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由美国LABCONCO.公司以商品名冻干机销售的产品。
D、由菌体提取脂肪
按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12％盐酸-甲醇溶液之比为20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12％盐酸-甲醇溶液在温度45～-65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
在本发明中，采用常规气相色谱定量分析方法(参见文献BaixiZhang,ChunchiRongect.Denovosynthesisoftrans-10,cis-12conjugatedlinoleicacidinoleaginousyeastYarrowiaLipolytica.MicrobialCellFactories,2012,11:51))分析了在所述脂肪酸甲酯中的共轭亚油酸t10，c12-CLA含量。
在这个步骤中，所述脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10，c12-CLA的含量分别是3.0g/L～7.2g/L。
E、由发酵上清液提取脂肪
按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12％盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
采用上述常规气相色谱定量分析方法分析，所述脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10，c12-CLA的含量分别是3.7g/L～7.8g/L。
在本发明中，共轭亚油酸t10与c12-CLA得率是共轭亚油酸t10，c12-CLA的含量(g/L)与添加红花籽油量(g/L)的比值。
通过前面描述与实施例可以清楚地知道，采用本发明方法制备的脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10，c12-CLA的含量远高于现有技术所达到的含量。
[有益效果]
本发明的有益效果是：在使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9与红花籽油生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯时，使用吐温-80乳化剂与二价锌离子，控制发酵培养基的初始pH值，控制培养温度，采用变温培养能够非常显著地提高了t10，c12-CLA产量，因此，本发明使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的应用前景。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：使用不同乳化剂制备含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯
该实施例的实施步骤如下：
A、平板活化培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到平板固体培养基。
使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃的条件下平板活化培养4天，得到所述的平板培养物；
B、种子培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养46小时；
C、发酵培养
按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到发酵培养基。
把红花籽油植物油添加到以重量计0.6％乳化剂水溶液中，所述的乳化剂是十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)、吐温-80或曲拉通-100，直到所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理5分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到相应的乳化植物油。
按照以发酵培养基体积计1.0％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与200rpm的条件下震荡培养，在菌株进入稳定期后添加终浓度为30g/L的乳化植物油，震荡培养48小时，得到一种发酵培养物，它在8000rpm的条件下离心分离15分钟，得到菌体与发酵上清液。
所述的菌体使用以重量计0.85％NaCl水溶液洗涤2次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着在温度-20℃与真空度5.0Pa的条件下进行冻干。
D、由菌体提取脂肪
按照以mg计冻干菌体与以ml计10％盐酸-甲醇溶液之比为35：1.0，让步骤C所得到的冻干菌体与10％盐酸-甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化3.0小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取10分钟，接着在6000rpm的条件下离心分离3分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
E、由发酵上清液提取脂肪
按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:10.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液3次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的10％盐酸-甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化1小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取10分钟，接着在6000rpm的条件下离心分离3分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了本实施例制备所得到的脂肪酸甲酯中的t10，c12–CLA含量，其结果列于表1中。
表1：不同乳化剂对CLA产量的影响
a：两次平行试验所得的数据
表1的结果表明，添加阳离子型乳化剂时t10，c12-CLA产量为0.4g/L，远低于对照组的产量，阴离子型乳化剂与非离子型乳化剂的t10，c12-CLA产量远高于对照组的产量，其中吐温-80乳化剂时t10，c12-CLA产量最高。
实施例2：向培养基中添加不同金属离子制备含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯
该实施例的实施步骤如下：
A、平板活化培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到平板固体培养基。
使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃的条件下平板活化培养4天，得到所述的平板培养物；
B、种子培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养40小时；
C、发酵培养
按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到发酵培养基。
把红花籽油植物油添加到以重量计0.6％吐温80水溶液中，直到所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到相应的乳化植物油。
按照以发酵培养基体积计2.0％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与200rpm的条件下震荡培养，在菌株进入稳定期后添加终浓度为30g/L的乳化植物油与10mMCu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+或Ca2+二价金属离子溶液，震荡培养48小时，得到一种发酵培养物，它在8500rpm的条件下离心分离10分钟，得到菌体与发酵上清液。
所述的菌体使用以重量计0.85％NaCl水溶液洗涤2次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着在温度-30℃与真空度1.0Pa的条件下进行冻干。
D、由菌体提取脂肪
按照以mg计冻干菌体与以ml计10％盐酸-甲醇溶液之比为50：0.5，让步骤C所得到的冻干菌体与10％盐酸-甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取15分钟，接着在7000rpm的条件下离心分离2分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
E、由发酵上清液提取脂肪
按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液3次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的10％盐酸-甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取15分钟，接着在7000rpm的条件下离心分离2分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了本实施例制备所得到的脂肪酸甲酯中的t10，c12–CLA含量，其结果列于表2中。
表2：添加二价金属离子对生物量、脂质含量及CLA产量的影响
a：两次平行试验所得的数据
表2的结果表明，添加Cu2+、Fe2+时的CLA生物量远低于对照组的生物量，添加Zn2+时t10，c12-CLA产量达到最高为12.3g/L，添加Mg2+、Ca2+时CLA产量分别为4.8g/L和8.5g/L。添加Zn2+时t10，c12-CLA的产量占总生物量的80％，高于对照组的66.7％。
实施例3：使用不同pH发酵培养基制备含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯
该实施例的实施步骤如下：
A、平板活化培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用3.0mol/L盐酸或氢氧化钾水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到平板固体培养基。
使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20℃的条件下平板活化培养6天，得到所述的平板培养物；
B、种子培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用3.0mol/L盐酸或氢氧化钾水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20℃与150rpm的条件下培养52小时；
C、发酵培养
按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用3.0mol/L盐酸或氢氧化钾水溶液将所得到溶液的pH分别调节至4.5、5.5、6.5、7.5或8.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到发酵培养基。
把红花籽油植物油添加到以重量计0.6％吐温80水溶液中，直到所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到相应的乳化植物油。
按照以发酵培养基体积计1％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与200rpm的条件下震荡培养，在发酵48小时后添加终浓度30g/L乳化红花籽油，震荡培养48小时，得到一种发酵培养物，它在7500rpm的条件下离心分离18分钟，得到菌体与发酵上清液。
所述的菌体使用以重量计0.85％NaCl水溶液洗涤2次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着在温度-10℃与真空度10.0Pa的条件下进行冻干。
D、由菌体提取脂肪
按照以mg计冻干菌体与以ml计10％盐酸-甲醇溶液之比为50：0.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8％盐酸-甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5分钟，接着在5000rpm的条件下离心分离5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
E、由发酵上清液提取脂肪
按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的10％盐酸-甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化1.0小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5分钟，接着在3000rpm的条件下离心分离5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了本实施例制备所得到的脂肪酸甲酯中的t10，c12–CLA含量，其结果列于表4中。
表3：不同pH发酵培养基对生物量、脂质含量及CLA产量的影响
a：两次平行试验所得的数据
表3的结果清楚地表明，随着初始pH的增加生物量逐渐降低，t10，c12-CLA的产量也从10.8g/L降低到7.6g/L。初始pH为4.5时能够利于生物量的合成，进而提高t10，c12-CLA的产量及得率。
实施例4：在不同发酵培养温度的条件下制备含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯
该实施例的实施步骤如下：
A、平板活化培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或3.0mol/L氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到平板固体培养基。
使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃的条件下平板活化培养4天，得到所述的平板培养物；
B、种子培养
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或3.0mol/L氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养46小时；
C、发酵培养
按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或3.0mol/L氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH分别调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到发酵培养基。
把红花籽油添加到以重量计0.6％吐温80水溶液中，直到所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到相应的乳化植物油。
按照以发酵培养基体积计1％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度分别为22℃、25℃、28℃、30℃或34℃与200rpm的条件下震荡培养，在发酵48小时后添加终浓度30g/L乳化红花籽油，震荡培养48小时，得到一种发酵培养物，它在7800rpm的条件下离心分离16分钟，得到菌体与发酵上清液。
所述的菌体使用以重量计0.85％NaCl水溶液洗涤2次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着在温度-20℃与真空度5.0Pa的条件下进行冻干。
D、由菌体提取脂肪
按照以mg计冻干菌体与以ml计10％盐酸-甲醇溶液之比为30：0.8，让步骤C所得到的冻干菌体与10％盐酸-甲醇溶液在温度45℃的条件下进行甲酯化3.0小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取10分钟，接着在6000rpm的条件下离心分离3分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
E、由发酵上清液提取脂肪
按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液3次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的10％盐酸-甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取8分钟，接着在4500rpm的条件下离心分离3分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了本实施例制备所得到的脂肪酸甲酯中的t10，c12–CLA含量，其结果列于表4中。
表4：不同培养温度对CLA产量的影响
a：两次平行试验所得的数据
表4的结果清楚地表明，当培养温度为22℃时，生物量最高达到16.6g/L，此时细胞内t10，c12-CLA产量也达到最高为7.2g/L；随着培养温度的增加，生物量呈现降低趋势，胞内总CLA产量也呈现出降低趋势。当培养温度超过34℃时，不利于重组耶氏解脂酵母的生长。虽然22℃培养重组耶氏解脂酵母t10，c12-CLA的总产量最高达到11g/L，但t10，c12-CLA的总产量与生物量的比值却是在30℃培养时最高达到78％，并随着培养温度的降低比值逐渐降低，说明在温度30℃培养时相关酶的活性高于22℃培养时的酶活。综上所述，t10，c12-CLA产量不仅与生物量有关，也与酶的活性有关。
或者，在发酵步骤C中，按照以发酵培养基体积计1％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度分别为22℃与200rpm的条件下震荡培养，在发酵38小时后添加终浓度30g/L乳化红花籽油，在温度30℃下震荡培养48小时，得到一种发酵培养物，它在7800rpm的条件下离心分离16分钟，得到菌体与发酵上清液。其它操作如前面所述。
采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了所得到脂肪酸甲酯中的t10，c12–CLA含量，其结果列于表5中。
表5：变温培养对CLA产量的影响
a：两次平行试验所得的数据
表5的结果表明，虽然变温培养后生物量为13.6g/L，比在温度22℃下恒温培养时生物量低，但是变温培养后t10，c12-CLA的总产量达到11.6g/L，高于在温度30℃下恒温培养时的总产量(9.5g/L)，其中胞外t10，c12-CLA产量最高达到7.8g/L，高于在温度30℃下恒温培养的胞外产量(6.5g/L)，且单位生物量合成t10，c12-CLA的量(85.3％)高于在温度30℃下恒温培养的量(78.5％)。说明变温培养有利于t10，c12-CLA的总产量及单位生物量合成t10，c12-CLA的量的提高。
Claims (9)
1.一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、平板活化培养
使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20~32℃的条件下平板活化培养2~6天，得到平板培养物；所述菌株的保藏号为CGMCCNo.7284；
B、种子培养
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20~32℃与150~250rpm的条件下培养40~52小时；
C、发酵培养
按照以发酵培养基体积计0.5%~2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到pH4.5~8.5的液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20℃-25℃与150~250rpm的条件下震荡培养35-40小时，当重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入生长稳定期，再添加终浓度为30g/L的乳化红花籽油与10mM二价金属离子溶液，该乳化红花籽油含有以所述红花籽油重量计0.1~1.0%乳化剂，接着在温度28-32℃与150~250rpm的条件下震荡培养48~100小时，得到一种发酵培养物，它在7500~8500rpm的条件下离心分离10~18分钟，得到菌体与发酵上清液；所述二价金属离子为Zn2+；
所述的菌体使用以重量计0.70~1.00%NaCl水溶液洗涤2~3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；
D、由菌体提取脂肪
按照以mg计冻干菌体与以ml计8~12%盐酸-甲醇溶液之比为20~50：0.5~1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8~12%盐酸-甲醇溶液在温度45~-65℃的条件下进行甲酯化2.5~3.5小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5~15分钟，接着在5000~7000rpm的条件下离心分离2~5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1~2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯；
E、由发酵上清液提取脂肪
按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0~12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2~4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8~12%盐酸-甲醇溶液在温度45~65℃的条件下进行甲酯化0.5~3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5~15分钟，接着在3000~7000rpm的条件下离心分离2~5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1~2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的平板固体培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种子培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基制备方法如下：
按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至4.5-5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。
5.根据权利要求2-4中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述的无机酸选自硫酸或盐酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾；所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是2.0~4.0mol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的红花籽油乳化液制备方法如下：
把红花籽油添加到以重量计0.6%乳化剂水溶液中，直到红花籽油的浓度达到150~250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理4~6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于所述的乳化剂是吐温-80。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗涤菌体在温度-10℃~-30℃与真空度1.0~10.0Pa的条件下进行冻干。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤D中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA含量是3.0g/L~7.2g/L；在步骤E中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA含量是3.7g/L~7.8g/L。
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